Die Autoren möchten die Abstammung von Informationen und Mentoring anerkennen, die diese Techniken im Laufe der Jahre beeinflusst/weiterentwickelt hat. Dr. Hamilton-Brehm als ehemaliger Doktorand, Postdoc und derzeitiger Professor schuldet denjenigen, die sich die Zeit genommen haben, anaerobe Techniken zu unterrichten, Dankbarkeit: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser und Dr. Brian Hedlund. Die Nature Conservancy und American Rivers unterstützten diese Arbeit durch die Zuschüsse G21-026-CON-P bzw. AR-CE21GOS373. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Artikel geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der Nature Conservancy oder American Rivers wider. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des SIU Advanced Energy Institute unterstützt, das die vom Advanced Energy Resource Board gewährte Finanzierung dankbar anerkennt. NGS wurde von LC Sciences durchgeführt.

In situ simulierte anaerobe Methode zur Kultivierung von Umweltmikroben

<ol>
	<li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats.">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li><li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes.">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055 (2018).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+biological+&amp;#34;dark+matter&amp;#34;+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth.">Dissecting biological &amp;#34;dark matter&amp;#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community.">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li><li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogens:+Reevaluation+of+a+unique+biological+group.">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li><li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow.">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).</li><li>. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013)</li><li>. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018)</li><li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a~+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer.">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).</li><li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.,+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin.">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.,+an+anaerobic,+extremely+thermophilic,+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.,+a+hyperthermophilic,+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li><li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin.">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Der Abschnitt über die mittlere Produktion dieses Protokolls (Abschnitt 1) verdankt seine Struktur der modifizierten Hungate-Technik von Miller und Wolin17, die seit ihrer Veröffentlichung weit verbreitet ist. Die Praktikabilität dieses erweiterten Protokolls ergibt sich aus seinem beschreibenden Charakter und der Kombination mit der In-situ-Erfassung von Mikroorganismen. Kulturflaschen mit umweltbewussten und simulierten Medien wurden erfolgreich verwendet, um die folgenden in sit...

