Nasze badania koncentrują się na mikroorganizmach lądowych na powierzchni i pod powierzchnią, hodowli ich oraz badaniu ich genomów i fenotypów. Szczególny nacisk kładziony jest na mikroorganizmy i środowiska, które nie są dobrze poznane, takie jak te znajdujące się głęboko pod powierzchnią i na niektórych terenach podmokłych. Większość hodowanych przez nas mikroorganizmów jest beztlenowa, co oznacza, że proces hodowli na ogół wymaga więcej czasu i uwagi niż procesy w przypadku częściej stosowanych mikroorganizmów tlenowych.
Mamy nadzieję, że audiowizualna prezentacja preparatyki beztlenowej pomoże naukowcom dopiero zaczynającym przygodę z tą techniką opanować ją stosunkowo szybko i łatwo. Ten preparat pożywki oparty jest na zmodyfikowanej węgierskiej technice Millera i Rolanda Hodowla wybrednych drobnoustrojów jest żmudna i problematyczna. Posiadanie większej liczby narzędzi do ich uprawy jest bardzo mile widziane w społeczności naukowej.
Ogólnie rzecz biorąc, przyszłe badania będą podobne do naszych obecnych badań nad niedostatecznie zbadanymi mikroorganizmami lądowymi. Wciąż jest wiele nowych mikroorganizmów do odkrycia i zbadania. Aby rozpocząć, odmierz i dodaj wymagane składniki pożywki do litrowej butelki.
Dostosuj pH do interesującej nas kultury mikrobiologicznej i wymieszaj składniki do jednorodności, obracając butelkę. Podgrzej płyn do wrzenia w kuchence mikrofalowej przez pięć do sześciu minut, często otwierając kuchenkę mikrofalową i delikatnie obracając butelką za pomocą żaroodpornej rękawicy. Następnie podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 mililitrów do zestawu kolektora azotu gazowego.
Otwórz kolektor, aby odprowadzić tlen i pozwól na wypłynięcie azotu. Umieść końcówkę pipety w cieczy i wyreguluj przepływ gazu tak, aby pęcherzyki były umiarkowanie energiczne. Przepłucz płyn azotem, aż butelka przestanie być zbyt gorąca, aby ją dotknąć.
Czekając, aż butelka ostygnie, ustaw 10 sterylnych 100-mililitrowych butelek do hodowli. Gdy butelka z pożywką osiągnie znośne ciepło, pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad butelką. Dodaj 0,125 grama wodorowęglanu sodu i 0,3 grama bezwodnego siarczku sodu i poczekaj, aż rezazuryna stanie się bezbarwna.
Czekając, aż resazurin zmieni kolor, przymocuj metalowe kaniule do zestawu kolektora gazowego. Dostosuj przepływ azotu do umiarkowanej szybkości i umieść końcówki kaniuli w butelkach hodowlanych. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, wlej 50 mililitrów płynu do każdej butelki hodowlanej.
Zakręć każdą butelkę gumowym korkiem o podobnym rozmiarze natychmiast po wyjęciu kaniuli. Następnie zabezpiecz korek aluminiową uszczelką. Umieść butelki w pojemniku na autoklawo i napełnij pojemnik wodą z kranu, aż poziom wody będzie odpowiadał poziomowi w butelkach.
Autoklaw butelek w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować zestaw gąsiora, otwórz zawór 6.4-centymetrowej kuli węża. Przymocuj dwucentymetrowe odcinki silikonowej rurki na obu końcach zaworu kulowego pręta węża.
Przymocuj złączkę adaptera pręta węża o średnicy od 7.9 do 6.4 milimetra do jednego końca zespołu. Przymocuj drugi koniec zespołu do króćca węża ośmiolitrowego balonu. Użyj opaski zaciskowej, aby zabezpieczyć połączenie między króćcem węża gąża gąsiora a rurką oraz połączenie między złączką adaptera węża a rurką.
Odmierz i dodaj wymagane składniki pożywki do ośmiolitrowego balonu. Po dostosowaniu wymaganego pH wymieszaj składniki do jednorodności, mieszając na gorącej płycie i pozwól płynowi wrzeć przez 30 minut. Następnie podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 mililitrów do kolektora azotu gazowego.
Otwórz kolektor, aby odprowadzić tlen i pozwól na wypłynięcie azotu. Po wyłączeniu ognia umieść końcówkę pipety w płynie i płucz ją azotem gazowym przez 30 minut, umiarkowanie energicznie, ale nie przelewając. Następnie pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad gąsiorem.
Dodaj dwa gramy wodorowęglanu sodu i 4,8 grama bezwodnego siarczku sodu i poczekaj, aż rezazuryna stanie się bezbarwna. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, wyjmij szklaną pipetę i natychmiast zakryj gąsień korkiem o rozmiarze 10. Owinąć drut nad korkiem i wokół krawędzi gąsiora, aby zabezpieczyć korek.
Aby uzyskać mieszaną kulturę gleby beztlenowej, należy wsunąć narzędzie do rdzeniowania w osad polowy, aż górna część cylindra do pobierania próbek zostanie zrównana z powierzchnią osadu. Przekręć rdzeń pod kątem 90 stopni, aby uwolnić rdzeń i pociągnij w górę, aż próbka zostanie pobrana z otoczenia. W przypadku luźnych osadów przykryj podstawę rdzenia nową ręką w rękawicy nitro, aby zapobiec wypadnięciu próbki lub rozprzestrzenieniu się do wody podczas ekstrakcji.
Szybko przybliż na oko, sześć do siedmiu centymetrów w górę od podstawy rdzenia i pokrój go, aby oddzielić spód. Natychmiast przenieś dno rdzenia do butelki hodowlanej, minimalizując w jak największym stopniu narażenie na atmosferę tlenową. Po przeniesieniu natychmiast zmień położenie korka i przytrzymaj go na miejscu za pomocą nakrętki.
Utrzymuj próbkę w chłodnym miejscu i wstaw butelkę do lodówki w temperaturze 4 stopni Celsjusza po powrocie do laboratorium. Na początek należy przygotować korek i sterylną butelkę z azotem oraz butelki z kulturami i butelkę do pobierania próbek. Wlej 100% etanol na korki i podpal je za pomocą zapalniczki.
Gdy korki przestaną się palić, włóż jednomililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 23 do butelki z azotem i pobierz około jednego mililitra azotu. Wyciągnąć igłę i powoli nacisnąć tłok, aby uwolnić azot. Natychmiast włóż igłę do butelki do pobierania próbki i pobierz 0,5 mililitra próbki środowiskowej.
Pobrać próbkę do butelki hodowlanej zawierającej pożywkę. Delikatnie zakręć butelką i umieść ją w inkubatorze o żądanej temperaturze. Bezpośrednia liczba komórek przed inokulacją była często poniżej granicy wykrywalności.
Po inokulacji liczba komórek wzrosła o ponad 10 milionów komórek na mililitr w dniach 30, 37 i 44. Chociaż liczba komórek była poniżej granicy wykrywalności przed dodaniem inokulum, NGS wskazał na podstawową obecność mikroorganizmów preinokulum w osadzie, a główny rodzaj geobacillus był stabilny w dniach 8, 15 i 22. Po inokulacji inokulum BLM-1 w 23 dniu, geobacillus przestał dominować i powstały nowe główne rodzaje wraz z wieloma mniej obecnymi rodzajami.
