Con el apoyo de un subproyecto de NIH P20 RR16440 y una subvención del puente de la Oficina de la West Virginia University de Investigación y Estudios de Posgrado de malezas S.. La asistencia técnica de L. López-Skinner durante las primeras fases del desarrollo del proyecto se agradece. Los autores también están agradecidos por la asistencia técnica y OSC19 células de J. Myers y Younes M. (Departamento de Cirugía de Cabeza y Cuello, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner y Secrest K. (Universidad de Virginia Occidental del Departamento de Patología Banco de Tejidos) para el procesamiento histológico y procedimientos, R. Wysolmerski (West Virginia University, Departamento de Neurobiología y Anatomía) para la construcción de LifeAct-mCherry y J. Bear (Universidad de Carolina del Norte) para el vector de pLL7.0 lentiviral. El uso del Fondo para la Universidad de West Virginia Imagen de Microscopía (apoyado por el NIH subvención P20 RR16440 y María Babb Randolph Cancer Center) y sus no-lineal laboratorio de microscopía óptica (NLOM, con el apoyo de una colaboración conjunta entre la Universidad de Virginia Occidental del Centro de Neurociencias y la Universidad de Virginia Occidental del Departamento de Física / West Virginia Nanociencia Initiative) es también agradece. El NLOM es apoyado en parte por el NIH subvención P30 RR031155 al Centro para la Neurociencia.

1. Líneas Celulares, Construcción de vectores y Producción lentivirales <ol><li> Cabeza humana y las células tumorales del cuello líneas (o OSC19 UMSCC1) se cultivaron en medio completo que consta de DMEM (gato Cellgro # 50-003-PB), complementado con fetal bovino al 10% FBS suero (cat # SH30070.03 Hyclone), 1% de penicilina / estreptomicina (gato Cellgro º 30-002-CI), y el 1% no aminoácidos esenciales (gato Cellgro º 25-025-CI). </li><li> Para transferir la secuencia de codificación LifeAct-mCherry en el vector lentiviral pLL7.0, el sitio de reconocimiento en el Sbf1 mCherry padres cDNA se vio alterada por la introducción de tres mutaciones silenciosas en la secuencia de reconocimiento mediante mutagénesis dirigida (gato Stratagene # 200518-5). El resultado modificado LifeAct-mCherry secuencia fue amplificado por PCR luego de que flanquean EcoR1/Sbf1 sitios y se subclonó en pLL7.0 para generar la construcción pLL7.0-LifeAct-mCherry. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Virus de producción <ol><li> La producción viral se llevó a cabo de acuerdo con la expresión lentivirales sistemas manuales (versión del sistema Bioscience 2-051018). </li><li> La línea celular de empaquetamiento 293T/17 células (ATCC # cat CRL-11268) fue aumentado a 40% de confluencia en el mismo medio completa que se utiliza para las líneas de CECC. </li><li> Las células fueron transfectadas con el pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 y pVSV-G vectores en una proporción de 3:2:1, respectivamente, utilizando CalPhos (cat # 631312 Clontech). </li><li> Después de 24 horas, los medios de comunicación inicial de la transfección fue reemplazado por medio fresco. </li><li> Los medios de comunicación fue recogido y se repone cada 12 horas durante 72 horas y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 3. La producción de Cabeza y Cuello líneas celulares con LifeAct estable-mCherry Expresión <ol><li> Los medios de comunicación recogidos se escindió en 2000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Un ml de los medios de comunicación aclaró que contiene el virus se añade directamente a OSC19 o UMSCC1 las células durante 12 horas. Las células fueron lavadas, y un adicional de un ml de virus fue introducido por otro período de 12 horas. </li><li> Las células fueron tratadas con los medios de comunicación que contiene 200mg/ml puromicina durante dos semanas para seleccionar las colonias resistentes. </li><li> Clones supervivientes fueron examinados visualmente para LifeAct-mCherry expresión por microscopía de fluorescencia. Individual colonias positivas fueron typsinized utilizando discos estériles clonación 3mm (gato Fisher # 0790710A). </li><li> Células positivas se mantuvieron en los medios de comunicación que contiene puromicina 200mg/ml hasta que se congele de nuevo o usado para la inyección ortotópico. </li></ol> 4. Formación ortotópico xenoinjerto tumoral <ol><li> Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo (09-0821) aprobado por el Cuidado Animal de la Universidad de Virginia Occidental y el empleo. </li><li> LifeAct-mCherry células tumorales que expresan se tripsinizaron, se centrifuga y 2,5 x 10 4 células se resuspendieron en 50 medios de comunicación completa mL. </li><li> Las células tumorales fueron cargadas en una jeringa que está conectada a una aguja de calibre 27 ½. </li><li> Mujer Fox1 atímicos nu / nu ratones de 8 semanas de edad (Harlan Laboratories), fueron anestesiados