Die meisten Mikroorganismen bleiben unkultiviert; Dies wird durch die große Ungleichheit zwischen den mikroskopisch beobachteten Zellen im Gegensatz zu den wenigen Mikroorganismen unterstützt, die erfolgreich mit Agarplatten kultiviert wurden. Staley und Konopka nannten diese Diskrepanz die "Great Plate Count Anomaly"1. Die geschätzte unberücksichtigte Diversität wird durch metagenomische und metatranskriptomische Daten gestützt, die zeigen, dass viele neue Gattungen in Rangabundanzkurven aus verschiedenen Umgebungen verteilt sind2. Mikroorganismen, die beobachtet wurden (in der Regel durch zufällige Sequenzierung einer mikrobiellen Gemeinschaft), aber nicht kultiviert wurden, wurden als "mikrobielle dunkle Materie" bezeichnet3,4.
Im Zeitalter der -omics ist die Kultivierung von Mikroorganismen nach wie vor unerlässlich, um genomische Daten vollständig auszuwerten und die Funktion/den Phänotyp der vorhandenen Gene zu überprüfen. Die Sequenzierung kultivierter Mikroorganismen ist immer noch der einzige Weg, um sicher vollständige Genome zu erhalten, bis Technologien wie Schrotflinten-Metagenomik und Metagenom-assemblierte Genome aus der Umwelt zulässig unfehlbar werden5. Genomische Bewertungen in Verbindung mit kultivierten Mikroorganismen liefern starke Schlussfolgerungen für das Verständnis der "mikrobiellen dunklen Materie". Viele Mitglieder der "mikrobiellen Dunklen Materie" erfüllen entscheidende Funktionen, die den Kreislauf von Nährstoffen und anderen Elementen sowie die Produktion wertvoller Naturprodukte beeinflussen, ökologische Systeme unterstützen und ökologische Dienstleistungen erbringen. Aus medizinischer Sicht sind etwa die Hälfte aller derzeit vermarkteten Arzneimittel Produkte und Derivate von Produkten aus Bakterien, und es wird vermutet, dass die Profilierung unkultivierter Spezies die Antibiotika der Zukunft aufzeigt. Um Zugang zu dieser unkultivierten Mehrheit zu erhalten, muss eine Vielzahl von Kultivierungsmethoden erweitert werden6. Unter den Mitgliedern der "mikrobiellen dunklen Materie" werden anaerobe oligotrophe Mikroorganismen weitgehend unterschätzt und verfügen wahrscheinlich über ökologisch und industriell wertvolle biochemische Signalwege7, was sie zu wichtigen Zielen der Kultivierung macht. Anaerobe oligotrophe Mikroorganismen sind jedoch schwieriger zu kultivieren als ihre aeroben und copiotrophen Gegenstücke, da oft längere Inkubationszeiten, anspruchsvolle Bedingungen (z. B. bestimmte nicht standardmäßige In-vitro-Temperaturen ) und die Verwendung spezieller Medienrezepturen erforderlich sind.
Aktuelle Entwicklungstechniken zur Kultivierung von Mitgliedern der "mikrobiellen dunklen Materie", einschließlich neuartiger anaerober oligotropher Mikroorganismen, haben unser Verständnis erheblich verbessert und die Repräsentation dieser Mikroorganismen innerhalb des phylogenetischen Baums erhöht. Aktuelle Techniken, die informierte Medien zur Kultivierung neuartiger Mikroorganismen verwenden (d. h. Medien, die aus dem Wissen über den/die interessierenden Mikroorganismus gewonnen werden), können in drei verschiedene Methoden unterteilt werden. Die erste der Methoden beinhaltet die direkte Entfernung eines diskreten Abschnitts der Umgebung für den Transfer in eine In-vitro-Wachstumskammer, die die interessierenden Mikroorganismen bereits in einer Membran enthält. Der diskrete Abschnitt (z. B. Meerwasser) dient dazu, den interessierenden Mikroorganismen den geochemischen Lebensraum zu bieten, den sie in situ nutzen, während die Membran die Bewegung der Zellen stoppt (die interessierenden Zellen bleiben drinnen; fremde Zellen, die mit dem diskreten Abschnitt angekommen sind, bleiben ohne). Durch die Einbeziehung von Verbindungen, die natürlich verfügbar sind, um Mikroorganismen in ihrem natürlichen Lebensraum zu bekämpfen, können solche Mikroorganismen kultiviert werden8. Die zweite Methode nutzt Metatranskriptomik oder Genomik, um metabolische Fähigkeiten aufzuklären und Hinweise auf enge Kultivierungsparameter für ein gezieltes Mediumdesign zu liefern. Dieser Ansatz liefert ein ökophysiologisches Profil, mit dem die Anreicherung bestimmter Arten von Mikroorganismen aus einer Umgebung gezielt erreicht werden kann. Die Bestimmungen des Mediums sind auf die identifizierten vorhandenen Gene ausgerichtet, von denen angenommen wird, dass sie den/die Zielmikroorganismus(en) unterstützen, um die Anreicherungsvielfalt zu reduzieren,9,10. Ein Vorbehalt ist, dass genomische Informationen nicht direkt auf die Expression von Genen schließen, während transkriptomische Informationen dies tun.
Die dritte Methode umfasst umweltinformierte und simulierte Medien, die sich von der ersten Methode unterscheidet, die die Medien nicht simuliert, sondern die Umwelt direkt als Medienquelle nutzt. Diese dritte Methode erfordert eine Umwelterkundung der Geochemie eines Feldstandorts, der Mikroorganismen von Interesse enthält. Mit diesem Wissen werden Primärkomponenten und physikalische Parameter identifiziert, um ein umweltbewusstes simuliertes Medium herzustellen. Das Medium erhält dann eine direkte Infusion von Mikroorganismen-haltigen Sedimenten oder Flüssigkeiten aus der Umgebung in das Medium. Diese Methode ist von besonderem Wert in Fällen, in denen der kultivierende Mikrobiologe weder Zugang zu ausreichenden Mengen an Quellumgebung (wie für die erste Methode erforderlich) noch zu geeigneten metatranskriptomischen oder genomischen Daten (wie für die zweite Methode erforderlich) hat.
Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für die dritte Methode; Es basiert auf interessanten Umgebungen und zielt darauf ab, diese zu simulieren. Drei naive Medienrezepte, die auf verschiedene im Feld erworbene anaerobe Mikroorganismenkulturen abzielen, werden parallel im Protokoll vorgestellt. Bei den drei vertretenen Kulturen handelt es sich um Mischkulturen, die aus dem Boden stammen (im Folgenden "Bodenmischkultur"), Mischkulturen, die aus einem Bohrloch stammen (im Folgenden "Bohrlochmischkultur") und um ein isoliertes Methanogen, das aus einem Bohrloch stammt (im Folgenden "isoliertes Methanogen" aus dem Bohrloch). Die zusammengesetzten Identitäten und Mengen in den hier geteilten Medienrezepten sind als erster Leitfaden gedacht; Sie können und werden ermutigt, an die Umgebung und die interessierenden Mikroorganismen des Lesers angepasst zu werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L borosillicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with slip tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL culture bottle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mm hand crimper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 31.5 cm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 6 cm length</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corer</td>
			<td>Giddings Machine Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from company parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas manifold</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from many different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for GL45 bottles)</td>
			<td>Glasgeratebau OCHS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for culture bottles)</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace minerals</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor-specific Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 rubber stopper</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 rubber stopper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; hose barb ball valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/16&#34; - 1/4&#34; hose barb adapter fitting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 L borosillicate carboy</td>
			<td>Allen Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balloon</td>
			<td>Party City</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate bioreactor</td>
			<td>Allen Scientific Glass</td>
			<td></td>
			<td>Custom made upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer lock adapter coupler</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL45 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand chain clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 1/4&#34; id, 1/2&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55YG13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 3/16&#34; id, 3/8&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low flow variable flow mini-pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White rubber septum for 13-18 mm od tubes</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>9096-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip tie</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a set of in situ informed simulated medium formats for culturing environmentally acquired anaerobic microorganisms

