Introducción.Los hepatocitos primarios son una herramienta importante para los estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, la expansión y el mantenimiento de estas células han sido históricamente un desafío, ya que pierden morfología y funcionalidad después de unos días en cultivo. Los organoides 3D son una herramienta de última generación capaz de recapitular tejidos en una placa para un cultivo a largo plazo, superando el problema de la imposibilidad de expandirse a los hepatocitos primarios in vitro.
El objetivo general del presente trabajo es describir en un protocolo exhaustivo, detallado y consecuente, los pasos cruciales de la perfusión hepática de rata y el aislamiento primario de hepatocitos, con el fin de permitir a los investigadores acelerar y optimizar el cultivo de organoides en 3D, baño de agua tibia a 42 grados Celsius, y luego colocar tampón de perfusión y PBS un par en el baño de agua durante 20 minutos. Colocar los hepatocitos primarios en medio completo y PBS, adicionados con 3% de estreptococos en hielo. Prepare la bomba peristáltica y conecte el tubo con la botella de vidrio y la trampa de burbujas, ambas llenas de tampón de perfusión.
Llene el tubo con tampón de perfusión tibio para eliminar las burbujas de aire y lavar el etanol residual. Anestesió a la rata adulta mediante inyección intraperitoneal de mezcla anestésica. Afeitar el abdomen y limpiarlo con etanol al 70% para reducir la contaminación bacteriana durante la cirugía.
Coloque la rata en el centro de la bandeja de disección y asegure las extremidades con agujas. Haz una incisión en forma de U a través de la piel y el músculo, desde el centro de la parte inferior del abdomen hasta la caja torácica. Pinza la piel y la dobla hasta la cabeza, dejando al descubierto los intestinos.
Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del animal, fuera de la cavidad abdominal, y exponga la vena porta hepática y la vena cava. Con unos alicates, pasa una sutura por debajo de la vena porta y prepara dos nudos, un centímetro, uno del otro, que rodeen la propia vena. Inyecte de 100 a 150 unidades de heparina disuelta en PBS en la cubierta venosa para prevenir la coagulación de la sangre.
Encienda la bomba con una velocidad baja. Inserte el angiocath de calibre 18 en la vena porta, al nivel de la rosca en un ángulo plano con respecto a la vena. Retire la aguja interna para dejar la cánula en la vena.
Conéctelo al extremo de la toma de corriente mediante un conector Luer Lock. Cierre el nudo y estabilice el tubo en la posición correcta. A continuación, corta la vena cava para dejar salir la sangre.
El hígado debería comenzar a hincharse y blanquearse rápidamente en dos o tres segundos. Esto confirma que el tampón de perfusión está fluyendo a través del hígado. Aumente lentamente la velocidad de la bomba a 10 mililitros por minuto y manténgala al menos 10 minutos para permitir la limpieza del hígado de sangre.
Durante la perfusión, aplique presión con un hisopo sobre la vena cava durante intervalos de 10 segundos. El hígado debe hincharse durante el pinzamiento y relajarse al liberarse la vena, lo que lleva a una mayor disociación celular. Repita la presión periódicamente.
Después de la perfusión, cambie la solución de perfusión a la solución de digestión precalentada sin interrumpir el flujo y evitando cualquier burbuja de aire en el tubo. Aumente la velocidad de la bomba a 20 mililitros por minuto y continúe presionando periódicamente con un hisopo para la hinchazón y relajación del hígado. Después del tampón para la digestión, el hígado debe verse blando.
En este punto, se puede retirar la aguja y detener la bomba. Para la disección del hígado, agarre suavemente el tejido conectivo central, entre los lóbulos, con pinzas. Corta toda la conexión con otros órganos y levanta el hígado.
Lave el hígado, simplemente sumergiéndolo en el PBS preenfriado, más la solución de estreptococo al 3% durante unos segundos. Luego colóquelo en el tubo de contención de medio William's preenfriado. Bajo el capó biológico, transfiera el hígado a la placa de Petri con 15 mililitros fríos del medio completo de William, sobre una bandeja llena de hielo.
