El objetivo de este protocolo es describir cómo evaluar la cantidad y la distribución de la deposición de hierro en el cerebro de un modelo de ratón con EA. En este protocolo, utilizamos ratones transgénicos 5xFAD de ocho meses de edad como modelo de ratón AD y los comparamos con ratones de tipo salvaje de la misma edad. Incluimos detalles de los procedimientos para preparar el reactivo químico, seccionar el cerebro, realizar la tinción de Perls/DAB y analizar las imágenes resultantes.
Anestesiar correctamente al ratón y comprobar la profundidad de la anestesia y la analgesia. Exponga su corazón, luego abra la aurícula derecha. Inyecte 20 mililitros de PBS y 4% de PFA desde el ventrículo izquierdo en secuencia.
Tenga en cuenta que se deben observar temblores de fijación. Decapita al ratón y extrae su cerebro. Luego, fije el cerebro en 4%PFA durante 12 a 24 horas.
Sumerja el cerebro en sacarosa al 15% y al 30% durante 12 a 24 horas. Corta el cerebro sagitalmente desde la mitad y usa cualquiera de las mitades para seccionar. Monta el cerebro en la perilla, coloca un anillo de papel de aluminio alrededor del cerebro y agrégale OCT para incrustar el cerebro.
Establezca el grosor de las secciones y la temperatura del criostato. Luego, corta el cerebro. Si las secciones se pliegan, use pinceles suaves para desplegar las secciones.
Recoja cada sección en los portaobjetos con PBS, luego elimine las burbujas en la sección. Seleccione un portaobjetos con tejido cerebral intacto y colóquelo en una caja de tinción de plástico llena de PBS. Coloque la caja en un agitador giratorio ajustado a una velocidad lenta durante cinco minutos para enjuagar completamente el compuesto OCT residual.
Prepare 20 mililitros de ferrocianuro de potasio al 2% y volumen igual de ácido clorhídrico al 2%. Luego, mézclalos en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Asegure el portaobjetos en el tubo con pinzas e incube la mezcla en un baño de agua precalentada a 60 grados centígrados durante 30 minutos.
Lave el portaobjetos con PBS y limpie el exceso de líquido con papel de seda. Coloque el portaobjetos plano sobre la mesa del laboratorio e incluso aplique la solución de DAB sobre el tejido con una pipeta. Incubar durante 10 minutos para mejorar la tinción de Perls.
Retire la solución excesiva de DAB y enjuague los pañuelos lavándolos tres veces con PBS. Deshidratar la sección secuencialmente en soluciones de alcohol graduadas y xileno durante tres minutos cada una. Cubra las secciones con una goma neutra y un cubreobjetos.
Luego, déjelos secar en una campana extractora. Enciende el microscopio. Ajusta el brillo de la fuente de luz.
Concéntrese en la sección del cerebro con un objetivo de aumento de 4X. Mueva la platina del microscopio para enfocarse en las áreas con altas señales de tinción de Perls/DAB, especialmente el hipocampo y la corteza cerebral. y capturar imágenes.
Abra la imagen del objetivo con un aumento de 10 y, a continuación, convierta el formato de imagen a escala de grises de 8 bits. Los valores de gris de la imagen se convirtieron en valores OD y, a continuación, se utilizó la función de umbral para cubrir las áreas positivas de tinción de Perls/DAB. Seleccione las siguientes opciones de configuración y, lo que es más importante, seleccione limitar al umbral para excluir el ruido de fondo.
Por último, seleccione las mediciones para obtener resultados para el análisis estadístico. Para investigar la distribución y acumulación de hierro en un modelo de ratón con EA, realizamos la tinción Perls/DAB de secciones sagitales del cerebro. Se observaron señales altas de Perls/DAB en el hipocampo y la corteza, especialmente en el subículo del hipocampo de los ratones 5xFAD, mientras que los cerebros de los ratones de tipo salvaje de dos y ocho meses mostraron una señal más débil.
Por debajo de más de 40 aumentos, la señal en ratones 5xFAD aparece en estructuras similares a placas A-beta, lo que coincide con estudios anteriores. Estos resultados demuestran la efectividad de Perls/DAB como técnica histoquímica para la detección de hierro. También mostramos dos casos de tinción fallida.
En estos casos se producirá una cobertura excesiva o una deshidratación inadecuada. La tinción Perls/DAB proporciona una señal más fuerte y un mejor contraste de fondo que la tinción Perls convencional, lo que hace que la detección de hierro sea más sensible y precisa. Además, detecta el hierro férrico en complejos de proteínas débilmente unidos.
El hierro que está fuertemente unido, como en la hemoglobina, no reaccionará. Esto reduce en gran medida las señales no deseadas causadas por el hierro en los glóbulos rojos y la hemoglobina. En general, la tinción con Perls/DAB es apropiada para experimentos con animales y las investigaciones patológicas que requieren especificidad y sensibilidad medial.
Proporciona a los investigadores un método para visualizar y cuantificar la acumulación de hierro a expensas de menos tiempo y costo.