Die kulturabhängige Erforschung anaerober Mikroorganismen beruht auf Methodenkompetenz. Diese Methoden müssen geeignete Wachstumsbedingungen (z. B. pH-Wert und Kohlenstoffquellen) für anaerobe Mikroorganismen schaffen und aufrechterhalten und gleichzeitig die Entnahme von Proben ermöglichen, ohne die künstliche Umgebung zu beeinträchtigen. Zu diesem Zweck können Methoden, die von einer In-situ-Umgebung geprägt sind und diese simulieren, eine große Hilfe bei der Kultivierung von Mikroorganismen aus dieser Umgebung sein. Hier skizzieren wir eine in situ informierte und simulierte anaerobe Methode zur Kultivierung terrestrischer Oberflächen- und Unterwassermikroorganismen, wobei der Schwerpunkt auf der anaeroben Probenentnahme mit minimaler Störung liegt. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines anpassbaren anaeroben flüssigen Mediums sowie die Aufnahme und das In-vitro-Wachstum von anaeroben Mikroorganismen in die Umwelt. Das Protokoll deckt auch kritische Komponenten eines anaeroben Bioreaktors ab, der für Umweltsimulationen von Sedimenten und anaeroben flüssigen Medien für ökologisch erworbene Kulturen verwendet wird. Wir haben vorläufige Next Generation Sequencing-Daten aus einem erhaltenen Mikrobiom über die Lebensdauer eines Bioreaktors einbezogen, bei dem sich die aktive Kultur als Reaktion auf eine experimentelle Kohlenstoffquelle dynamisch anpasste.

