Aquí, demostramos nuestro protocolo de aislamiento primario de células sinusoidales hepáticas de ratón o aislamiento de LSEC. El protocolo consiste en perfusión de colagenasa hepática y ultracentrifugación de baja velocidad para la purificación de células no parenquimatosas y selección de perlas magnéticas CD146. Nuestro método de aislamiento LSEC es altamente eficiente y aplicable al hígado de ratón sano y enfermo.
Los LSEC aislados muestran una alta pureza y preservan la estructura y la función. Los LSEC aislados utilizando este protocolo son óptimos para estudios funcionales y moleculares y generación de datos multiómicos. Este protocolo será útil para estudiar la comunicación intercelular en el hígado.
Comience por cubrir los platos de cultivo de 10 centímetros con tres mililitros de solución de colágeno. Luego, incuba los platos a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, retire el exceso de líquido de la superficie recubierta.
Lave los platos con PBS tres veces y deje que se sequen al aire. Configure el aparato de perfusión de recirculación calentado y humidificado. Enjuague el sistema de perfusión con lejía al 10% durante cinco minutos.
Luego, enjuague el sistema nuevamente con agua estéril durante otros 10 minutos. Escurra el líquido de enjuague tanto como sea posible antes de perfundir con solución de colagenasa. Infundir la solución de colagenasa a través del sistema de perfusión para precalentarla a 37 grados centígrados.
Ajuste la velocidad de la bomba a la velocidad uno en el dial de control de velocidad. Mantenga la velocidad igual durante todo el procedimiento. Pesa el ratón para el procedimiento.
Luego asegúrelo a la superficie quirúrgica. Rocíe el abdomen del ratón con 70% de etanol. Usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión de aproximadamente cinco centímetros a partir de la parte inferior del abdomen hasta el proceso xifoide.
Después de eso, haga dos cortes laterales usando pequeñas tijeras de iris a cada lado del abdomen para exponer los órganos abdominales por completo. Coloque la vaina del catéter intravenoso debajo de la espalda del animal para levantar y nivelar el abdomen. Usando un apósito curvo regular, tire suavemente de los intestinos y el estómago hacia la izquierda del animal.
Luego, coloque una sutura quirúrgica 5-0 debajo de la vena cava inferior, o IVC, justo debajo del riñón izquierdo expuesto. Ata un enganche suelto en la sutura. A continuación, coloque otra sutura quirúrgica 5-0 alrededor de la vena porta hepática.
Coloque la sutura justo encima del punto de ramificación de la vena esplénica de la vena porta hepática. Una vez más, ate un enganche suelto en la sutura. Usando la sutura de la vena porta como tensión, inserte el catéter INTRA de calibre 20 en la vena porta hepática un centímetro por debajo de donde se ramifica a la vena porta hepática derecha e izquierda.
Luego, deslice el catéter por la vena, pero manténgalo debajo del área de ramificación. Permita que la sangre viaje por el catéter hasta que comience a gotear. Asegure el catéter intravenoso con la sutura de la vena porta.
Use una vía intravenosa para conectar un frasco intravenoso con tampón A al catéter. Luego, enjuague el hígado con esta solución mientras evita la entrada de aire en el sistema. Ate la sutura alrededor de la IVC debajo del riñón.
Después de eso, corte el IVC debajo de la sutura para permitir que el animal se desangre. Una vez perfundido, corte el estómago, los intestinos, el bazo y otras entrañas adheridas al hígado. Luego, corte el diafragma y los vasos principales de la cavidad torácica.
Retire el hígado del animal y colóquelo en la bandeja de perfusión. Retire con cuidado la línea IV y conecte la solución de colagenasa en la cámara de recirculación. Permita que el hígado se perfunda hasta que la cápsula se modele y parezca blanda.
Esto generalmente debería tomar de 10 a 15 minutos. Una vez digerido, retire el hígado de la cámara y colóquelo en una placa de Petri de 10 centímetros con aproximadamente 20 mililitros de DMEM sin suero. Separe suavemente el hígado con un par de puntas de pipeta y deseche el árbol biliar.
Después de eso, filtre la suspensión hepática a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 50 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente. Luego, recoja el sobrenadante que contiene células hepáticas no parenquimatosas.
Centrifugar el sobrenadante a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de eso, recoja el gránulo celular y vuelva a suspenderlo en un mililitro de tampón de aislamiento. Determine el número de celda mediante un contador de celda automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
A continuación, centrífuga la suspensión celular. Aspirar el sobrenadante por completo y resuspend el pellet con 90 microlitros de tampón de aislamiento por cada 10 millones de células. Agregue 10 microlitros de CD146 MicroBeads por cada 10 millones de células totales.
Mézclalo bien e incuba durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Para lavar las células, agregue de uno a dos mililitros de tampón de aislamiento por cada 10 millones de células. Centrifugar la solución a 300 veces G durante 10 minutos.
Después de eso, aspire el sobrenadante por completo y resuspenda hasta mil millones de células en 500 microlitros de tampón de aislamiento. A continuación, prepare la columna de separación enjuagándola con tres mililitros de tampón de aislamiento. Aplique la suspensión de celda sobre la columna apilada con filtros de preseparación de 70 micrómetros.
Lave la columna con tres mililitros de tampón de aislamiento tres veces. Después de eso, retire la columna del separador y colóquela en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Pipetee cinco mililitros de tampón de aislamiento sobre la columna.
Para recuperar las células magnéticas marcadas con cuentas, empuje firmemente el émbolo hacia la columna para eliminar las células. Finalmente, centrifugue las células a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. La pureza de los LSEC aislados y los marcadores de superficie se evaluaron con citometría de flujo.
El análisis de datos y la estrategia de cierre para LSEC y singletes cerrados se basan en datos de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Los LSEC aislados se tiñeron con un colorante de viabilidad y una combinación de anticuerpos CD45, CD146 y Stabilin-2. Los LSEC viables se cerraron en la población CD45 negativa y se analizaron para la expresión de CD146 y Stabilin-2.
A partir de estos datos, se confirmó que los LSEC aislados tenían una viabilidad superior al 94% y una pureza superior al 90%. El fenotipo específico de LSEC de las células aisladas se confirmó aún más utilizando microscopía de luz y microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados se cultivaron en el medio de crecimiento completo durante seis horas y se examinaron mediante microscopía de luz.
Las flechas blancas en la imagen SEM indican fenestras LSEC, que es un rasgo morfológico característico de los LSEC. Los pasos críticos para garantizar la perfusión completa de un tejido hepático son el posicionamiento adecuado de la cinta del catéter, evitar la introducción de aire en el catéter y el momento óptimo de la digestión de la colagenasa. La LSEC de alta calidad adquirida utilizando nuestro protocolo facilitará la identificación del mecanismo molecular de la función de la LSEC y mejorará nuestra comprensión de su papel en la comunicación intercelular en el hígado, en la salud y en la enfermedad.
