Esta investigación ha sido financiada por los proyectos europeos GRACIOUS (GA760840) y SUNSHINE (GA952924). Los autores también quieren reconocer los esfuerzos de todos aquellos que, de alguna manera, ayudaron a desarrollar este protocolo.

NOTA: El siguiente protocolo ha sido diseñado con la capacidad de ser utilizado junto con un ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) y un ensayo de adenilato quinasa (AK) para normalizar las muestras a los tratamientos. Asegúrese de que el operador use la vestimenta adecuada y el equipo de seguridad necesario, como una bata de laboratorio Howie, guantes de nitrilo y gafas de seguridad de clase I, durante la preparación y el uso de los materiales. El protocolo se divide en varias etapas.
1. Preparación de existencias y soluciones de trabajo
<ol><li>Prepare soluciones madre de 100 mM GSH estándar en 1 mM de HCl (preparadas a partir de 37% de HCl en agua bidestilada (ddH2O)). NOTA: Si diluye a partir de ácido altamente concentrado, como HCl al 37%, asegúrese de que el proceso correcto de adición de ácido al agua en una campana extractora de clase I.</li>
	<li>Prepare un stock de 22,35 mM de OPA en etanol absoluto. Realice este paso en una campana extractora de clase I. Prepare 25 mM de N-etilmaleimida (NEM) en ddH2O. Realice este paso en una campana extractora de clase I. NOTA: Estas tres soluciones pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
	<li>Prepare 0,01 M de Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a un volumen total de 500 μL, necesario para 100 pocillos. Prepare 100 μL de 1 mM de patrón GSH, diluido a partir de 100 mM de caldo utilizando ddH2O.</li>
	<li>Utilice tampón de lisis de inmunoprecipitación (IP) o la siguiente formulación: 394 mg de Tris-HCl (concentración final de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentración final de 150 mM), 29 mg de EDTA (concentración final de 1 mM), 1 mL de NP-40 al 100% o IGEPAL CA-630 (concentración final de 1% V/V), 5 mL de glicerol (concentración final de 5% V/V), 84 mL de ddH2O. Mezcle los componentes agitando suavemente y ajuste el pH a 7,4. Decantar en un matraz aforado de 100 mL y añadir el volumen restante de ddH2O hasta alcanzar un volumen final de 100 mL. Filtre estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm y almacene a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses. NOTA: Las soluciones de lisación actúan como contaminantes/interferentes en este ensayo; Por lo tanto, se especifican las formulaciones anteriores.</li>
	<li>Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato 0,1 M suplementada con ácido etilendiaminotetraacético (PBS-EDTA) a 3 valores de pH diferentes, concretamente 7,2, 8,5 y 9,0. Utilice un tampón comercial de 0,1 M de PBS suplementado con 1 mM de EDTA (292,24 mg/L) o la siguiente formulación de 10x (1 L): 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 800 mL de ddH2O. Añadir y mezclar; rellene hasta 1 L. Esterilizar en autoclave la solución para la esterilidad y almacenarla durante 12 meses a temperatura ambiente. A partir de la solución madre 10x, haga una solución de trabajo de PBS y compleméntela con EDTA (concentración como se indicó anteriormente). NOTA: El pH es de vital importancia; asegúrese de que el pH sea preciso antes de comenzar el protocolo.</li>
	<li>Realice una dilución en serie 1:2 de 1 mM de GSH utilizando ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM y 7,8125 μM). Añadir 10 μL de cada concentración a los pocillos estándar (realizado por duplicado). Las muestras se diluirán aún más en tampón de lisis; por lo tanto, las concentraciones serán 1/5 de su concentración original después (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM). NOTA: Las concentraciones finales para la calibración serán 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm y 234,4 nm.</li>
</ol>2. Preparación del ensayo
NOTA: Este protocolo utiliza las líneas celulares humanas HepG2, A549 y J774, que se compraron comercialmente a ATCC. Estas líneas celulares se utilizaron bajo las pautas aprobadas descritas por las leyes y regulaciones de cultivo de animales y tejidos de la Universidad.
<ol><li>A las 24 horas anteriores al inicio del ensayo, las células de siembra en las concentraciones indicadas en la Tabla 1; Sin embargo, dependiendo de la línea celular/tipo y tratamiento utilizado, ajuste la densidad según sea necesario. Cultive células en un medio de crecimiento completo (medio esencial modificado Eagles (EMEM) con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (HIFS), 1% de Penstrep (10,000 U/mL de penicilina/10 mg/mL de estreptomicina) y 1 % de aminoácidos no esenciales.</li>
	<li>Células de siembra utilizando métodos convencionales de siembra celular32. Células de semilla en placas completamente negras si no se utiliza microscopía posterior al ensayo. Evalúe la confluencia y el estado general de las células en el matraz T75 antes de usarlo mediante microscopía.</li>
	<li>En una cabina de seguridad biológica limpia, estéril y de clase II y siguiendo una estricta técnica aséptica, deseche los medios celulares, lave suavemente las células con ~ 15 ml de PBS estéril a temperatura ambiente (RT) y deséchelo.</li>
	<li>Al matraz de células, agregue 5 mL de tripsina estéril 1x, balancee suavemente para asegurar la cobertura de la monocapa celular y colóquelo en una incubadora a 37 °C durante 5 min para facilitar el desprendimiento de las células.</li>
	<li>Detener la tripsinización mediante la adición de un medio de crecimiento que contenga suero de ternero fetal inactivado por calor (10%), aproximadamente 10 mL.</li>
	<li>Transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mL y granule a 200 x g durante 5 min. Deseche el medio y reemplácelo con 5 ml del mismo medio. Vuelva a suspender las células en el tubo hasta que estén homogéneas y no se puedan observar aglomeraciones.</li>
	<li>Retire 20 μL de suspensión celular y colóquelos en un hemocitómetro para el recuento. Una vez que se haya calculado el número de celdas requeridas, realice una dilución para hacer una solución con la densidad celular correcta.</li>
	<li>Medios de pipeta que contienen celdas en placas de 96 pocillos (350 μL de capacidad), con un volumen máximo de 200 μL por pocillo. Coloque las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h para que se adhieran a la superficie de la placa.</li>
	<li>Para evaluar tanto el glutatión total como el GSSG, trate las muestras para ambas afecciones. Siembre y trate 6 pocillos para proporcionar 2 juegos de GSH y GSSG con 3 repeticiones técnicas (la Figura 1 muestra el diseño).</li>
	<li>Asegúrese de que todos los reactivos estén debidamente preparados antes del comienzo del ensayo; asegúrese de que todos los componentes y reactivos del tampón estén en RT antes de comenzar la construcción de tampones o su uso en el ensayo, con la excepción de pH 7,4 PBS (sin EDTA), que debe mantenerse en hielo/refrigerado hasta su uso. NOTA: Es de vital importancia que la formación de burbujas se limite al mínimo para permitir que ocurran las reacciones deseadas dentro del ensayo y permitir una cuantificación precisa a través del lector de placas.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Línea celular</td>
			<td>Densidad de siembra (placa de 96 pocillos)</td>
		</tr><tr><td>HepG2</td>
			<td>10.000 células/pocillo</td>
		</tr><tr><td>A549</td>
			<td>5.000 celdas / pozo</td>
		</tr><tr><td>J774</td>
			<td>10.000 células/pocillo</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Densidades de siembra sugeridas para las líneas celulares elegidas. Se demuestran diferentes densidades de siembra para tres líneas celulares diferentes utilizadas en los datos representados, específicamente A549, J774 y HepG2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig01.jpg"> Figura 1: Diseño propuesto para la siembra de placas de 96 pocillos para la determinación simultánea de glutatión total y disulfuro de glutatión. También se muestran pozos para calibración y controles. Los pozos que no se utilizan se representan con una cruz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Tratamiento de nanomateriales