Most microorganisms remain uncultured; this is supported by the great disparity between cells observed through microscopy contrasted by the few microorganisms successfully cultured using agar plates. Staley and Konopka named this disparity the &#34;Great Plate Count Anomaly&#34;1. The estimated unaccounted diversity is supported by metagenomic and metatranscriptomic data showing many novel genera distributed in rank abundance curves from several different environments2. Microorganisms that have been observed (generally by random shotgun sequencing of a microbial community) but have not been cultured have been referred to as &#34;microbial dark matter&#34;3,4.
In the age of -omics, culturing microorganisms remains imperative to fully evaluate genomic data and verify the function/phenotype of genes present. Sequencing cultured microorganisms is still the only way to confidently obtain complete genomes until technologies such as shotgun metagenomics and metagenome-assembled genomes from the environment become admissibly infallible5. Genomic evaluations coupled with cultured microorganisms provide strong inferences for understanding &#34;microbial dark matter.&#34; Many members of the &#34;microbial dark matter&#34; perform crucial functions that impact the cycling of nutrients and other elements and the production of valuable natural products, support ecological systems, and perform ecological services. From the medical perspective, about half of all currently marketed pharmaceuticals are products and derivatives of products from bacteria, and profiling uncultured species is suspected to reveal the antibiotics of the future. To gain access to this uncultured majority, a variety of culturing methodologies must be increased6. Among the members of the &#34;microbial dark matter,&#34; anaerobic oligotrophic microorganisms are largely underreported and likely hold ecologically and industrially valuable biochemical pathways7, making them important targets of culturing. However, anaerobic oligotrophic microorganisms are more difficult to culture than their aerobic and copiotrophic counterparts due to often-required longer incubation times, fastidious conditions (e.g., particular non-standard in vitro temperatures), and the use of specialized media recipes.
Current developing techniques to culture members of the &#34;microbial dark matter,&#34; including novel anaerobic oligotrophic microorganisms, have greatly improved our understanding and increased the representation of these microorganisms within the phylogenetic tree. Current techniques using informed media for culturing novel microorganisms (i.e., media which is derived using knowledge of the microorganism/s of interest) can be separated into three distinct methods. The first of the methods entails the direct removal of a discrete section of the environment for transfer into an in vitro growth chamber that already contains the microorganisms of interest within a membrane. The discrete section (e.g., seawater) acts to provide the microorganisms of interest with the geochemical habitat they use in situ, while the&#160;membrane arrests the movement of cells across (cells of interest will remain within; extraneous cells that arrived with the discrete section will remain without). By including compounds naturally available to target microorganisms in their natural habitat, such microorganisms can be cultured8. The second method utilizes metatranscriptomics or genomics to elucidate metabolic capabilities, providing clues to narrow culturing parameters for a targeted medium design. This approach provides an eco-physiological profile that can be used to target the enrichment of specific types of microorganisms out of an environment. The medium&#39;s provisions are catered to the identified genes present that are presumed to support the targeted microorganism(s) to reduce enrichment diversity,9,10. One caveat is that genomic information does not directly infer the expression of genes, while transcriptomic information does.
The third method encompasses environmentally informed and simulated media, distinct from the first method, which does not simulate the media but rather uses the environment directly as a source of media. This third method requires environmental reconnaissance of the geochemistry of a field site containing microorganisms of interest. With this knowledge, primary components and physical parameters are identified to produce an environmentally informed simulated medium. The medium then receives a direct infusion of microorganism-containing sediment or liquid from the environment into the medium. This method is of particular value in cases where the culturing microbiologist does not have access to sufficient quantities of source environment (as needed for the first method) nor appropriate metatranscriptomic or genomic data (as needed for the second).
The following protocol is an example of the third method; it is informed by and aims to simulate environments of interest. Three na&#239;ve media recipes targeting different anaerobic microorganism cultures acquired in the field are presented in parallel within the protocol. The three cultures represented are mixed cultures originating from soil (hereafter, soil mixed culture), mixed cultures originating from within a borehole (hereafter, borehole mixed culture), and an isolated methanogen originating from within a borehole (hereafter, borehole isolated methanogen). The compound identities and amounts in the media recipes shared here are meant as a beginning guide; they are able and encouraged to be customized to the reader&#39;s environment and microorganisms of interest.

Autor im Rampenlicht: Die Geheimnisse terrestrischer anaerober Mikroorganismen in unerforschten Umgebungen durch In-situ-Kultivierung enträtseln

Eine Reihe von in situ informierten simulierten Medienformaten für die Kultivierung umweltbedingt erworbener anaerober Mikroorganismen

Hier zeigen wir die Ergebnisse einer Bioreaktorstudie unter Verwendung einer Bohrloch-Mischkulturmedium-Aufbereitungsmethode und einer Bioreaktor-Setup-Methode, wie hier beschrieben. Das Bohrloch-Mischkulturmedium wurde so modifiziert, dass es als Kohlenstoffquelle eine Aufschlämmung von Maiskolben enthält, die durch oxidative hydrothermale Auflösung (OHD) verarbeitet wurden13,14. Modifiziertes Bohrloch-Mischkulturmedium wurde 44 Tage lang mit einer Geschwindi...