con una combinación de ketamina y xilazina 80mg/kg 10mg/kg. Ratones anestesiados se mantuvieron entre 37-40 ° C en una manta eléctrica. </li><li> Usando una pinza estéril, la punta de la lengua se agarró suavemente y con cuidado sacó de la cavidad oral. </li><li> Las células se inyectaron lentamente a un lado de cada lengua para crear una masa bulbosa en el centro de la lengua, evitando las arterias linguales. </li><li> Los ratones fueron inyectados con la yohimbina 2.1mg/kg y regresó a la almohadilla, donde fueron monitoreados durante 2-3 horas durante la recuperación de la anestesia. </li><li> Una vez restablecido, los ratones fueron colocados en jaulas estéril que contiene una dieta blanda masa de transgénicos (gato Bioserve # S3472). </li><li> Los ratones se pesaron cada 2-3 días y control visual de la aparición del tumor. </li></ol> 5. Preparación de las lenguas del ratón para ex-vivo de imágenes <ol><li> Los ratones albergar los tumores en diferentes puntos temporales (normalmente 2-4 semanas después de la inyección) fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono. </li><li> Las lenguas fueron extraídos, lavados con PBS 1X y unido a un lado de un casete de inclusión en parafina convencional de tejidos (Cat. # StatLab H104), con hilo de monofilamento de coser en una tienda local de la manía y un tamaño de 8 aguja de coser. </li><li> Una vez que las lenguas fueron inmovilizados, el conjunto de toda la cinta se coloca en un plato de cultivo de tejidos de 30 mm y se sumergieron en PBS 1X. </li><li> Lenguas procesados ​​fueron utilizados inmediatamente para microscopia de excitación de dos fotones. </li></ol> 6. Imágenes de los tumores de la lengua con dos fotones Microscopía <ol><li> Cintas de la lengua se sumergieron en una placa de 60 mm que contiene 1X PBS asegurado en un soporte diseñado en un brazo voladizo retráctil (Sala Shuttle, Siskiyou instrumentos) situado bajo el objetivo de un microscopio vertical (microscopio móvil (MOM); Instrumentos Sutter). </li><li> Una inmersión de agua 40X/0.8NA lente del objetivo se coloca directamente sobre o más allá tum visibleo lesiones. Las lenguas fueron fotografiadas por microscopía de dos fotones con el Ti: zafiro láser (Mira, coherente) la intensidad de 60 mW y la longitud de onda de entrada de 755 nm para optimizar la señal mCherry. </li><li> Serie de imágenes de 1 mm de escaneo láser se recogieron en una profundidad de 1 m incremental sobre una profundidad total del tejido de entre 15 y 100 micras (dependiendo del volumen del tumor). Las imágenes fueron capturadas utilizando scanimage, un programa de código abierto basado en la plataforma de MATLAB que fue desarrollado por el laboratorio de Karel Svoboda (Janelia Farms, HHMI). Scanimage genera una salida de dos canales de la trama patrones de análisis para el control de la x / y galvanómetros de espejo de escaneo, y al mismo tiempo captura un máximo de cuatro canales de entrada de señal de forma simultánea desde los tubos fotomultiplicadores (PMT) a través de una placa de adquisición de datos (PCI-6610S , National Instruments). El PMT señales son amplificadas por los preamplificadores de bajo ruido actuales (SR570, Sistema de Investigación de Stanford) antes de la alimentación en la placa NI-DAQ para su visualización en la pantalla del monitor. Scanimage recoge z-stack imágenes mediante el control del eje z del objetivo y recoge lapso de tiempo las imágenes en un solo modo o en bicicleta. Las imágenes se guardan en un archivo TIFF con una profundidad de 16 bits. </li></ol> 7. Análisis de Imágenes con Amira Software <ol><li> Amira imagen para la cuantificación del tumor: En el software Aimra, abra el archivo TIFF que contiene el conjunto de los z-stack imágenes. </li><li> Resalte el nombre del archivo, seleccionar y aplicar la función de Voltex para generar una representación tridimensional. Una imagen de gran tamaño del tumor primario con varios grupos más pequeños y disociados invasiva (IG) de las células invadidas colectiva suele ser evidente en la imagen renderizada (ver Figura 6). </li><li> Para seleccionar la masa del tumor primario, seleccione &quot;Open Data&quot;, luego &quot;Etiquetado&quot;, entonces &quot;campo de etiquetas&quot;. </li><li> Umbral del tumor primario, seleccionar todas las imágenes z-stack y desplazarse por las imágenes en el plano z para asegurar la inclusión de sólo la masa del tumor primario en tres dimensiones. Este suele ser el más grande de imagen de tamaño en el campo y, a menudo aparece desglosado en el fotografiado es atravesado por el plano z. </li><li> Use la varita mágica / umbral de la función de corregir la fluorescencia de fondo y eliminarlo de la imagen sin descartar ninguna de la señal de tumor. Resalta el &quot;archivo dentro de&quot; la etiqueta y haga clic en el botón ⊕. Seleccione la opción &quot;Todos los