<ol><li>Pesa nanomateriales (específicamente ZnO, TiO2, CuO y Ag) en una báscula con capacidad de μg. Realizar un cálculo para alcanzar una concentración inicial de 1 mg/mL por nanomaterial.</li>
	<li>Transfiera las soluciones de nanomateriales a un sonicador y sonique durante 16 minutos utilizando un baño de sonicación (38 W) para producir una solución homogénea. Realizar una serie de diluciones para cada nanomaterial a 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL.</li>
	<li>Retire las células de la incubadora y lávelas ligeramente con RT PBS. Después de asegurarse de que se ha eliminado todo el PBS, agregue 100 μL de tratamientos a la placa, con controles (medios de cultivo sin HIFS). Después de aplicar el tratamiento a las células, incubar con los nanomateriales en una incubadora a 37 °C (5% CO2) durante 4 h; A continuación, utilice el siguiente protocolo para cuantificar GSH: GSSG, concentración de proteínas y liberación de AK.</li>
</ol>4. Protocolo de ensayo
<ol><li>Después de la exposición al tratamiento (Figura 2A), evaluar la viabilidad a través de la actividad de la adenilato quinasa (AK) (opcional). Utilice un kit comercial para este ensayo siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Centrifugar las placas en una centrífuga a 200 x g durante 5 min para tratar ligeramente los pellets y los restos celulares (Figura 2B).</li>
	<li>Retire suavemente 20 μL de sobrenadante de medio de cada pocillo de muestra y control (como se especificó anteriormente) y pipetee en una placa blanca adyacente de 96 pocillos en el mismo formato de diseño (Figura 2C).</li>
	<li>Añada 100 μL de solución de trabajo del kit AK a cada pocillo, proteja la placa de la luz y deje actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Registre la luminiscencia utilizando un lector de placas a 1000 cuentas/s.</li>
	<li>Para los estándares de GSH, agregue 40 μL de tampón de glutatión total a cada pocillo (Figura 2D; opcional, requerido para la cuantificación).</li>
	<li>Aspire el medio restante de la placa y lave 3 veces con PBS 0.1 M helado, pH 7.2, desechando cada lavado (Figura 2E) con la excepción de los estándares. Deje el lavado final en la placa hasta que la calibración GSH se haya cargado en la placa.</li>
	<li>Añadir 10 μL de cada concentración de glutatión y blanco (ddH2O) en los pocillos por triplicado.</li>
	<li>Retire el lavado final de PBS y agregue las mezclas a cada pocillo según la Tabla 2 para la cuantificación objetivo deseada (Figura 2E). Calcule los volúmenes necesarios antes de comenzar este paso debido a la pérdida de actividad urgente con búferes completos. Asegúrese de preparar estas mezclas de reactivos antes de comenzar el proceso de ensayo, pero no permita que se asienten durante más de 30 minutos antes de su uso.</li>
	<li>Colóquelo en un agitador de placas orbital y deje que la placa se agite a 300 RPM durante 2 minutos (Figura 2F).</li>
	<li>Retirar del agitador y añadir 5 μL de solución de TCEP 0,01M a cada pocillo, excluyendo el pocillo de control NEM. Regrese la placa al agitador e incube durante 10 minutos (Figura 2F).</li>
	<li>Transfiera la placa a la centrífuga y centrifuga a 200 x g durante 5 min. Transfiera 25 μL de cada pocillo de muestra a otra placa de 96 pocillos (transparente); Esto se utilizará para la concentración de proteínas (ver Paso 4.15 ; Figura 2G). No transfiera patrones ni controles de ensayo.</li>
	<li>Asegúrese de que el volumen final de cada pocillo sea de 30 μL; eliminar el volumen de los controles y estándares para cumplir con este requisito (Figura 2H).</li>
	<li>Agregue 170 μL de solución de OPA funcional a cada pocillo, proteja la placa de la luz y colóquela en el agitador durante 15 minutos (Figura 2I).</li>
	<li>Lea la fluorescencia usando un lector de placas en Ex340/EM450 (Figura 2J). Asegúrese de que no haya burbujas durante la etapa de medición; Tendrán un impacto perjudicial tanto en la reacción como en la cuantificación a través del lector de placas.</li>
	<li>Para cuantificar el contenido de proteínas de las células lisadas, utilice un kit de ensayo comercial de BCA. Transfiera las muestras tomadas del paso 4.12 a una nueva placa de 96 pocillos (transparente) a 25 μL por pocillo.</li>
	<li>Utilice un patrón de albúmina sérica bovina (BSA) diluido en tampón de lisis IP y añádalo a la placa por triplicado a 25 μL por pocillo. Las concentraciones exactas se definen en el protocolo del kit BCA.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo que consista en una proporción de 50:1 de los reactivos A y B del kit de BCA y agregue 200 μL a cada pocillo que contenga la muestra, el patrón y el control. Proteja las placas de la luz e incube a 37 °C durante 30 minutos (Figura 2K).</li>
	<li>Retire las muestras de la incubadora, deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lea la absorbancia a través del lector de placas a 562 nm (Figura 2L).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Concentración total de glutatión Mezcla de reactivos de lisis</td>
		</tr><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lisis</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>Volumen total / pozo</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Mezcla de reactivos de lisis con concentración de glutatión oxidado</td>
		</tr><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lisis</td>
			<td>49,5 μL</td>
		</tr><tr><td>NEM (25mM)</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr><tr><td>Volumen total / pozo</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">USE AMBAS SOLUCIONES DENTRO DE LOS 30 MINUTOS POSTERIORES A LA COMPOSICIÓN DE LA MEZCLA</td>
		</tr><tr><td>Componente de la solución de detección OPA</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>OPA 3 mg/mL</td>
			<td>5μL</td>
		</tr><tr><td>PBS (pH 9.0)</td>
			<td>165 μL</td>
		</tr><tr><td>Volumen total / pozo</td>
			<td>170 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Volúmenes necesarios de reactivos para la realización del protocolo. Volúmenes requeridos por pocillo para la determinación de glutatión total, disulfuro de glutatión y reactivo de trabajo requeridos. Asegúrese de que se calculan los volúmenes necesarios y de que se incluya un exceso para tener en cuenta la pérdida de volumen a través de la transferencia.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig02.jpg"> Figura 2: Representación esquemática del protocolo. (A) Siembra inicial, incubación y tratamiento de las células. (B) Centrifugación para separar los medios de los sólidos en suspensión. (C) Transferencia de medios para el ensayo de adenilato quinasa. (D) Adición de concentraciones de glutatión para el rango de calibración. (E) Etapas de lavado y adición de reactivos de lisación. (F) Adición de tampón y adición de fosfina tris (2-carboxietilo) con paso de agitación. (G) Centrifugación de células lisadas para la eliminación de medios para el análisis de proteínas. (H) Eliminación de medios para igualar el volumen a través de la placa. (I) Adición de solución de trabajo de ortoftalaldehído con incubación por agitación. (J) Medición de la fluorescencia del ortoftalaldehído mediante lector de placas. (K) Etapas de incubación para el ensayo de ácido bicinconínico para la determinación de proteínas. (L) Medición de la concentración de proteínas, permitiendo la normalización del glutatión: valores de disulfuro de glutatión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Medición de GSH/GSSG: un ensayo de OPA refinado para la investigación de antioxidantes

