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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined <em>In Vivo</em> Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Pace University

&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x7528;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x8D34;&#x6709;&#x6807;&#x7B7E;&#x7684;&#x9499;&#x8C03;&#x86CB;&#x767D; TA &#x51F8;&#x8F6E;&#x9075;&#x5FAA;&#x7684;&#x6210;&#x5E74;&#x5927;&#x9F20;&#x611F;&#x89C9;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x9499;&#x8C03;&#x7D20;&#x6D3B;&#x5316;&#x3002;&#x9499;&#x79BB;&#x5B50;&#x6D53;&#x5EA6;&#x662F;&#x540C;&#x65F6;&#x4F7F;&#x7528;&#x4FC4;&#x52D2;&#x5188;&#x5DDE;&#x7EFF; BAPTA 5N &#x7684;&#x4F4E;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x6307;&#x6807;&#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x3002;&#x7535;&#x8BAF;&#x5C40;&#x957F;&#x51F8;&#x8F6E;&#x8367;&#x5149;&#x589E;&#x52A0;&#x671F;&#x95F4; 200 ms &#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#xFF0C;&#x4F46;&#x7136;&#x540E;&#x7EE7;&#x7EED;&#x589E;&#x52A0;&#x5728;&#x968F;&#x540E;&#x7684; 500 ms&#xFF0C;&#x5373;&#x4F7F;&#x603B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9499;&#x843D;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x65F6;&#x5019;&#x3002;&#x5728;&#x63A5;&#x4E0B;&#x6765;&#x7684;&#x51E0;&#x79D2;&#x4E2D; TA &#x51F8;&#x8F6E;&#x8367;&#x5149;&#x8DCC;&#x5012;&#x4E86;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E00;&#x4E2A;&#x65B0;&#x7684;&#x63D0;&#x5347;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x6301;&#x7EED;&#x4E86;&#x51E0;&#x4E2A;&#x51E0;&#x5341;&#x79D2;&#x7684;&#x6C34;&#x5E73;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x5217;&#x706B;&#x8F66;&#x7684;&#x8BF1;&#x53D1;&#x4E00;&#x7CFB;&#x5217;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x9499;&#x53D8;&#x5316;&#x7684; depolarizations TA &#x51F8;&#x8F6E;&#x8367;&#x5149;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#x6709;&#x4EBA;&#x706B;&#x8F66;&#x7684;&#x6301;&#x7EED;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x8BB8;&#x591A;&#x6570;&#x5341;&#x79D2;&#x4E4B;&#x540E;&#x3002;&#x5927;&#x5927;&#x5BF9;&#x5E94;&#x7684;&#x808C;&#x7403;&#x86CB;&#x767D;&#x8F7B;&#x94FE;&#x6FC0;&#x9176;&#x9499;&#x8C03;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x5408;&#x57DF;&#x80BD;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x589E;&#x52A0;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684; TA &#x51F8;&#x8F6E;&#x8367;&#x5149;&#x589E;&#x52A0;&#x548C;&#x51CF;&#x7F13;&#x8367;&#x5149;&#x968F;&#x540E;&#x5012;&#x53F0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x89E3;&#x91CA; TA &#x51F8;&#x8F6E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x53CD;&#x6620;&#x6162;&#x7684;&#x7F13;&#x6162;&#x590D;&#x82CF;&#x90E8;&#x5206;&#x6E38;&#x79BB;&#x9499; &mdash; &mdash; &#x9499; &mdash; &mdash; &#x9499;&#x8C03;&#x7D20;&#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x7ECF;&#x8FC7;&#x7B80;&#x77ED;&#x7684;&#x7535;&#x6D3B;&#x6027;&#x9499;&#x8C03;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0E;&#x9499;&#x8C03;&#x7D20;&#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x6301;&#x7EED;&#x5927;&#x7EA6;&#x4E00;&#x5206;&#x949F;&#x3002;

&#x9499;&#x8C03;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x5927;&#x9F20;&#x611F;&#x89C9;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x9499;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x96C6;&#x6210;&#x3002;

We have used the fluorescently labelled calmodulin TA-CaM to follow calmodulin activation during depolarization of adult rat sensory neurons. Calcium concentration was measured simultaneously using the low affinity indicator Oregon Green BAPTA 5N. TA-CaM fluorescence increased during a 200-ms depolarization but then continued to increase during the subsequent 500 ms, even though total cell calcium was falling at this time. In the next few seconds TA-CaM fluorescence fell, but to a new elevated level that was then maintained for several tens of seconds. During a train of depolarizations that evoked a series of largely independent calcium changes TA-CaM fluorescence was in contrast raised for the duration of the train and for many tens of seconds afterwards. The presence of a peptide corresponding to the calmodulin binding domain of myosin light chain kinase significantly increased the depolarization-induced TA-CaM fluorescence increase and slowed the subsequent fall of fluorescence. We interpret the slow recovery component of the TA-CaM signal as reflecting the slow dissociation of calcium--calmodulin--calmodulin binding protein complexes. Our results show that after brief electrical activity calmodulin's interaction with calmodulin binding proteins persists for approximately one minute.

Integration of calcium signals by calmodulin in rat sensory neurons.