sectores&quot; casilla de verificación. Esto produce un borde de color alrededor de la zona del tumor primario en un umbral cada incremento de z-stack. </li><li> Para seleccionar IG, elegir la &quot;nueva&quot; función. Seleccione un solo IG y asegurarse de que no se asocia con el tumor primario desplazándose por el plano z. </li><li> Seleccione &quot;Todos los sectores&quot; y haga clic en el botón ⊕. Cambie el nombre del archivo (por ejemplo: IG 1) </li><li> Repita el procedimiento de umbral en el 7,4 y el paso de destacar en el apartado 7.5 de la determinada IG. Seleccione un color de contorno diferente al color que se utiliza para denotar la masa del tumor primario. </li><li> Repita según sea necesario para cada IG adicionales en toda la imagen, al escanear el plano z para asegurar que todos IG se indican. El uso de colores diferentes para cada uno identificado ayudas IG en la identificación de futuros en la imagen. </li><li> Una vez que el tumor primario y las IG son seleccionados, seleccione &quot;segmentación&quot; en el menú desplegable, seleccione &quot;Estadísticas de material&quot;. Esto proporciona la medida del volumen, así como el X, Y y X núcleo del tumor coordenadas para el tumor primario con el fin de calcular las distancias de IG desde el punto central del tumor. </li><li> Con los volúmenes calculados, determinar la distancia de cada IG desde el núcleo central del tumor primario. Seleccione &quot;segmentación&quot;, luego &quot;Estadísticas de material&quot;. Este paso calcula todas las medidas en píxeles. Convertir píxeles micrómetros sobre la base de la calibración de los objetivo de microscopio y cualquier aumento adicional en la ampliación (es decir, funciones de zoom). Para el microscopio y los ajustes utilizados en estos experimentos, el objetivo de 40X se utilizó sin zoom, dando una calibración de 1 píxel = 0,298 micras. Importar datos en una hoja de cálculo Excel, lo que da los parámetros para el tumor primario en tres dimensiones (X1, Y1, Z1) y para cada IG (por ejemplo: X2, Y2, Z2 para el primer IG). </li><li> La distancia invadido en micrones para cada IG desde el centro del tumor primario se calcula utilizando la fórmula √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> El índice de invasión tumoral (T I) se calcula mediante la fórmula T = I N T x V T x D T, donde T = N el número total de IG en la imagen, V T = el volumen total de todas las IG, D T = distancia total recorrida de todos los grupos de invasores en el centro del tumor primario. </li></ol> 8. Tres representaciones tridimensionales con Nikon NIS-Elements Software <ol><li> Tres representaciones tridimensionales con mayor detalle topográfico puede ser generado por la importación de los originales de 16 bits monocromo archivos TIFF de la imagen de tumor en su totalidad en la Nikon NIS-Elementspaquete (Nikon, Melville, NY). Seleccione &quot;Archivo&quot;, luego &quot;ND&quot;, luego &quot;Crear archivo ND de secuencia de archivo&quot;. Seleccione el TIFF z-series pila de imágenes y especificar el tamaño de paso adecuado. </li><li> Calibrar el documento de ND en el plano xy. Especificar el tamaño de un píxel con una calibración manual. </li><li> Elija la opción &quot;Ver Volumen&quot;. Utilice la opción &quot;HQ&quot; función para calcular cortes adicionales en el plano z de una mayor calidad. En la sección &quot;Configuración 3D Renderer&quot;, utilice el &quot;Advanced Renderer&quot; con una calidad de &quot;Detalles de Ultra High&quot; y &quot;con la máxima resolución&quot;. Seleccione la opción &quot;Alpha Blending&quot; para acentuar la superficie del tumor. </li><li> Optimizar la imagen en tres dimensiones para su presentación. Zoom sobre el tumor y el IG y los cultivos asociados según sea necesario. Rotar la imagen en los planos xyz y ajustar la LUT. </li><li> Capturar la imagen de presentación. Seleccione &quot;Edit-Crear vista instantánea (8 bit RGB)&quot;. Nombre y guardar el archivo en consecuencia. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema general que ilustra los pasos clave en la producción ortotópico tumor in situ la lengua y dos imágenes de fotones. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Inyección de LifeAct-mCherry expresar OSC19 células en la lengua el ratón. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 resecado el tumor que contiene la lengua del ratón preparado para dos imágenes de fotones. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Orientación de la lengua de tumor que contiene en su posición en un microscopio de dos fotones listos para la imagen. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Pantalla Representante disparo de scanimage demostrar la adquisición de datos en bruto de la inicial de dos fotones de la imagen. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Análisis de imágenes y la cuantificación de la invasión del tumor en un tumor OSC19 ortotópico. Representante imágenes captura de pantalla de Amira prestación Voltex (A) y una sola sección de un umbral z-(B) con el tumor primario primarios descritos en el grupo de color púrpura, que invada 1 (IG-1) con un contorno azul, IG-2 se indica en rojo y el IG -3 con un contorno verde como un ejemplo del procedimiento de identificación. Puntas de flecha indican IG en (A) y (B). Parcelas C. de volumen en comparación con invadido distancia de ocho IG individuales que se utilizan para calcular el índice de invasión del tumor (Ti). <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Imágenes de la Figura 7. Representante de los tumores e invadió los grupos de tumores de este protocolo en comparación con las imágenes de un enfoque convencional IHC. Sección A. parafina de una lengua ratón toda albergar un tumor UMSCC1 ortotópico. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo utilizando procedimientos convencionales con un anticuerpo primario contra el marcador EMMPRIN CECC células específicas (Zymed, cat # 34 a 5600) en la dilución 1:1000 y se visualizan mediante el uso de la OmniMap DAB anti-Rb kit de detección (Ventana cat # 760 -149), seguido de tinción con hematoxilina de hierro. Imágenes que abarcan el área total de la lengua se recogieron de forma individual con un aumento de 4 veces en un microscopio Olympus Provis ZX70 con una cámara CCD Optronics MicroFire y reconstruida con el paquete de imágenes StereoINvestigator (Bioscience MBF). El tumor se hace evidente en la punta de la lengua. Una región ampliada que muestra el frente invasivo y los distintos grupos de células tumorales (puntas de flecha) se muestra en (B). C. Nikon NIS-Elements prestación de un tumor OSC19 representante. Detalle del contorno mejorada y una visualización clara de IG (puntas de flecha) es evidente. Barras en todas las imágenes = 100 micras.

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	<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers.">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region.">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li><li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma.">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li><li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis:+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li><li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li><li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function.">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li><li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts.">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li><li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model.">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li><li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery.">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li></ol>

Modelos de ratón ortotópico han demostrado ser útiles para el estudio de muchos aspectos de la cabeza y cuello 1,2. Hemos combinado un sistema bien establecido ortotópico de SCOT 3 con imágenes de microscopía de dos fotones de las células mCherry marcado como un sistema para estudiar los primeros eventos de la cabeza y el cuello invasión de células tumorales. En este procedimiento, hemos observado que las células pueden tener fugas en el sitio de la inyección del tumor, especialmente en los ratones de seis semanas o más jóvenes debido al tamaño de la lengua es insuficiente. Nosotros usamos ratones más viejos para evitar este problema. El tamaño de la lengua más grande con los ratones más viejos también ayuda a evitar la ruptura de una arteria lingual y hemorragia excesiva de la lengua. Tomar tumor es mucho mayor cuando la lengua se hincha dramáticamente en el sitio de la inyección inicial. Esto disminuye la inflamación en una o dos horas como el fluido que se inyecta es absorbido. El crecimiento del tumor parece evidente una-dos semanas después de la inyección con el número de células inyectadas se indica como una pequeña protuberancia blanca en la superficie de la lengua. También observamos que en el objetivo de 40X utilizados en nuestros estudios que aquí se presenta, no podemos distinguir las células tumorales individuales, pero se identifican IG como grupos de células invasoras que recapitular el modo típico de invasión CECC. Hasta la fecha este modelo ha sido ampliamente utilizada para las pruebas de la función de moléculas específicas, así como varios fármacos antitumorales en el crecimiento SCOT una invasión, la eficacia se medía por la metástasis de los ganglios linfáticos del cuello uterino determinan con métodos de IHC o bioluminiscentes 4-7. Tumores formados en este sistema de manifestar cerca de la superficie de la lengua (Figura 7), lo que permite la aplicación de la microscopía de dos fotones a los tumores in