Nuestro protocolo ayuda a los investigadores a implementar tuberías experimentales estandarizadas para realizar la caracterización fenotípica de poblaciones similares mediante tinción inmunofluorescente. Con esta técnica, los investigadores pueden analizar rigurosamente la composición similar de los tejidos complejos de la enfermedad y realizar análisis cualitativos y cuantitativos de los fenotipos de los tipos celulares de interés. Demostrar el procedimiento será Sidney Mahan, un técnico de mi laboratorio.
Para preparar al animal para la cosecha de la arteria braquiocéfala, corte el peritoneo hasta el esternón, teniendo cuidado de no dañar los tejidos abdominales. Y hacer dos cortes en la línea media axilar a través del tórax, teniendo cuidado de no dañar el corazón y los pulmones. Luego, corta el diafragma para exponer parcialmente el corazón.
Para profusar el ratón, instale un sistema de profusión de gravedad de tal manera que la presión del líquido de profusión sea equivalente a la presión arterial murina promedio para permitir una profusión y mantenimiento constantes de la morfología del vaso. Luego, profusa al animal con cinco mililitros de temperatura ambiente PBS, 10 mililitros de paraformaldehído a temperatura ambiente del 4%, y cinco mililitros adicionales de PBS a temperatura ambiente. Conecte una aguja de mariposa de calibre 23 o 25 al sistema de profusión por gravedad y pase PBS a través de la aguja para expulsar el aire de los tubos antes de insertar la aguja en el ventrículo izquierdo.
Después de asegurar la aguja en su lugar, utilice tijeras de iris para hacer una incisión de menos de dos centímetros en la aurícula derecha. Cosecha los tejidos de interés en un 4%de paraformaldehído fresco. Para exponer la arteria braquiocéfala, usa tijeras para hacer una incisión por la línea media del esternón a través del manubrio y usa fórceps para tirar de ambos lados de la caja torácica para abrir completamente la cavidad torácica.
A continuación, coloque el animal bajo un microscopio diseccionador para visualizar parcialmente las carótidas, y use pinzas finas para tirar de los músculos, el tejido conectivo y la grasa hasta que la carótida derecha, la arteria braquiocéfala, la bifurcación subclaviana y el arco aórtico se limpien y aíslen del tejido conectivo y la grasa circundantes. A continuación, utilice fórceps para agarrar la carótida correcta por debajo de su bifurcación y hacer un corte inicial por encima de los fórceps. Aún así, sosteniendo la carótida, haz un segundo corte a través de la arteria subclavia y haz los dos últimos cortes a través del arco aórtico a ambos lados de la arteria braquiocéfala.
Luego, recoja cualquier otro tejido vascular de interés y coloque la arteria braquiocéfala y los demás tejidos en una solución de 4%paraformaldehído durante la noche a temperatura ambiente. Para la tinción inmunofluorescente de la arteria braquiocéfala, utilice un microtoma para obtener secciones de 10 micrómetros a través de la muestra de tejido incrustado en parafina hasta que pueda confirmarse por la microscopía de luz que el arco aórtico se ha seccionado a través y la arteria braquiocéfala es visible. Ajuste la orientación del bloque hasta que el tejido sea completamente perpendicular a la hoja del microtomo y obtenga tres secciones seriales de 10 micrómetros de espesor de la arteria braquiocéfala por diapositiva de vidrio, hasta que se alcance la bifurcación subclavia.
Una vez recogidas todas las secciones, hidrata las muestras de tejido bajo una capucha química con dos inmersiones de xileno de cinco minutos, seguidas de una serie de etanol de inmersión de cinco minutos como se indica, y dos inmersiones de agua desionizadas de cinco minutos. A continuación, incubar toboganes en solución de recuperación de antígenos, de acuerdo con los protocolos estándar, seguidos de calentamiento en microondas durante 20 minutos. Después de un enfriamiento de una hora a temperatura ambiente, usa una pluma hidrófoba para rodear cada sección del tejido.