Nous avons utilis&#xE9; le marquage fluorescent calmoduline TA-CaM &#xE0; suivre d&#x26;#39;activation calmoduline pendant la d&#xE9;polarisation des neurones sensoriels de rat adulte. La concentration en calcium a &#xE9;t&#xE9; mesur&#xE9;e en utilisant simultan&#xE9;ment la faible affinit&#xE9; indicateur Oregon Green BAPTA 5N. TA-CaM fluorescence a augment&#xE9; au cours d&#x26;#39;une d&#xE9;polarisation de 200 ms, mais a ensuite continu&#xE9; &#xE0; augmenter au cours de l&#x26;#39;apr&#xE8;s 500 ms, m&#xEA;me si le calcium cellulaire total tombait &#xE0; ce moment. Dans les secondes qui suivent TA-CaM fluorescence est tomb&#xE9;, mais &#xE0; un nouveau niveau &#xE9;lev&#xE9;, qui a ensuite &#xE9;t&#xE9; maintenu pendant plusieurs dizaines de secondes. Au cours d&#x26;#39;un train de d&#xE9;polarisations qui &#xE9;voquaient une s&#xE9;rie de changements de calcium en grande partie ind&#xE9;pendants TA-CaM fluorescence a &#xE9;t&#xE9; en revanche soulev&#xE9; pour la dur&#xE9;e du train et pour plusieurs dizaines de secondes plus tard. La pr&#xE9;sence d&#x26;#39;un peptide correspondant &#xE0; la calmoduline domaine de liaison de la kinase cha&#xEE;ne l&#xE9;g&#xE8;re de myosine augment&#xE9; de fa&#xE7;on significative la d&#xE9;polarisation induite par TA-CaM augmentation de fluorescence et un ralentissement de la baisse subs&#xE9;quente de la fluorescence. Nous interpr&#xE9;tons la composante lente reprise du signal TA-CaM comme refl&#xE9;tant la dissociation lente de calcium - calmoduline - complexes calmoduline de liaison aux prot&#xE9;ines. Nos r&#xE9;sultats montrent que, apr&#xE8;s l&#x26;#39;interaction br&#xE8;ve calmoduline activit&#xE9; &#xE9;lectrique avec des prot&#xE9;ines de liaison calmoduline persiste pendant environ une minute.

Int&#xE9;gration des signaux calciques par la calmoduline chez le rat neurones sensoriels

Integration von Calcium-Signale durch Calmodulin in sensorischen Neuronen Ratte.

Abbiamo usato la calmodulina fluorescente coniugato TA-CaM per seguire attivazione calmodulina durante la depolarizzazione dei neuroni sensoriali di ratto adulto. Concentrazione di calcio &egrave; stata misurata simultaneamente utilizzando l&#39;indicatore di bassa affinit&agrave; Oregon Green BAPTA 5N. Fluorescenza TA-CaM aumentato durante una depolarizzazione di 200 ms, ma poi ha continuato ad aumentare durante i successivi 500 ms, anche se il calcio totale di cellule stava cadendo in questo momento. Entro pochi secondi fluorescenza TA-CaM &egrave; caduto, ma a un nuovo elevato livello che &egrave; stato poi mantenuto per diverse decine di secondi. Durante un treno di depolarizations che evoca una serie di modifiche in gran parte indipendenti calcio fluorescenza TA-CaM &egrave; stata sollevata in contrasto per tutta la durata del treno e per molte decine di secondi dopo. La presenza di un peptide corrispondente al dominio calmodulin binding della chinasi della catena leggera della miosina significativamente aumentato l&#39;aumento di fluorescenza indotta depolarizzazione TA-CaM e rallentato la successiva caduta di fluorescenza. Interpretiamo il componente lenta ripresa del segnale TA-CaM come riflettendo la lenta dissociazione del calcio - calmodulina - complessi di proteina calmodulin binding. I nostri risultati mostrano che, dopo l&#39;interazione di attivit&agrave; elettrica breve calmodulina con calmodulina proteine di legame persistono per circa un minuto.

Integrazione dei segnali di calcio da calmodulina nei neuroni sensoriali di ratto.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x6210;&#x4F53;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x611F;&#x899A;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x6642;&#x306E;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306B;&#x5F93;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;TA-CAM&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x4F4E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6A19;&#x8B58;&#x30AA;&#x30EC;&#x30B4;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EA;&#x30FC;&#x30F3;BAPTA 5N&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002; TA-CAM&#x86CD;&#x5149;&#x306F;200 ms&#x306E;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x3001;&#x7DCF;&#x7D30;&#x80DE;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x6642;&#x70B9;&#x3067;&#x843D;&#x3061;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;500&#x30DF;&#x30EA;&#x79D2;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x7D9A;&#x3051;&#x305F;&#x3002;&#x6B21;&#x306E;&#x6570;&#x79D2;&#x3067;TA-CAM&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x306F;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x6570;&#x5341;&#x79D2;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7DAD;&#x6301;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x9AD8;&#x67B6;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x3002;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x306F;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x4E00;&#x9023;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x3092;&#x8A98;&#x767A;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x306E;&#x5217;&#x8ECA;&#x306E;&#x9593;&#x306B;TA-CAM&#x86CD;&#x5149;&#x306F;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x96FB;&#x8ECA;&#x306E;&#x671F;&#x9593;&#x4E2D;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x6570;&#x79D2;&#x6570;&#x5341;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x63D0;&#x8D77;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30DF;&#x30AA;&#x30B7;&#x30F3;&#x8EFD;&#x9396;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x304C;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x8A98;&#x767A;&#x6027;TA-CAM&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;&#x79CB;&#x3092;&#x9045;&#x3089;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3; -   - &#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x9045;&#x3044;&#x89E3;&#x96E2;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;TA-CAM&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x56DE;&#x5FA9;&#x306E;&#x9045;&#x308C;&#x6210;&#x5206;&#x3092;&#x89E3;&#x91C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x7C21;&#x5358;&#x306A;&#x96FB;&#x6C17;&#x7684;&#x6D3B;&#x52D5;&#x5F8C;&#x306E;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x30AB;&#x30EB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x7D04;1&#x5206;&#x9593;&#x7D9A;&#x304F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