situ toda la imagen como invasoras multicelulares grupos. El procedimiento también puede utilizarse para visualizar la invasión del tumor con una resolución de celulares. Microscopía de dos fotones ha sido previamente utilizado para el estudio de tratamientos experimentales para cáncer de cabeza y cuello en ortotópico 8,9 y modelos de xenoinjerto 8,10. Sin embargo, hay dos diferencias importantes entre estos informes y el protocolo. En primer lugar, estos estudios utilizan etiquetas extracelular al objetivo / identificar la cabeza y el cuello las células del tumor, posiblemente limitando la detección sólo a las células tumorales con un amplio acceso a la circulación. La segunda invasión de células tumorales cerca del sitio principal que resume probablemente metastásico de las primeras actividades que no se evaluó como un parámetro experimental. El protocolo ofrece la posibilidad de cuantificar directamente invasión de células tumorales en cualquier momento durante la progresión del tumor en la lengua el ratón. Mientras que el método descrito aquí se describe el procedimiento utilizando la lengua disecada, actualmente estamos en el proceso de adaptación de este método a la invasión de la imagen del tumor en ratones vivos para su uso en combinación con la bioluminiscencia para monitorear simultáneamente la invasión temprana, la participación local de los ganglios linfáticos y metástasis a distancia en el mismo animal. Modificaciones en el protocolo de imágenes in vivo requiere el diseño de una etapa apropiada para la colocación y el mantenimiento de los ratones durante la exploración, así como un sistema práctico para regar adecuadamente la cavidad oral de ratones anestesiados durante la elaboración. Una vez optimizado, estas adaptaciones se ofrecen la posibilidad de estudiar el papel potencial de las moléculas pro-invasivas y las pruebas anti-invasiva compuestos en la invasión local y afectación metastásica más distantes de los animales durante períodos prolongados.

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

Loco-regional invasión de cáncer de cabeza y cuello, está vinculado al riesgo de metástasis y presenta un reto difícil en el diseño e implementación de estrategias de gestión de pacientes. Ortotópico modelos de ratón de cáncer oral se han desarrollado para facilitar el estudio de los factores que la invasión de impacto y servir como sistema modelo para evaluar la terapéutica anti-tumoral. En estos sistemas, la visualización de las células del tumor diseminado dentro de los tejidos cavidad oral generalmente ha llevado a cabo por cualquiera de histología convencional o con métodos in vivo bioluminiscente. Un inconveniente principal de estas técnicas es la incapacidad inherente para visualizar y cuantificar con precisión la invasión temprana de células tumorales derivadas de la localización primaria en tres dimensiones. Aquí se describe un protocolo que combina un modelo establecido para el carcinoma de células escamosas de la lengua (SCOT), con imágenes de dos fotones para permitir la visualización multi-vectorial de propagación del tumor lingual. La OSC-19 de cabeza y cuello, la línea de células tumorales se ha diseñado de forma estable para expresar la LifeAct F-actina péptido de unión fusionada con la proteína fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 nu / nu ratones inyectados con estas células de forma fiable forman tumores que permiten que la lengua para ser visualizados por el ex-vivo de aplicación de la microscopía de dos fotones. Esta técnica permite la visualización ortotópico de la masa tumoral y la invasión de las células a nivel local en lenguas extirpadas sin interrupción del microambiente tumoral regional. Además, este sistema permite la cuantificación de la invasión de células tumorales mediante el cálculo de las distancias que invadió a que las células de la localización del tumor primario. En general este procedimiento proporciona un modelo de sistema mejorado para el análisis de los factores que contribuyen a la invasión SCOT y los tratamientos terapéuticos diseñados para prevenir la invasión local y metástasis distantes. Este método también tiene el potencial de ser en última instancia, en combinación con otras modalidades de imágenes en un entorno en vivo.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K vistas.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Combinación de radioterapia en un modelo ortotópico de tumor cerebral del ratón

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

RNAscope para<em&gt; In situ</em&gt; Detección de transcripcionalmente activo Virus del Papiloma Humano en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Dynamic Contrast mejorada de imagen de resonancia magnética de un modelo ortotópico de cáncer pancreático del ratón

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...