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Como se ha señalado, la necesidad de comprender el redox celular, monitorear los estados de estrés oxidativo y la respuesta antioxidante siempre ha sido crucial para comprender y prevenir una gran cantidad de enfermedades, como el cáncer y la neurodegeneración33,34. Aquí se demuestra un medio para mejorar el panorama traslacional al aumentar la accesibilidad de la detección precisa de GSH: GSSG con una preparación rápida y mínima.
Este protocolo demuestra una secuencia multiparamétrica de ensayos para la determinación de especies intracelulares de glutatión/tiol (reducidas y oxidadas), con 2 medios de normalización mediante ensayo de proteína BCA y/o ensayo AK. Este ensayo también se puede modificar para detectar otros marcadores a través del paso inicial de extracción del mediador y se puede simplificar de una manera que simplemente dará una relación de tiol oxidado / reducido con la exclusión del rango de calibración.
Al considerar la evaluación de los analitos, se exploraron y compararon tanto el mBCI como el OPA para su uso. Si bien el mBCl demostró inicialmente un buen potencial de señal, se descubrieron limitaciones significativas en su uso. Principalmente, el uso de células vivas demuestra el mejor uso de mBCl; sin embargo, después de la lisis celular, se encontró que la señal se apaga y generalmente disminuye en un formato de pocillos múltiples en comparación con OPA35. Otro problema es la medición de GSSG a través de mBCl, la literatura es escasa al respecto, y a través de la optimización/exploración del protocolo, no se logró una detección precisa de GSSG a través de mBCl.
Hemos demostrado que el ensayo OPA presenta rangos de calibración significativamente fiables, con un promedio de R2 de 0,9932 ± 0,007 (N = 12) en un rango de concentración de 0,234 a 30 μM de GSH. Este rango fue elegido debido a los rangos de referencia previos encontrados en la literatura35. Es teóricamente posible detectar glutatión fuera de estos rangos, pero requerirá modificaciones en la concentración de reactivos, el tiempo de incubación y, potencialmente, el equipo utilizado en la detección. Hay que tener en cuenta que cada placa requiere su propio rango estándar para la cuantificación; La más mínima variación en el tiempo entre placas realizada en diferentes días puede tener un efecto significativo en los valores obtenidos durante la medición.
Lograr datos precisos y confiables de este protocolo depende de que se cumplan estrictamente varios pasos cruciales. Al construir los diversos tampones requeridos en el protocolo, es crucial que el pH sea preciso. Por lo tanto, los tampones que requieren un pH de 9 no deben tener ninguna desviación más allá de ± 0,1 de este valor. Esto se debe a la posibilidad de que los componentes tampón precipiten fuera de la solución con un pH incorrecto; Seguir este protocolo exactamente evitará este problema.
La eliminación completa del tratamiento y el lavado preciso antes de la lisis también son fundamentales para evitar artefactos y la adquisición de datos inexactos durante la etapa de lectura de la placa. Una vez que se han lisado las células (paso 4.8), no es posible retirar el tratamiento y la placa no se podrá salvar. Debido a que los volúmenes de tampones/reactivos que se añaden a lo largo del protocolo varían entre muestras y estándares, es fundamental que el usuario sea consciente de los volúmenes variados, en los pasos 4.12 y 4.13. El operador del ensayo también es consciente de estos volúmenes variados y se le indica que se asegure de que todos los volúmenes sean iguales para permitir que se logre una medición precisa. Como los volúmenes entre las muestras y los patrones no son visiblemente significativos, puede ser un error fácil de cometer con respecto a tener un exceso de solución en el pocillo de muestra.
Existen limitaciones para este protocolo que dependen de pasos cruciales, que son críticos para adquirir datos precisos y confiables. Los usuarios que realizan este ensayo deben poseer un nivel razonable de habilidades de laboratorio para evitar problemas no deseados, como la formación de burbujas. La formación de burbujas tiene un impacto drástico tanto en la capacidad de reacción dentro de la microplaca como en la medición de la fluorescencia. El agente lisante utilizado en este protocolo contiene un detergente, lo que presenta dificultades para un investigador novato que puede tener dificultades para prevenir la formación de burbujas. La centrifugación inmediata puede salvar este error. El protocolo también es potencialmente limitado en cuanto al tipo de célula; Se utilizaron las líneas celulares A549, J774 y HepG2 para optimizar y producir datos para este protocolo. Otras líneas celulares pueden requerir diferentes densidades de siembra y optimización del protocolo para obtener datos precisos.
Este protocolo ofrece numerosas ventajas sobre varios ensayos existentes. Si bien la detección de tioles mediante ftalaldehído no es un concepto nuevo, la utilización en un formato de ensayo combinado como este, en una microplaca, con materiales y equipos requeridos limitados, ofrece un gran potencial para que todos los laboratorios accedan a este protocolo. La mayoría de los kits de tiol/GSH de proveedores comerciales no revelan la composición de sus reactivos. Por lo tanto, puede ser difícil prever el potencial de incompatibilidades/interferencias. Aquí, presentamos cada componente de todos los reactivos utilizados para limitar ese potencial.
Este protocolo también se realiza con bastante rapidez al finalizar el período de tratamiento inicial. Teniendo en cuenta el procesamiento del usuario entre las etapas de incubación, el aspecto de cuantificación de tiol de este protocolo se puede realizar en menos de 1 h. Las muestras se lisan y unen simultáneamente para evitar la autooxidación de las muestras, lo cual es óptimo para estas especies de reacción. Si bien no se especifica en el protocolo, las muestras técnicamente se pueden lisar en una placa y sellar, lo que permite congelarlas para análisis futuros. Sin embargo, esta modificación del protocolo no ha sido explorada.