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&#xC131;&#xC778; &#xC950; &#xAC10;&#xAC01; &#xB274;&#xB7F0;&#xC758; depolarization &#xC911; calmodulin &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xBD99;&#xC77C; &#xC774;&#xB77C;&#xB294; calmodulin TA &#xCEA0; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xCE7C;&#xC298; &#xB18D;&#xB3C4; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC624; &#xB808; &#xACE4; &#xADF8;&#xB9B0; BAPTA 5N &#xB0AE;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xD45C;&#xC2DC;&#xAE30;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCE21;&#xC815; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB530; &#xCEA0; &#xD615;&#xAD11; 200 ms depolarization &#xB3D9;&#xC548; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xCD1D; &#xC140; &#xCE7C;&#xC298;&#xC774; &#xC774;&#xBC88;&#xC5D0; &#xB5A8;&#xC5B4;&#xC9C0;&#xB294; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xB354;&#xB77C;&#xB3C4; &#xB2E4;&#xC74C; &#xD6C4;&#xC18D; 500 &#xBC00;&#xB9AC;&#xCD08; &#xB3D9;&#xC548; &#xC99D;&#xAC00; &#xACC4;&#xC18D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xC74C; &#xBA87; &#xCD08; &#xB3D9;&#xC548; &#xB530; &#xCEA0; &#xD615;&#xAD11; &#xAC10;&#xC18C;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E4;&#xC74C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC218;&#xC2ED; &#xCD08;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xC9C0; &#xAD00;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xC218;&#xC900; &#xB192;&#xC740;. &#xC8FC;&#xB85C; &#xB3C5;&#xB9BD; &#xCE7C;&#xC298; &#xBCC0;&#xD654;&#xC758; &#xC2DC;&#xB9AC;&#xC988;&#xB97C; &#xAC16;&#xB294; depolarizations&#xC758; &#xAE30;&#xCC28; &#xC911; &#xB530; &#xCEA0; &#xD615;&#xAD11; &#xBC18;&#xBA74; &#xC5F4;&#xCC28;&#xC758; &#xAE30;&#xAC04; &#xBC0F; &#xB9CE;&#xC740; &#xC218;&#xC2ED; &#xCD08; &#xD6C4;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xC0DD;. &#xD06C;&#xAC8C; myosin &#xBE5B; &#xCCB4;&#xC778; &#xD0A4;&#xC758; calmodulin &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xD558;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC; &#xB530; &#xCEA0; &#xD615;&#xAD11; depolarization &#xC720;&#xBC1C; &#xC99D;&#xAC00; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xD615;&#xAD11;&#xC758; &#xD6C4;&#xC18D;&#xAC00; &#xB454;&#xD654;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCC9C;&#xCC9C;&#xD788; &#xBC18;&#xC601;&#xC73C;&#xB85C; &#xB530; &#xCEA0; &#xC2E0;&#xD638;&#xC758; &#xB290;&#xB9B0; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C; &#xD574;&#xC11D; &#xBD84;&#xB9AC; &#xCE7C;&#xC298;-calmodulin-calmodulin &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; calmodulin&#xC640; calmodulin &#xAC04;&#xB7B5; &#xD55C; &#xC804;&#xAE30; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD6C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC720;&#xC9C0; &#xB418;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC57D; 1 &#xBD84;&#xAC04; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Calmodulin &#xC950; &#xAC10;&#xAC01; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCE7C;&#xC298; &#xC2E0;&#xD638;&#xC758; &#xD1B5;&#xD569;.

Hemos utilizado la etiqueta fluorescente calmodulina TA-CAM para seguir la activaci&#xF3;n de la calmodulina durante la despolarizaci&#xF3;n de las neuronas sensoriales de rata adulta. La concentraci&#xF3;n de calcio se midi&#xF3; simult&#xE1;neamente utilizando el indicador de baja afinidad Oregon Green BAPTA 5N. TA-CAM de fluorescencia se increment&#xF3; durante una despolarizaci&#xF3;n de 200 ms, pero luego sigui&#xF3; en aumento durante el posterior de 500 ms, a pesar de que el calcio total de c&#xE9;lulas fue cayendo en este momento. En los pr&#xF3;ximos segundos TA-CAM de fluorescencia se redujo, pero a un nuevo nivel elevado, que se mantuvo luego de varias decenas de segundos. Durante un tren de despolarizaciones que evocaban una serie de cambios de calcio en gran medida independientes TA-CAM fluorescencia fue en contraste planteado por la duraci&#xF3;n del tren y durante muchas decenas de segundos despu&#xE9;s. La presencia de un p&#xE9;ptido correspondiente al dominio de uni&#xF3;n de calmodulina quinasa miosina cadena ligera aument&#xF3; significativamente la despolarizaci&#xF3;n inducida por TA-CAM aumento de fluorescencia y redujo la posterior ca&#xED;da de la fluorescencia. Nosotros interpretamos el componente de recuperaci&#xF3;n lenta de la se&#xF1;al de TA-CAM como reflejo de la lenta disociaci&#xF3;n del calcio - calmodulina - complejos de la prote&#xED;na de uni&#xF3;n de calmodulina. Nuestros resultados muestran que despu&#xE9;s de la interacci&#xF3;n de calmodulina breve la actividad el&#xE9;ctrica de las prote&#xED;nas de uni&#xF3;n de calmodulina persiste durante aproximadamente un minuto.

