El estudio investiga el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en el arco aórtico y la raíz de ratones knockout de LDLR, ofreciendo un protocolo de aislamiento, tinción y análisis para evaluar la composición de la placa de gravedad de la aterosclerosis. Además del examen histológico utilizado en este estudio, las técnicas prácticas para evaluar la aterosclerosis también incluyen marcadores bioquímicos, pruebas de biología molecular y ecografía vascular. La precisión del procedimiento de disección plantea el mayor obstáculo técnico en la realización de la extracción aórtica in vivo en el modelo murino de aterosclerosis.
Para comenzar, coloque los ratones sacrificados en posición supina sobre una tabla de espuma cubierta con una o dos capas de papel absorbente. Fije las extremidades con alfileres para estabilizar el cuerpo. Rocíe etanol al 75% sobre el abdomen de los ratones para limpiar y humedecer el pelaje.
Use fórceps para agarrar la piel ventral del ratón. Luego, con unas tijeras finas, corte la piel desde la base del abdomen hasta la parte superior del cuello. Abra la pared abdominal y use fórceps para levantar el esternón.
Corta a través del diafragma y las costillas para exponer la cavidad torácica. Extirpar el esófago y la tráquea para facilitar la limpieza de las arterias carótidas. Extirpa con cuidado los órganos, como el hígado, los pulmones, el bazo, el tracto gastrointestinal y el páncreas, preservando los riñones y la aorta abdominal.
Al diseccionar las arterias mesentéricas, levante los intestinos y haga incisiones lejos de la aorta para evitar daños. Ahora, coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico para proporcionar un campo de observación claro y alinear una fuente de luz fría con el área de disección. Con una jeringa de 10 mililitros llena de PBS, inyecte lentamente en el ápice del ventrículo izquierdo con una aguja y observe la dilatación de la aorta.
Limpie suavemente la sangre y el líquido en el área de disección con papel de seda para exponer completamente el campo de visión. A continuación, agarre el segmento diafragmático de la aorta torácica con pinzas y use unas tijeras de resorte para cortar el tejido conectivo entre la aorta y la pared muscular torácica. Tire suavemente del corazón con fórceps y levante la aorta torácica.
Observar las ramas del arco aórtico y diseccionar la grasa adventicial y el tejido conectivo alrededor del arco aórtico y sus ramas hacia arriba a lo largo de la aorta torácica. Diseccionar la aorta abdominal y las arterias ilíacas comunes hacia abajo a lo largo de la aorta torácica. Recorte el tejido cardíaco y corte la mitad inferior del corazón a lo largo de un plano paralelo a las aurículas, y coloque el corazón recortado en un medio de almacenamiento adecuado.
Antes de diseccionar el arco aórtico, coloque una pequeña junta de color oscuro debajo de él para crear contraste. Captura una fotografía de la zona del arco aórtico. Corta las arterias ilíacas comunes de uno a dos milímetros por debajo de su bifurcación y recorta las pequeñas ramas de la aorta a lo largo de la columna vertebral para liberarla.
Después de separar las arterias renales cerca de los riñones, corte las tres ramas de los vasos del cuello desde sus extremos distales. Por último, corta la aorta ascendente cerca del corazón. Prepare un mililitro de solución de paraformaldehído al 4% en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con anticipación.
Coloque la aorta en el tubo preparado y fíjelo a temperatura ambiente durante al menos 24 horas. A continuación, transfiera la aorta a una placa de Petri que contenga PBS para evitar que se seque. Bajo un microscopio estereoscópico, extraiga cuidadosamente cualquier resto de grasa adventicial con pinzas y tijeras de resorte para reducir la interferencia en la cuantificación de la placa.
Con unas tijeras de resorte, corte con cuidado la aorta a lo largo de su eje longitudinal interno. Secuencialmente, corte las tres ramas del arco aórtico a lo largo del lado lateral hasta el nivel de la curvatura del arco aórtico, permitiendo que se extienda completamente. En esta etapa, proceda con la tinción de Oil Red O o almacene la aorta en paraformaldehído al 4% para análisis futuros.
Coloque la aorta abierta cortada en una placa de seis pocillos. Agregue un mililitro de agua estéril destilada doble a cada pocillo y lave durante cinco minutos en una coctelera. Coloque la placa de seis pocillos en una campana extractora y seque al aire durante 20 minutos hasta que no queden marcas de agua visibles.
Agregue un mililitro de solución de trabajo Oil Red O recién preparada a cada pocillo. Después de agitar la placa durante 20 minutos, retire la solución Oil Red O de los pocillos. Agregue dos mililitros de agua estéril destilada doble a cada pocillo y lave durante cinco minutos.
Después de tres lavados, mantenga la aorta en agua destilada doble. Transfiera la aorta a un portaobjetos y coloque una almohadilla de goma negra debajo del portaobjetos para mejorar el contraste. Separe la aorta mientras la observa bajo el microscopio estereoscópico.
Ahora, coloque la diapositiva sobre un papel blanco para mejorar aún más el contraste. Coloque una regla al lado de la diapositiva y tome una fotografía con una cámara. Almacene la aorta tratada en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de PBS para mantenerla húmeda.
El peso corporal de los ratones knockout LDLR alimentados con una dieta de estilo occidental aumentó significativamente en comparación con los alimentados con la dieta chow. Los niveles plasmáticos de triglicéridos y colesterol total fueron significativamente más altos en el grupo de dieta de estilo occidental que en el grupo de control. La tinción de aceite aórtico Red O mostró una acumulación severa de lípidos en las arterias de los ratones knockout de LDLR alimentados con la dieta de estilo occidental en comparación con los que seguían una dieta chow.
El aumento de los depósitos de lípidos se correlacionó con lesiones ateroscleróticas más graves. El área lesional de la raíz aórtica y el núcleo necrótico fueron significativamente mayores en los ratones alimentados con dieta occidental en comparación con los ratones alimentados con dieta chow. La cuantificación del área lesional de la raíz aórtica y el área necrótica confirmó que la dieta occidental exacerbó la formación de placa aterosclerótica en ratones knockout de LDLR.