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un inductor primario del estrés oxidativo; El estrés oxidativo ha sido bien establecido en la generación de mutaciones en el ADN, envejecimiento/muerte celular, varios tipos de cáncer, diabetes, enfermedades neurológicas (como Parkinson y Alzheimer) y varias otras condiciones debilitantes de la vida 1,2,3,4,5. Una defensa clave contra las ROS son los antioxidantes tiólicos, no enzimáticos, que son capaces de reducir los oxidantes o radicales al actuar como donantes de protones 6,7. El glutatión (GSH) y la cisteína son los dos tioles más prevalentes encontrados en los mamíferos8, mientras que existen otros tioles de bajo peso molecular (como la ergotioneína), el GSH y la cisteína son los antioxidantes no enzimáticos más comúnmente medidos que se encuentran en la literatura 9,10,11 y tienen la mayor relevancia para combatir las ROS 8,12,13,14.
Cuando el GSH se utiliza como antioxidante, dos moléculas de GSH se unen covalentemente a través de un enlace disulfuro para producir disulfuro de glutatión (GSSG). El agotamiento de GSH se utiliza a menudo como indicador de estrés oxidativo15,16. Esta evaluación también puede combinarse con la detección de GSSG, aunque los aumentos de GSSG en las células a menudo están limitados por procesos activos de exportación, ya que GSSG puede ser relativamente reactivo en las células, lo que conduce a la formación de enlaces disulfuro con otros tioles proteicos16.
Los métodos tradicionales para medir GSH y GSSG no son procesos simples y requieren numerosos pasos, incluida la extracción celular con reactivos líticos17,18. El protocolo descrito aquí simplifica estos métodos y permite la medición precisa de tioles no enzimáticos y la normalización utilizando el contenido de proteínas celulares o la liberación de adenilato quinasa. Además, es posible medir la viabilidad celular antes de la extracción de GSH/GSSG. Varios métodos han intentado previamente identificar y cuantificar tioles no enzimáticos reducidos y oxidados de manera eficiente; métodos que incluyen el uso de HPLC 19,20,21, ensayo en placa (bioquímico)22,23,24,25, y que utilizan reactivos comunes para la conjugación de tiol, como el 5,5-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB/ reactivo de Ellman)19, monoclorobimana (mBCI)26,27,28 . Varias empresas también han preparado kits patentados para la detección de glutatión; sin embargo, no publican incompatibilidades de reactivos, lo que presenta problemas dependientes de los tratamientos utilizados29.
Este protocolo describe un ensayo multiparamétrico que detecta tioles reducidos (como GSH) a través de la conjugación de ortoftalaldehído (OPA) para producir una señal fluorescente detectable a 340/450 Ex/Em, respectivamente. Este ensayo facilita la detección de GSH y GSSG simultáneamente (en placa), mediante el uso de agentes enmascarantes (N-etilmaleimida) y agentes reductores de GSSG (tris(2-carboxietil) fosfina). Este protocolo de biomarcadores múltiples también brinda la oportunidad durante la etapa de lisis celular de cuantificar proteínas a través de un ensayo de ácido bicinconínico para la normalización de muestras al finalizar la medición final o mediante un ensayo de adenilato quinasa desde el medio celular. Este ensayo se puede realizar utilizando varios reactivos disponibles en la mayoría de los laboratorios y solo requiere unos pocos productos químicos poco comunes adicionales para realizarlo. El proceso es sencillo, accesible y se puede realizar sin etapas laboriosas en menos de 2 h.
En este protocolo, se eligieron varios nanomateriales que habían demostrado previamente que inducían ROS o que se sospechaba que inducían estrés oxidativo30,31. Se exploró un rango de concentración para ver los efectos de la exposición a estos nanomateriales en varias líneas celulares y la eficacia del ensayo en la cuantificación de tioles antioxidantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m filter (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12561259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mL volumetric flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15290866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Volumetric flask&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15230876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL beaker (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15409083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel micropipette (20-200&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>FA10011D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel micropipette (2-20&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - black with clear bottom, TC treated</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10000631</td>
			<td>Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - clear (TC treated and untreated)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10141161</td>
			<td>If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - white, Not TC treated</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11457009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 (lung carcinoma) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>1.08543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11779408</td>
			<td>For protecting plates from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione (GSH)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione disulfide (GSSG)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>258148</td>
			<td>Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL&#160;CA-630&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>18896</td>
			<td>Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP lysis buffer&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11825135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 (monocyte, macrophage) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (20-200&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (2-20&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, 10M</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>72068</td>
			<td>For pH adjustment only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide (NEM)&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>492016</td>
			<td>Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho -Phthaldialdehyde (OPA)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 0.1M</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P2272</td>
			<td>PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (with fluoresence capacity)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>SPARK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16265731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toxilight bioassay kit (AK assay)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT17-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M&#160; in H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H51864</td>
			<td>Can also be purchased crystalised and suspended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X100 phosphatase and protease cocktail&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10025743</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid quantification of oxidized and reduced forms of glutathione using ortho -phthalaldehyde in cultured mammalian cells in vitro