Integraci&#xF3;n de las se&#xF1;ales de calcio por la calmodulina en neuronas sensitivas de rata

&#x5BF9;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x7684;&#x5F53;&#x524D;&#x529F;&#x80FD;&#x635F;&#x5931;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x9700;&#x8981;&#x6CE8;&#x610F;&#x7684;&#x4E00;&#x70B9;&#x662F;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x901A;&#x5E38;&#x4F1A;&#x4E2D;&#x65AD;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x4ECE;&#x4E00;&#x5F00;&#x59CB;&#x3002;&#x5C1D;&#x8BD5;&#x7814;&#x7A76;&#x4EE5;&#x540E;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x65F6;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x51FA;&#x73B0;&#x95EE;&#x9898;&#x3002;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x8BD5;&#x5242;&#x7EB3;&#x5165;&#x591A;&#x4EE5;&#x540E;&#x53D1;&#x80B2;&#x9636;&#x6BB5;&#x7684;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7684;&#x5148;&#x524D;&#x5DF2;&#x8BC1;&#x660E;&#x65F6;&#x7A7A;&#x5206;&#x5E03;&#x7279;&#x5F81;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x65F6;&#x95F4;&#x5206;&#x8FA8;&#x635F;&#x5931;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#x5206;&#x6790;&#x5F3A;&#x5927;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x8BD5;&#x56FE;&#x8BC1;&#x660E;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x53D1;&#x80B2;&#x65F6;&#x95F4; &mdash; &mdash; &#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7597;&#x6548;&#xFF0C;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x89C6;&#x89C9;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x521D;&#x59CB;&#x53D1;&#x5C55;-&#x6211;&#x4EEC;&#x505A;&#x7684;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x6548;&#x7387;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8868;&#x5F81;&#x8DE8;&#x591A;&#x4E2A;&#x53D1;&#x5C55;&#x9636;&#x6BB5;&#xFF0C;24 &#x65E5;&#x81F3; 96 h postfertilization&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x8BE5;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x662F;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x4EA4;&#x4ED8;&#x7ED9;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x5728;&#x591A;&#x4E2A;&#x53D1;&#x5C55;&#x6B65;&#x9AA4;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; 24&#x3001; 48 &#x6216; 96 h postfertilization &#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x8D28;&#x7C92;&#x3002;&#x4ECE;&#x7535;&#x6FC0;&#x8F6C;&#x5316;&#x8D28;&#x7C92;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x662F;&#x5728; 24 &#x5C0F;&#x65F6;&#x5185;&#x6700;&#x5927;&#x548C;&#x91CD;&#x8981;&#x548C;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x770B;&#x5230;&#x5185; 6 h.&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x4F20;&#x9001;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x8D28;&#x7C92; &#xFF08;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x548C; mCherry&#xFF09;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5171;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E2D; 97%&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x6700;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x5C06; siRNA &#x8BD5;&#x5242;&#x3001; &#x9020;&#x6210; 84%&#x7EC4;&#x5408;&#x5F0F;&#x7684;&#x9776;&#x86CB;&#x767D; &#xFF08;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;)&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x7528;&#x4E8E;&#x63D0;&#x4F9B;&#x57FA;&#x4E8E; DNA &#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x8D28;&#x7C92;&#x548C; RNA &#x5E72;&#x6270;&#x4E3A;&#x57FA;&#x7840;&#x529F;&#x80FD;&#x635F;&#x5931;&#x7684;&#x8BD5;&#x5242;&#x548C;&#x5C55;&#x54C1;&#x7684;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#xFF0C;&#x662F;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x5206;&#x8FA8;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x8C03;&#x67E5;&#x89C6;&#x89C9;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236;&#x3002;

&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7684;&#x65F6;&#x7A7A;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#xFF1A; &#x65F6;&#x95F4;&#x5206;&#x8FA8;&#x635F;&#x5931;&#x51FD;&#x6570;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

