Este método de ahorro de tiempo reduce la variabilidad entre rondas de procedimientos inmunohistoquímicos en estudios de neurociencia para optimizar la visualización de la anatomía y proteínas y tejidos locales. La principal ventaja de esta técnica es que reduce el tiempo que se tarda en la criocirión y montar el tejido cerebral mediante la combinación de múltiples cerebros en un solo bloque congelado. Mientras que esta técnica está optimizada para secciones coronales de cerebros de roedores, se puede adaptar a secciones sagitales o transversales o diferentes tipos de tejidos como el músculo o el hígado.
Después de una perfusión transcardial exitosa, después de arreglar el cerebro de los animales en un vial de 25 mililitros de 4%paraformaldehído en PBS durante 24 horas. Después de esto, usa fórceps con puntas contundentes para eliminar los cerebros del paraformaldehído. Transfiera el cerebro a un vial con aproximadamente 20 mililitros de solución de sacarosa al 30% en TBS.
Mantenga el cerebro y la solución hasta que se hundan en la parte inferior del vial. A continuación, coloque un vaso de vidrio de 500 mililitros sobre una cama de hielo seco en un cubo de hielo. A continuación, vierta de 300 a 400 mililitros de isopentano en el vaso de precipitados.
Mantenga el isopentano entre 45 negativos y 50 grados centígrados negativos. En la parte superior del banco, llene un molde de incrustación desechable aproximadamente a mitad de camino completo con la temperatura de corte óptima o el compuesto OCT. Utilice una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire del molde.
Utilice los fórceps con puntas contundentes para eliminar el primer cerebro de la solución de sacarosa. A continuación, utilice una nueva cuchilla de afeitar para eliminar el cerebelo y las bombillas olfativas antes de separar los hemisferios. A continuación, dé a los cerebros un sistema de nomenclatura numérico.
Usa fórceps contundentes, recoge el cerebro que se colocará en la posición dos y orientalo con el lado que se corta primero mirando hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT y utilice las pinzas para ajustar su posición hasta que se posicione de forma independiente. Una modificación clave de esta técnica es el espacio en blanco en la posición uno.
Este espacio está designado para permitir una fácil identificación de la orientación del megacebro y por lo tanto identificar el animal asociado con cada cerebro. Después de que todos los cerebros se han colocado en el molde, añadir suficiente OCT para cubrir la parte superior del cerebro, a continuación, utilizar una aguja para eliminar cualquier burbuja de aire. Sostenga la esquina del molde con fórceps asegurando que los fórceps no se sumerjan parcialmente en el PTU.
A continuación, baje el molde en el isopentano para que el tercio inferior del molde se sumerja. Después de 30 segundos, baje todo el molde en el isopentano y suéltelo de los fórceps. Después de tres minutos, utilice los fórceps para quitar el molde del isopentano.
Envuelva inmediatamente el molde y su contenido en papel de aluminio y etiquételo adecuadamente. Transfiera el megacebro a un congelador negativo de 20 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas. En primer lugar, ajuste la temperatura del gabinete de criostatos a 19 grados Celsius negativos.
Retire el megacerebro del congelador y colóquelo en el criostato. A continuación, coloque un mandril y dos pinceles finos con puntas en el criostato. Después de esto, etiquete las diapositivas con el número de identificación de megabrano y el número de diapositiva y colocar las diapositivas en el calentador de diapositivas.
A continuación, desenvuelva el megacerebro y use una cuchilla de afeitar para cortar las esquinas del molde. Dispensar una fina capa de OCT en el mandril. A continuación, coloque rápidamente el megacerebro en el mandril.
Después de que el OCT esté completamente congelado, aplique una capa de dos milímetros de OCT alrededor de los lados del megacerebro y permita que corra por los lados sobre el mandril. Utilice una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier exceso de OCT de los lados y la parte inferior del mandril. En primer lugar, coloque el mandril montado con el megacerebro en la cabeza del mandril del criostato.
A continuación, ajuste el criostato al espesor deseado. Recortar el PTU y el tejido según sea necesario para llegar a la región cerebral deseada para la recolección de tejido. A continuación, baje la placa antivuelco hasta que descanse en el escenario y gire la manija del criostato para tomar una sola sección.
Levante lentamente la placa antivuelco, teniendo cuidado de que la sección del tejido no se toque. Usa suavemente los pinceles para desenrollar la sección del tejido hasta que esté acostada. Si es necesario, sostenga el OCT plano usando los pinceles para evitar que se enrolle.
A continuación, retire la diapositiva del calentador de diapositivas y coloque el lado de la etiqueta de la diapositiva hacia abajo sobre la sección del megabrancio y deje que se pegue a la diapositiva. Aplique rápidamente una gota de PBS en la sección del tejido. Usando un pincel con punta fina sumergido en PBS, cepilla cualquier burbuja en la sección de tejido y desdobla el tejido para que quede acostado sobre la diapositiva.
Por último, coloque la diapositiva en el calentador de diapositivas para secar durante 45 minutos y guarde la diapositiva en 80 grados Celsius negativos. En este protocolo, se preparó tejido cerebral de nueve animales y se criocisó simultáneamente. Después de la criocirión, se puede realizar una tinción de H&E para evaluar la calidad de la crioprotección.
Los resultados representativos de la molécula adaptadora de unión de calcio ionizado uno o la tinción Dea1 de microglia muestran una tinción constante entre cada cerebro del estudio en un solo megabrain. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear constantemente la temperatura mientras congela el megacebro para evitar agrietamiento o descongelación y luego volver a congelar el tejido que conduce a la integridad anormal del tejido. No se recomienda segregar diferentes grupos de tratamiento en megabranos separados, ya que esto puede crear varianza entre los grupos durante la tinción y reducir el sesgo y la subjetividad durante la toma de imágenes y el análisis.
No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como usar PBE y trabajar en una capucha siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