El glutatión se ha considerado durante mucho tiempo un biomarcador clave para determinar la respuesta antioxidante de la célula. Por lo tanto, es un marcador primario para los estudios de especies reactivas de oxígeno. El método utiliza ortoftalaldehído (OPA) para cuantificar la concentración celular de glutatión(es). El OPA se conjuga con glutatión (GSH) reducido a través de la unión al sulfhidrilo para formar posteriormente un isoindol, lo que da como resultado un conjugado altamente fluorescente. Para lograr un resultado preciso tanto del glutatión oxidado (GSSG) como del GSH, se requiere una combinación de agentes enmascarantes y agentes reductores, que se han implementado en este protocolo. Los tratamientos también pueden afectar la viabilidad celular. Por lo tanto, la normalización a través del ensayo de proteínas se presenta en este ensayo multiparamétrico. El ensayo demuestra un rango de detección pseudolineal de 0,234 a 30 μM (R2 = 0,9932±0,007 (N = 12)) específico para GSH. El ensayo propuesto también permite la determinación de glutatión oxidado con la adición del agente enmascarante N-etilmaleimida para unirse al glutatión reducido, y se introduce el agente reductor tris(2-carboxietil) fosfina para escindir el enlace disulfuro en GSSG para producir dos moléculas de GSH. El ensayo se utiliza en combinación con un ensayo de ácido bicinconínico validado para la cuantificación de proteínas y un ensayo de adenilato quinasa para la evaluación de la citotoxicidad.