One caveat to current loss-of-function approaches in zebrafish is that they typically disrupt gene function from the beginning of development. This can be problematic when attempting to study later developmental events. In vivo electroporation is a method that has been shown to be effective at incorporating reagents into the developing nervous system at multiple later developmental stages. The temporal and spatial characteristics of in vivo electroporation that have been previously demonstrated suggest that this could be a powerful approach for time-resolved loss-of-function analysis. Here, in an attempt to demonstrate the efficacy of this approach for analysis of a specific developmental timeframe--that of initial development of the zebrafish visual system-we have done a systematic characterization of the efficiency of in vivo electroporation in zebrafish across multiple developmental stages, from 24 to 96 h postfertilization. We show that electroporation is efficient at delivering expression plasmids to large numbers of neurons at multiple developmental steps, including 24, 48, or 96 h postfertilization. Expression from electroporated plasmids is maximal within 24 h, and significant and useful expression is seen within 6 h. Electroporation can be used to deliver two separate expression plasmids (green fluorescent protein and mCherry), resulting in coexpression in 97% of cells. Most importantly, electroporation can be used to incorporate siRNA reagents, resulting in 84% knockdown of a target protein (green fluorescent protein). In conclusion, in vivo electroporation is an effective method for delivering both DNA-based expression plasmids and RNA interference-based loss-of-function reagents, and exhibits the appropriate characteristics to be useful as a time-resolved genetic approach to investigate the molecular mechanisms of visual system development.

The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss of function.

Une mise en garde &#xE0; courants de perte de fonction des approches chez le poisson z&#xE8;bre est qu&#x26;#39;elles perturbent la fonction des g&#xE8;nes depuis le d&#xE9;but du d&#xE9;veloppement. Cela peut &#xEA;tre probl&#xE9;matique lorsque l&#x26;#39;on tente d&#x26;#39;&#xE9;tudier les &#xE9;v&#xE9;nements tard de d&#xE9;veloppement. En &#xE9;lectroporation in vivo est une m&#xE9;thode qui a &#xE9;t&#xE9; montr&#xE9; pour &#xEA;tre efficace &#xE0; incorporer des r&#xE9;actifs dans le syst&#xE8;me nerveux en d&#xE9;veloppement &#xE0; plusieurs stades de d&#xE9;veloppement plus tard. Les caract&#xE9;ristiques temporelles et spatiales de &#xE9;lectroporation in vivo qui ont &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;c&#xE9;demment d&#xE9;montr&#xE9; sugg&#xE8;rent que cela pourrait &#xEA;tre une approche puissante pour r&#xE9;solue en temps de perte de fonction d&#x26;#39;analyse. Ici, dans une tentative pour d&#xE9;montrer l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de cette approche pour l&#x26;#39;analyse d&#x26;#39;un calendrier pr&#xE9;cis de d&#xE9;veloppement - celle du d&#xE9;veloppement initial du poisson-z&#xE8;bre visuelle du syst&#xE8;me que nous avons fait une caract&#xE9;risation syst&#xE9;matique de l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de &#xE9;lectroporation in vivo chez le poisson z&#xE8;bre &#xE0; travers de multiples stades de d&#xE9;veloppement , 24 &#xE0; 96 h post-f&#xE9;condation. Nous montrons que l&#x26;#39;&#xE9;lectroporation est efficace &#xE0; la prestation des plasmides d&#x26;#39;expression &#xE0; un grand nombre de neurones &#xE0; plusieurs &#xE9;tapes de d&#xE9;veloppement, y compris les 24, 48, ou 96 h post-f&#xE9;condation. Expression &#xE0; partir de plasmides &#xE9;lectropor&#xE9;es est maximale dans les 24 h, et une expression significative et utile est vu dans les 6 h. L&#x26;#39;&#xE9;lectroporation peut &#xEA;tre utilis&#xE9; pour livrer deux plasmides d&#x26;#39;expression distincts (prot&#xE9;ine fluorescente verte et mCherry), r&#xE9;sultant en coexpression dans 97% des cellules. Plus important encore, l&#x26;#39;&#xE9;lectroporation peut &#xEA;tre utilis&#xE9;e pour incorporer des r&#xE9;actifs siRNA, r&#xE9;sultant en effet de choc de 84% d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine cible (green fluorescent protein). En conclusion, &#xE9;lectroporation in vivo est une m&#xE9;thode efficace pour d&#xE9;livrer les deux plasmides d&#x26;#39;expression bas&#xE9;s sur l&#x26;#39;ADN et l&#x26;#39;ARN interf&#xE9;rence bas&#xE9;e sur la perte de fonction des r&#xE9;actifs, et pr&#xE9;sente les caract&#xE9;ristiques appropri&#xE9;es pour &#xEA;tre utile comme r&#xE9;solue dans le temps approche g&#xE9;n&#xE9;tique pour &#xE9;tudier les m&#xE9;canismes mol&#xE9;culaires de d&#xE9;veloppement du syst&#xE8;me visuel.

La r&#xE9;solution temporelle de &#xE9;lectroporation in vivo chez le poisson z&#xE8;bre: une m&#xE9;thode d&#x26;#39;r&#xE9;solue dans le temps la perte de la fonction