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Der Schwerpunkt dieses Papiers liegt auf der Beschreibung von Best Practices für die Herstellung von Medien für anspruchsvolle anaerobe Mikroorganismen, die aus einer Umgebung stammen. Diese Methoden helfen bei der Verwaltung anaerober Kulturen und können angewendet werden, um das Wachstum von schwer fassbaren, unkultivierten Mikroorganismen, der "mikrobiellen dunklen Materie", zu unterstützen.

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf terrestrische Mikroorganismen an der Oberfläche und unter der Oberfläche, kultiviert sie und untersucht ihre Genome und Phänotypen. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf Mikroorganismen in Umgebungen, die nicht gut verstanden sind, wie z. B. im tiefen Untergrund und in bestimmten Feuchtgebieten. Die meisten Mikroorganismen, die wir kultivieren, sind anaerob, was bedeutet, dass der Kultivierungsprozess im Allgemeinen mehr Zeit und Aufmerksamkeit erfordert als Prozesse für häufiger verwendete aerobe Mikroorganismen.Wir hoffen, dass die audiovisuelle Präsentation der Herstellung anaerober Medien Forschern, die neu in der Technik sind, helfen wird, sie relativ schnell und einfach zu erlernen. Dieses Mediumpräparat basiert auf der modifizierten Hungate-Technik von Miller und Wolin. Die Kultivierung anspruchsvoller Mikroben ist mühsam und problematisch.Mehr Werkzeuge zu haben, um sie zu züchten, ist für die wissenschaftliche Gemeinschaft sehr willkommen. Die zukünftige Forschung im Allgemeinen wird unserer aktuellen Forschung an wenig untersuchten terrestrischen Mikroorganismen ähneln. Es gibt noch viele neue Mikroben zu entdecken und zu untersuchen.

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Research

JoVE Journal

Environment

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

474 Aufrufe.  Southern Illinois University Carbondale. Unsere Forschung konzentriert sich auf terrestrische Mikroorganismen an der Oberfläche und unter der Oberfläche, kultiviert sie und untersucht ihre Genome und Phänotypen. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf Mikroorganismen in Umgebungen, die nicht gut verstanden sind, wie z. B. im tiefen Untergrund und in bestimmten Feuchtgebieten. Die meisten Mikroorganismen, die wir kultivieren, sind anaerob, was bedeutet, dass der Kultivierungsprozess im Allgemeinen mehr Zeit und Aufmerksamkeit erforde...

Serie: Autor im Rampenlicht: Die Geheimnisse terrestrischer anaerober Mikroorganismen in unerforschten Umgebungen durch In-situ-Kultivierung enträtseln

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth conditions (e.g., pH and carbon sources) for anaerobic microorganisms while also allowing samples to be extracted without compromising the artificial environment. To this end, methods that are informed by and simulate an in situ environment can be of great aid in culturing microorganisms from that environment. Here, we outline an in situ informed and simulated anaerobic method for culturing terrestrial surface and subsurface microorganisms, emphasizing anaerobic sample collection with minimal perturbation. This protocol details the production of a customizable anaerobic liquid medium, and the environmental&#160;acquisition and in vitro growth of anaerobic microorganisms. The protocol also covers critical components of an anaerobic bioreactor used for environmental simulations of sediment and anaerobic liquid media for environmentally acquired cultures. We have included preliminary Next Generation Sequencing data from a maintained microbiome over the lifespan of a bioreactor where the active culture dynamically adjusted in response to an experimental carbon source.

The focus of this paper is to detail best practices for making media for fastidious anaerobic microorganisms acquired from an environment. These methods help manage anaerobic cultures and can be applied to support the growth of elusive uncultured microorganisms, the "microbial dark matter."