Reactive oxygen species (ROS) are a primary inducer of oxidative stress; oxidative stress has been well established in the generation of DNA mutations, cellular aging/ death, various cancers, diabetes, neurological diseases (such as Parkinson&#39;s and Alzheimers), and several other life-debilitating conditions1,2,3,4,5. A key defense against ROS are thiolic, non-enzymatic antioxidants, which are capable of reducing oxidants or radicals by acting as proton donors6,7. Glutathione (GSH) and cysteine are the two most prevalent thiols found in mammals8, while various other low molecular weight thiols exist (such as ergothioneine), GSH and cysteine are the most commonly measured non-enzymatic antioxidants found in literature9,10,11 and hold greatest relevance for combatting ROS8,12,13,14.
When GSH is utilized as an antioxidant, two molecules of GSH are covalently linked together via a disulfide bond to make glutathione disulfide (GSSG). Depletion of GSH is often used as an indicator of oxidative stress15,16. This assessment can also be combined with the detection of GSSG, although increases in GSSG in cells are often limited by active export processes since GSSG can be relatively reactive in cells, leading to disulfide bond formation with other protein thiols16.
Traditional methods for measuring GSH and GSSG are not simple processes and require numerous steps, including cellular extraction using lytic reagents17,18. The protocol outlined here simplifies these methods and allows the accurate measurement of non-enzymatic thiols and normalization using the cellular protein content or adenylate kinase release. In addition, it is possible to measure cellular viability prior to GSH/GSSG extraction. Several methods have previously attempted to target and quantify reduced and oxidized non-enzymatic thiols efficiently; methods including the use of HPLC19,20,21, plate assay (biochemical)22,23,24,25, and which use common reagents for thiol conjugation, such as 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB/ Ellman&#39;s reagent)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Several companies have also prepared proprietary kits for the detection of glutathione; however, they do not publish reagent incompatibilities, which presents issues dependent on the treatments used29.
This protocol outlines a multiparametric assay that detects reduced thiols (such as GSH) via ortho-phthalaldehyde (OPA) conjugation to produce a fluorescent signal detectable at 340/450 Ex/Em, respectively. This assay facilitates the detection of both GSH and GSSG simultaneously (in plate), through the use of masking agents (N-ethylmaleimide) and GSSG reducing agents (tris(2-carboxyethyl) phosphine). This multi-biomarker protocol also provides an opportunity during the cellular lysing stage to quantify proteins via bicinchoninic acid assay for the normalization of samples on completion of the final measurement or via an adenylate kinase assay from the cell media. This assay can be performed utilizing several reagents readily available in most laboratories and only requires a few additional uncommon chemicals to perform. The process is simple, accessible, and can be performed without laborious stages in less than 2 h.
In this protocol, various nanomaterials were chosen that were either previously shown to induce ROS or suspected to induce oxidative stress30,31. A concentration range was explored to see the effects of exposure of these nanomaterials on various cell lines and the effectiveness of the assay in quantifying antioxidant thiols.