Einen Vorbehalt zu aktuellen Loss of Function-Ans&auml;tze im Zebrafisch ist, dass sie in der Regel Genfunktion von Anfang der Entwicklung st&ouml;ren. Dies kann problematisch sein, wenn versucht wird, sp&auml;ter Entwicklungsst&ouml;rungen Ereignisse zu studieren. In-vivo Elektroporation ist eine Methode, die gezeigt worden ist, unter Einbeziehung von Reagenzien in das sich entwickelnde Nervensystem bei mehreren sp&auml;ter Entwicklungsstadien wirksam zu sein. Die zeitliche und r&auml;umliche Merkmale der in-vivo Elektroporation, die zuvor nachweislich schlagen vor, da&szlig; dies einen leistungsf&auml;higen Ansatz zur Zeit gel&ouml;st von Verlustfunktion Analyse sein k&ouml;nnte. Hier, in einem Versuch, die Wirksamkeit dieses Ansatzes f&uuml;r die Analyse von einem bestimmten Entwicklungsst&ouml;rungen Zeitrahmen--die erste Entwicklung des visuellen Systems Zebrafisch-haben wir eine systematische Charakterisierung der Effizienz der in-vivo Electroporation in Zebrafisch &uuml;ber mehrere Entwicklungsstadien von 24 bis 96 Stunden Postfertilization getan. Wir zeigen, dass die Elektroporation effizienter bei der Bereitstellung Ausdruck Plasmide an eine gro&szlig;e Anzahl von Neuronen auf mehrere Entwicklungsschritte, einschlie&szlig;lich 24, 48 oder 96 h Postfertilization ist. Ausdruck von Electroporated Plasmide wird innerhalb von 24 Stunden maximal und wichtige und n&uuml;tzliche Ausdruck erlebt innerhalb 6 h. Elektroporation kann zum liefern von zwei separaten Ausdruck Plasmide (gr&uuml;n fluoreszierendes Protein und mCherry), was zu Coexpression in 97 % der Zellen. Elektroporation ist vor allem einsetzbar, SiRNA-Reagenzien, die zu 84 % Niederschlag von einem Zielprotein (gr&uuml;n fluoreszierendes Protein) zu integrieren. Abschlie&szlig;end in-vivo Elektroporation ist eine wirksame Methode zur &Uuml;bermittlung von DNA-basierte Ausdruck Plasmide und RNA-Interferenz-basierten Verlustfunktion von Reagenzien und weist die entsprechenden Eigenschaften als Zeit aufgel&ouml;st genetischer Ansatz untersuchen die molekularen Mechanismen der Entwicklung des visuellen Systems n&uuml;tzlich zu sein.

Die zeitliche Aufl&ouml;sung der in-vivo Electroporation in Zebrafisch: eine Methode zum Verlust der Funktion Zeit aufgel&ouml;st.

Un avvertimento agli attuali approcci perdita di funzione nello zebrafish &egrave; che essi in genere disturbare funzione del gene dall&#39;inizio dello sviluppo. Questo pu&ograve; essere problematico quando si tenta di studiare dopo gli eventi dello sviluppo. Elettroporazione in vivo &egrave; un metodo che ha dimostrato di essere efficace a integrare i reagenti nella sviluppo del sistema nervoso a pi&ugrave; fasi pi&ugrave; tardi dello sviluppo. Le caratteristiche temporali e spaziali di elettroporazione in vivo che sono state dimostrate in precedenza suggeriscono che questo potrebbe essere un approccio potente per l&#39;analisi di perdita di funzione time-resolved. Qui, nel tentativo di dimostrare l&#39;efficacia di questo approccio per l&#39;analisi di un calendario specifico dello sviluppo - che di sviluppo iniziale del sistema visivo Danio rerio-abbiamo fatto una caratterizzazione sistematica dell&#39;efficienza della elettroporazione in vivo in zebrafish attraverso pi&ugrave; fasi di sviluppo, da 24 a postfertilization 96 h. Mostriamo che elettroporazione &egrave; efficiente nel fornire plasmidi di espressione a un gran numero di neuroni in pi&ugrave; passaggi dello sviluppo, tra cui 24, 48 o postfertilization 96 h. Espressione da electroporated plasmidi &egrave; massima entro 24 h, e utile e significativa espressione &egrave; visto entro 6 h. elettroporazione pu&ograve; essere utilizzato per trasportare due plasmidi espressione separata (proteina fluorescente verde e mCherry), con conseguente coexpression nel 97% delle cellule. Soprattutto, elettroporazione pu&ograve; essere utilizzato per incorporare i reagenti siRNA, con conseguente atterramento 84% di una proteina dell&#39;obiettivo (green fluorescent protein). In conclusione, elettroporazione in vivo &egrave; un metodo efficace per la consegna sia espressione basata su DNA plasmidi e reagenti di perdita di funzione basata su interferenza RNA ed esibisce le caratteristiche appropriate per essere utile come un approccio genetico time-resolved per indagare i meccanismi molecolari di sviluppo del sistema visivo.

La risoluzione temporale di elettroporazione in vivo in zebrafish: un metodo per la perdita della funzione time-resolved.