Agite el tejido vigorosamente con el raspador para liberar las células en el medio. Si la digestión hepática se ejecuta correctamente, la liberación debería ser fácil. Recoja el medio que contiene células y fíltrelo con el filtro mientras lo transfiere en un tubo Falcon estéril.
Vierta unos 15 mililitros de medio completo frío de William, sobre el hígado triturado en la placa de Petri para ayudar a liberar más células y repita la filtración. Al final de la fase de liberación, el medio filtrante debe volverse opaco después de liberar las células hepáticas. El hígado restante debe verse fibroso y se desecharía.
Centrifugar el medio filtrado que contiene células hepáticas con ruptura a baja velocidad. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 40 mililitros de medio completo William's helado, luego repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y luego vuelva a suspender la paleta de celdas en 25 mililitros helados del medio completo de William, agregue 25 mililitros, solución de Percoll al 90% en el tubo y mezcle suavemente.
Se debe obtener una paleta visible en la parte inferior del tubo correspondiente a los hepatocitos viables, y la capa en la parte superior del gradiente compuesta por hepatocitos muertos. Aspire la capa de células muertas desde la parte superior del gradiente y deje uno, dos mililitros de medio con un pellet. Vuelva a suspender el pellet en 30, 40 mililitros de medio.
Centrifugar a 200 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, luego aspirar el sobrenadante. Agregue una cantidad adecuada de medio para el conteo. Cuente la viabilidad de las células con uno a 10 azul de tripano.
Para el cultivo en 2D, los hepatocitos primarios se sembraron a una concentración de 500.000 células por pocillo de seis pocillos múltiples en placas celulares recubiertas de colágeno con medio completo de William precalentado y se colocaron en la incubadora. Después de tres o cuatro horas, el medio se cambió a un nuevo medio completo precalentado de William. Para el cultivo de hepatocitos en 3D, los hepatocitos primarios se suspendieron en matriz pura fría de Geltrex a una concentración de 1.000 células en 20 microlitros de Geltrex.
La placa se volteó y se dejó en la incubadora durante 20 a 30 minutos para permitir la solidificación de la matriz. A continuación, se giró la placa y se añadió un medio de cultivo específico para 3D. El medio se cambiaba cada dos o tres días.
Resultados representativos. Al final de los procedimientos de configuración, obtuvimos un rendimiento de células de hasta una por 10 a las ocho células por aislamiento del hígado de aproximadamente 300 gramos de rata. La viabilidad celular entre el 78% y el 97% se ha establecido mediante azul de tripano, contando después del gradiente de densidad de Percoll.
A las cuatro horas después de la siembra, los hepatocitos mostraron una morfología cuboidal. El primer día, los hepatocitos primarios adquirieron su forma hexagonal típica y las gotas de lípidos comienzan a ser visibles. En el segundo o tercer día, las gotas de lípidos aumentan, mientras que en el cuarto o quinto día, las células acumulan fibras de estrés de actina.
Ya en los primeros días de cultivo se produjo una drástica reducción de la viabilidad, alcanzando el 49,5% el primer día. Eso se reduce al 33,5% el tercer día y alcanza el 9,1% el quinto día. En el día cero de la siembra de organoides hepáticos, estamos midiendo 30 micrómetros.
En el segundo día de cultivo, los organoides hepáticos casi duplicaron sus dimensiones, lo que subraya el crecimiento de tamaño que se mantiene también en el quinto día. La forma del organoide hepático el primer día fue redonda, mientras que mostraron la forma del racimo de uva el segundo día. El día 15 se observó una actividad proliferativa de los hepatocitos, células verdes, aunque la incorporación de EdU fue baja, 9%Conclusión.
Los organoides 3D se consideran una frontera para la medicina personalizada y permiten un cultivo de hepatocitos a largo plazo. En comparación con los hepatocitos 2D, los organoides hepáticos seguían siendo viables y estaban en proliferación activa a los 15 días, lo que demuestra un potencial a largo plazo. La calidad de la técnica 3D de última generación requiere un buen rendimiento de hepatocitos viables y una perfusión y aislamiento hepático bien realizados.
Aclaramos los pasos que podrían parecer más críticos en el aislamiento primario de hepatocitos de rata, y resumimos las pistas dispersas que pueden afectar fácilmente el éxito de la técnica en el modelo de rata.