Autor destacado: Innovación en la cuantificación de tioles y la detección de biomarcadores para la investigación del estrés oxidativo 

Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

We aim to offer a novel means to quantify thiol concentration with a specific focus on the GSH and GSSG concentrations of the various cell lines that can be performed in situ. We consider this a useful protocol for the scientific community. Numerous efforts have been made to detect niche and specific biomarkers of interest of reactive oxygen species, and several have found great interest in detecting short-lived reactive oxygen species, such as radical detection and small molecules such as hydroxyls and singlet oxygen.One key challenge for several institutions has been the ability to accurately and specifically detect biomarkers of interest without the need of expensive equipment or laborious processes. This protocol allows for multiparametric analysis, allowing for normalization of data without the need for separate protocols, and remove several stages found in other assays that are highly time consumptive, present incompatible reagents, or use reagents hazardous to health. The Nanomaterial Safety Group will continue to assess various nanomaterials and polymers for the effect they may have on human health.We consider this protocol an essential part of our toolkit in achieving this goal as this protocol can potentially be multiplexed to detect additional biomarkers.

Siguiendo este protocolo, las líneas celulares A549 y J774 se sembraron a densidades de 5.000 células/pocillo y 10.000 células/pocillo, respectivamente, y se cultivaron a 37 °C en 5% de CO2 durante 48 h. El análisis de AK después del tratamiento con nanomateriales se muestra en la Tabla Suplementaria 1, y la concentración de proteínas se muestra en la Tabla Suplementaria 2.
Gráfico de calibración En la Figura 3 se muestran tres calibraciones utilizando el rango de concentración indicado (concentración final de 0,234 a 30 μM) de tres placas separadas de tres tipos de celdas diferentes (aunque no deben afectar la calibración) en tres días diferentes no consecutivos. Si bien se muestran 3 muestras, se observó un N de 12 y se demostraron regresiones lineales similares con un valor promedio de R2 de 0.9932 ± 0.007.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig03.jpg"> Figura 3: Gráficos de calibración de glutatión para el ensayo. Tres gráficos de calibración de rangos de calibración de glutatión en placa separados, cada uno realizado con una semana de diferencia; barras de error ± SD (n=3, N=12) n=réplicas técnicas, N=réplicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Resultados de la muestra Las células HepG2, A549 y J774 se utilizaron en la evaluación de varios nanomateriales sospechosos de inducir cambios en los mecanismos celulares a través del estrés oxidativo. Se utilizó el protocolo de detección y cuantificación descrito.
Los datos recibidos de las 3 mediciones (AK, BCA y GSH/GSSG) se manejaron de la siguiente manera. Se implementó el ensayo AK y BCA para la normalización; el ensayo de AK, utilizando el kit recomendado, proporcionará los datos más rápidos y sencillos de la cantidad de AK liberada en el medio celular. Se espera un aumento en los valores de AK para aumentar la muerte celular. Por lo tanto, se requiere un control -ve (Alive) y +ve (Dead). Esto permitirá la normalización basada en porcentajes.
El ensayo BCA es un proceso más largo, pero permitirá obtener resultados cuantificables a través de la cuantificación de proteínas (mg/mL). Esto no requiere un control -ve o +ve como en el AK, pero aún requerirá un control -ve general (celdas no tratadas) para permitir que se logre la normalización de los valores.
En esta sección de resultados representativos, se encontró que el tratamiento (nanomateriales) tenía el potencial de causar interferencia con el ensayo de AK. Por lo tanto, toda la normalización se realizó utilizando los datos de BCA. Por lo tanto, la información se presenta como la concentración de las especies detectadas (GSH o GSH+GSSG (sin embargo, se realiza una resta de la concentración total de GSH + GSSG para obtener la concentración de GSSG) por mg/mL de proteína (mediante ensayo BCA). Si se desea, esto se puede convertir en una proporción para evaluar el cambio en GSH: GSSG con respecto al tratamiento deseado.
En la Figura 4 se muestran los datos de la relación GSH:GSSG de tres líneas celulares diferentes (A549, J774 y HepG2) adquiridos mediante el protocolo OPA y normalizados a la expresión de proteínas a través de BCA (μg/mL), se pueden encontrar más datos que especifican valores adicionales de GSH y GSSG en la Figura complementaria 1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig04.jpg"> Figura 4: Glutatión: Relación de disulfuro de glutatión de la realización del ensayo. Se muestran las proporciones de glutatión: disulfuro de glutatión de 3 líneas celulares, a saber, (A) A549, (B) J774 y (C) HepG2. Las células se incubaron con tratamientos (diversos nanomateriales en medios libres de suero) durante 4 h. Las células se procesaron utilizando este protocolo para cuantificar los cambios en el glutatión y el disulfuro de glutatión y se normalizaron mediante cuantificación de proteínas, barras de error ± SE (n = 3, N = 3) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La placa también contiene una serie de controles para garantizar que el ensayo se haya realizado correctamente. NEM se agrega como un componente individual para demostrar una falta de interacción con los medios de detección de OPA. El estándar de calibración demuestra un aumento lineal con la concentración de GSH, lo que demuestra la capacidad efectiva del reactivo de detección de OPA para unirse de manera efectiva a concentraciones crecientes de GSH.
Debe tenerse en cuenta que este ensayo se dirige específicamente a los grupos sulfhidrilo libres que se encuentran comúnmente en los tioles (como el GSH, que comúnmente se consideran antioxidantes). Una posible interacción es la unión de OPA a los tioles de las proteínas, lo que daría lugar a una recopilación de datos inexacta. Por lo tanto, el ensayo BCA es una etapa crucial para normalizar los datos a proteínas y permitir una reflexión precisa de GSH libre.
Figura complementaria 1: Figuras que demuestran glutatión, disulfuro de glutatión y glutatión: proporción de disulfuro de glutatión de 3 líneas celulares, a saber, (A) A549, (B) J774 y (C) HepG2. Las células se incubaron con tratamientos (diversos nanomateriales en medios libres de suero) durante 4 h. Las células se procesaron utilizando este protocolo para cuantificar los cambios en el glutatión y el disulfuro de glutatión y se normalizaron mediante cuantificación de proteínas, barras de error ± SE (n = 3, N = 3) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplemetary%20Figure%201_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Metadatos de los valores de adenilato quinasa para las células A549 y J774. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%201_AK%20values_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Cuadro complementario 2: Metadatos de los valores de ácido bicinconínico con calibración para las células A549, J774 y HepG2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%202_BCA%20values_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La cuantificación de las formas oxidadas y reducidas de glutatión (GSSG y GSH, respectivamente) se ha logrado mediante el uso de ortoftalaldehído (OPA). El OPA se vuelve altamente fluorescente una vez que se conjuga con GSH, pero no puede conjugar el GSSG hasta que se reduce. Aquí, describimos un ensayo multiparamétrico para cuantificar ambos utilizando la cuantificación de proteínas para la normalización.