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- &#x30BC;&#x30D6;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E5;&#x306E;&#x8996;&#x899A;&#x306E;&#x521D;&#x671F;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x767A;&#x9054;&#x6BB5;&#x968E;&#x3092;&#x8D8A;&#x3048;&#x3066;&#x30BC;&#x30D6;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E5;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;in vivo&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x306E;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;24&#x301C;96&#x6642;&#x9593;postfertilization&#x304B;&#x3089;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;24&#x3001;48&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;96&#x6642;&#x9593;postfertilization&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x5927;&#x91CF;&#x306B;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3002;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;24&#x6642;&#x9593;&#x4EE5;&#x5185;&#x306B;&#x6700;&#x5927;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x91CD;&#x8981;&#x304B;&#x3064;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x5F0F;&#x306F;6&#x6642;&#x9593;&#x4EE5;&#x5185;&#x306B;&#x898B;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;97&#xFF05;&#x3067;&#x5171;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x5225;&#x3005;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x3092;&#xFF08;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;mCherry&#xFF09;&#x3001;&#x914D;&#x4FE1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x3082;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306E;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF09;&#x306E;84&#xFF05;&#x306E;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;siRNA&#x306E;&#x8A66;&#x85AC;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3080;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;in vivo&#x3067;&#x306E;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;DNA&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x304A;&#x3088;&#x3073;RNA&#x5E72;&#x6E09;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x55AA;&#x5931;&#x8A66;&#x85AC;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x5206;&#x5B50;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3001;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x8996;&#x899A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3002;

&#x30BC;&#x30D6;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E5;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D3;&#x30DC;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#xFF1A;&#x95A2;&#x6570;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x6D88;&#x5931;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;

Zebrafish&#xC758; &#xD604;&#xC7AC; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC190;&#xC2E4; &#xC811;&#xADFC; &#xD55C; &#xACBD;&#xACE0;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAE30;&#xB2A5; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xC2DC;&#xC791; &#xBD80;&#xBD84;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xB2E8;. &#xBC1C;&#xB2EC; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; &#xB098;&#xC911;&#xC744; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xD558;&#xB824;&#xACE0; &#xD560; &#xB54C;&#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Vivo&#xC5D0;&#xC11C; electroporation &#xC5EC;&#xB7EC; &#xB098;&#xC911; &#xBC1C;&#xB2EC; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC; &#xC57D; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xC2E0; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC73C;&#xB85C; &#xD1B5;&#xD569;&#xC5D0; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xBC0F; &#xACF5;&#xAC04;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131;&#xC758; in vivo electroporation &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC99D;&#xBA85; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xC774; &#xC2DC;&#xAC04; &#xD655;&#xC778; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC190;&#xC2E4; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xC218; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xC815; &#xBC1C;&#xB2EC; &#xAE30;&#xAC04;-&#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD6A8;&#xB2A5;&#xC744; &#xC785;&#xC99D; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5EC;&#xAE30; zebrafish &#xBE44;&#xC8FC;&#xC5BC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xCD08;&#xAE30; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758;-&#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; 96 h postfertilization 24&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC1C;&#xB2EC; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; zebrafish in vivo electroporation &#xD6A8;&#xC728; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xD588;&#xB294;&#xC9C0;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8; electroporation &#xC2DD; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; 24, 48, 96 h postfertilization &#xB4F1; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xD070; &#xC22B;&#xC790;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Electroporated &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xB300; 24 &#xC2DC;&#xAC04; &#xC774;&#xB0B4;&#xB294; &#xACE0; &#xC911;&#xC694; &#xD558; &#xACE0; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xC2DD; Electroporation &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xC2DD; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; (&#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; mCherry)&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; 6 &#xD5E4; &#xB0B4; &#xBCFC; &#xC140;&#xC758; 97%&#xC5D0; coexpression&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C;. &#xAC00;&#xC7A5; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, electroporation &#xD1B5;&#xD569; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;)&#xC758; 84% &#xCD5C;&#xC800;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C; siRNA &#xC2DC; &#xC57D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB05D;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; electroporation &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; DNA &#xAE30;&#xBC18; &#xC2DD; &#xBC0F; RNA &#xAC04;&#xC12D; &#xAE30;&#xBC18; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC190;&#xC2E4; &#xC57D;&#xC744; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95; &#xC774;&#xBA70; &#xBE44;&#xC8FC;&#xC5BC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC;&#xD560; &#xC2DC;&#xAC04; &#xD574;&#xACB0; &#xC720;&#xC804; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC6A9; &#xD558; &#xAC8C; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC804;&#xC2DC;.

Zebrafish in vivo electroporation &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;: &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xC190;&#xC2E4; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC774; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;.