Y bloquee cualquier enlace no específico con búfer de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, etiquete las muestras de tejido durante la noche a cuatro grados Celsius con el cóctel de anticuerpos primario de interés, o los anticuerpos de control IgG coincidentes con el isotipo. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado, seguido de una incubación de una hora en el cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia apropiado y DAPI para la visualización del núcleo.
A continuación, utilice un medio de montaje adecuado para la microscopía de fluorescencia para montar los cubreobjetos en las diapositivas. Para la microscopía confocal de las secciones de tejido etiquetado, utilice secciones manchadas con el control De IgG y anticuerpos primarios para establecer la sensibilidad, la potencia del láser y el desplazamiento del detector para cada canal individual. A continuación, establezca las posiciones superior e inferior para la adquisición de la pila z y determine el grosor y el número de pilas que se van a crear imágenes.
Una vez adquiridas todas las imágenes, abra las imágenes en ImageJ y abra el panel de herramientas de canal y pseudocolore los diferentes canales de tinción. Combine los canales de color. Todos los canales deben ser visibles en la misma imagen.
Active y desactive canales de color individuales en el panel de herramientas de canal y haga clic con el botón derecho en el icono de recuento para seleccionar la herramienta multipunto. Haga doble clic en el icono de recuento para abrir el panel de herramientas de puntos y seleccione el tipo y el tamaño de los elementos utilizados para contar las celdas. Marque Mostrar todo y encienda el canal DAPI solo en el panel de herramientas de canal.
A continuación, seleccione el canal de contador cero y haga clic en núcleos individuales para etiquetar, desplazándose a través de las pilas z para contar todos los núcleos manchados dentro de la región de interés. El número de eventos de una sola celda cuantificados se indicará a continuación en el panel de herramientas de puntos. Cuando todos los núcleos hayan sido etiquetados, encienda otro canal de tinción y seleccione el canal de contador uno para etiquetar las células en las que hay una colocación entre DAPI y la tinción de anticuerpos.
Para la tinción citoplasma, seleccione las células con tinción que rodea el núcleo a lo largo de toda la profundidad del núcleo, comprobando múltiples pilas z según sea necesario. A continuación, los resultados se pueden expresar como el número de celdas al número total de celdas positivas DAPI o el número de celdas por área dentro de la región de interés. La tinción inmunofluorescente con anticuerpos dirigidos a marcadores fenotípicos, como se ha demostrado, permite adquirir imágenes de cada tinción de marcador individual y contraste de interferencia diferencial para la delineación de regiones de interés para el recuento de células individuales.
El recuento de células individuales para determinar la abundancia de diferentes poblaciones derivadas de células musculares lisas se puede realizar usando ImageJ. Por ejemplo, el análisis de recuento de células individuales en la región del límite fibroso de estas secciones transversales representativas reveló diferencias notables en la composición celular de la zona de la tapa fibrosa entre ratones tratados con anticuerpos beta anti IL-1 y ratones tratados con un isotipo que coincide con el control IgG. De hecho, la inhibición de IL-1 beta se asoció con una disminución en las células musculares lisas positivas de YFP, y un aumento en las células galectina-3 positivas.
Además, se observó una disminución en el número de células musculares lisas aórticas musculares lisas positivas YFP-positivas. Mientras que el número relativo de macrófagos positivos a la célula muscular lisa YFP positivo en 3 años se incrementó significativamente en ambos lugares de la arteria braquiocéfala. En particular, la inhibición de IL-1 beta no afectó el número total de células osteocondrogénicas dentro de la lesión, ni en la proporción de células condrogénicas derivadas de células musculares lisas o derivadas de macrófagos.
Este protocolo ha sido diseñado para mejorar el rigor y la reproducibilidad en el análisis de lesiones ateroscleróticas mediante la estandarización de pasos clave como la recolección de tejidos, procesamiento y seccionamiento, así como el recuento de células individuales. Este protocolo se puede utilizar para analizar camas vasculares adicionales propensas a presentar lesiones ateroscleróticas, incluyendo la aorta y la raíz aórtica.