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive ...

Nuestro objetivo es ofrecer un medio novedoso para cuantificar la concentración de tiol con un enfoque específico en las concentraciones de GSH y GSSG de las diversas líneas celulares que se pueden realizar in situ. Consideramos que este es un protocolo útil para la comunidad científica. Se han realizado numerosos esfuerzos para detectar biomarcadores específicos y de nicho de interés de las especies reactivas de oxígeno, y varios han encontrado un gran interés en la detección de especies reactivas de oxígeno de vida corta, como la detección de radicales y moléculas pequeñas como los hidroxilos y el oxígeno singlete.Un desafío clave para varias instituciones ha sido la capacidad de detectar de manera precisa y específica biomarcadores de interés sin la necesidad de equipos costosos o procesos laboriosos. Este protocolo permite el análisis multiparamétrico, lo que permite la normalización de los datos sin necesidad de protocolos separados, y elimina varias etapas que se encuentran en otros ensayos que consumen mucho tiempo, presentan reactivos incompatibles o utilizan reactivos peligrosos para la salud. El Grupo de Seguridad de Nanomateriales continuará evaluando diversos nanomateriales y polímeros por el efecto que pueden tener en la salud humana.Consideramos que este protocolo es una parte esencial de nuestro conjunto de herramientas para lograr este objetivo, ya que este protocolo puede multiplexarse potencialmente para detectar biomarcadores adicionales.

rapid-quantification-oxidized-reduced-forms-glutathione-using-ortho

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid Quantification of Oxidized and Reduced Forms of Glutathione Using Ortho -phthalaldehyde in Cultured Mammalian Cells In Vitro

694 vistas.  Teesside University. Nuestro objetivo es ofrecer un medio novedoso para cuantificar la concentración de tiol con un enfoque específico en las concentraciones de GSH y GSSG de las diversas líneas celulares que se pueden realizar in situ. Consideramos que este es un protocolo útil para la comunidad científica. Se han realizado numerosos esfuerzos para detectar biomarcadores específicos y de nicho de interés de las especies reactivas de oxígeno, y varios han encontrado un gran interés en la detección de es...

Video: Autor destacado: Innovación en la cuantificación de tioles y la detección de biomarcadores para la investigación del estrés oxidativo 

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive oxygen species studies. The method utilizes Ortho-phthalaldehyde (OPA) to quantify the cellular concentration of glutathione(s). OPA conjugates with reduced glutathione (GSH) via sulfhydryl binding to subsequently form an isoindole, resulting in a highly fluorescent conjugate. To attain an accurate result of both oxidized glutathione (GSSG) and GSH, a combination of masking agents and reducing agents, which have been implemented in this protocol, are required. Treatments may also impact cellular viability. Hence, normalization via protein assay is presented in this multiparametric assay. The assay demonstrates a pseudo-linear detection range of 0.234 - 30&#181;M (R2=0.9932&#177;0.007 (N=12)) specific to GSH. The proposed assay also allows for the determination of oxidized glutathione with the addition of the masking agent N-ethylmaleimide to bind reduced glutathione, and the reducing agent tris(2-carboxyethyl) phosphine is introduced to cleave the disulfide bond in GSSG to produce two molecules of GSH. The assay is used in combination with a validated bicinchoninic acid assay for protein quantification and an adenylate kinase assay for cytotoxicity assessment.

Quantification of both oxidized and reduced forms of glutathione (GSSG and GSH, respectively) has been achieved through the use of Ortho-phthalaldehyde (OPA). OPA becomes highly fluorescent once conjugated to GSH but is unable to conjugate GSSG until reduced. Here, we describe a multiparametric assay to quantify both using protein quantification for normalization.