Una advertencia a los actuales la p&#xE9;rdida de la funci&#xF3;n de los enfoques en el pez cebra es que suelen perturbar la funci&#xF3;n de genes desde el principio del desarrollo. Esto puede ser problem&#xE1;tico cuando se trata de estudiar los acontecimientos posteriores del desarrollo. En electroporaci&#xF3;n in vivo es un m&#xE9;todo que ha demostrado ser eficaz en la incorporaci&#xF3;n de los reactivos en el sistema nervioso en desarrollo en m&#xFA;ltiples etapas de desarrollo. Las caracter&#xED;sticas temporales y espaciales de electroporaci&#xF3;n in vivo que hayan sido previamente demostrado que este sistema podr&#xED;a ser una estrategia poderosa para resuelta en el tiempo de p&#xE9;rdida de funci&#xF3;n de an&#xE1;lisis. Aqu&#xED;, en un intento de demostrar la eficacia de este enfoque para el an&#xE1;lisis de un per&#xED;odo de tiempo espec&#xED;fico del desarrollo - el del desarrollo inicial de la representaci&#xF3;n visual del pez cebra el sistema que hemos hecho una caracterizaci&#xF3;n sistem&#xE1;tica de la eficiencia de la electroporaci&#xF3;n in vivo en el pez cebra a trav&#xE9;s de m&#xFA;ltiples etapas de desarrollo , 24 a 96 h postfertilizaci&#xF3;n. Se demuestra que la electroporaci&#xF3;n es eficiente en la entrega de los pl&#xE1;smidos de expresi&#xF3;n para un gran n&#xFA;mero de neuronas en varias etapas de desarrollo, incluyendo 24, 48 o 96 h postfertilizaci&#xF3;n. Expresi&#xF3;n de pl&#xE1;smidos electroporated es m&#xE1;xima a las 24 h, y la expresi&#xF3;n significativa y &#xFA;til se ve dentro de 6 horas. La electroporaci&#xF3;n se puede utilizar para entregar dos pl&#xE1;smidos de expresi&#xF3;n separados (prote&#xED;na fluorescente verde y mCherry), resultando en coexpresi&#xF3;n en el 97% de las c&#xE9;lulas. Lo m&#xE1;s importante, la electroporaci&#xF3;n se puede utilizar para incorporar los reactivos siRNA, resultando en 84% desmontables de una prote&#xED;na diana (prote&#xED;na fluorescente verde). En conclusi&#xF3;n, la electroporaci&#xF3;n in vivo es un m&#xE9;todo eficaz para la entrega de ambos basados &#x200B;&#x200B;en el ADN y pl&#xE1;smidos de expresi&#xF3;n de ARN de interferencia reactivos basados &#x200B;&#x200B;en la p&#xE9;rdida de funci&#xF3;n, y exhibe las caracter&#xED;sticas necesarias para ser &#xFA;tiles en el tiempo de resolverse enfoque gen&#xE9;tico para investigar los mecanismos moleculares del desarrollo del sistema visual.

La resoluci&#xF3;n temporal de electroporaci&#xF3;n in vivo en el pez cebra: un m&#xE9;todo para el turno de resolverse la p&#xE9;rdida de la funci&#xF3;n

&#xC18C;&#xAC1C;: &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; electroporation &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xC81C;&#xC5B4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; oligonucleotide &#xC2DC; &#xC57D; &#xB0A9;&#xD488;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. Zebrafish, in vivo electroporation&#xC740; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GFP) &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xC911;&#xCD94;&#xC5D0; &#xC804;&#xB2EC;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xC801;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xD2B9;&#xD788; 24 &#xC2DC;&#xAC04; post-fertilization (hpf)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xC791; zebrafish &#xD0DC;&#xC544;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xAD11;&#xC12C;&#xC720; tectum &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; electroporation &#xC218;&#xC815;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC811;&#xADFC;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; electroporation &#xC804;&#xADF9;&#xC740; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC800;&#xB834; &#xD55C; &#xC18C;&#xC7AC;&#xB85C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC0DD;&#xC131;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Microinjection midbrain &#xC2EC; &#xC2E4; &#xB4A4;&#xC5D0; electroporation &#xC804;&#xADF9;&#xC758; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xC704;&#xCE58;&#xB97C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; DNA&#xC758; &#xAD11;&#xC12C;&#xC720; tectum&#xC758; &#xD55C; &#xBC18;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB274;&#xB7F0;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAD11;&#xC12C;&#xC720; tectum &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xBC30;&#xC544;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xBC31;&#xBD84;&#xC728; (79%)&#xC5D0;&#xC11C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC774;&#xB807;&#xAC8C; &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC0C1;&#xC2E4; &#xC2DC; &#xC57D;, &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xCD5C;&#xC800;&#xC758;&#xC758; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xC81C;&#xC5B4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD558;&#xC2E4; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; electroporation zebrafish &#xAD11;&#xC12C;&#xC720; tectum &#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305;.

&#x7B80;&#x4ECB;&#xFF1A; &#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x662F;&#x4EA4;&#x4ED8;&#x7684;&#x8D28;&#x7C92;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x8BD5;&#x5242;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7CBE;&#x786E;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5728;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#xFF0C;&#x7279;&#x522B;&#x9002;&#x5408;&#x4E8E;&#x5411;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x56FD;&#x5BB6;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (GFP) &#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x3002;&#x6B64;&#x534F;&#x8BAE;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E86;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x4E13;&#x95E8;&#x9488;&#x5BF9;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x56FD;&#x5BB6;&#x7684;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x80DA;&#x80CE;&#x5F00;&#x59CB;&#x5728; 24 h post-fertilization (hpf) &#x9876;&#x76D6;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7535;&#x6781;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4ECE;&#x76F8;&#x5BF9;&#x5EC9;&#x4EF7;&#x7684;&#x6750;&#x6599;&#x5F88;&#x5BB9;&#x6613;&#x6784;&#x9020;&#x3002;&#x8D28;&#x7C92; DNA &#x5230;&#x8DDF;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7535;&#x6781;&#x7684;&#x7CBE;&#x786E;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x7684;&#x4E2D;&#x8111;&#x8111;&#x5BA4;&#x5FAE;&#x91CF;&#x6CE8;&#x5C04;&#x5141;&#x8BB8;&#x9488;&#x5BF9;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x53EA;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x534A;&#x7403;&#x7684;&#x524D;&#x89C6;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x6B64;&#x534F;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x524D;&#x89C6;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6BD4;&#x4F8B;&#x9AD8; (79%) &#x8868;&#x793A;&#x80DA;&#x80CE;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4E5F;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x540C;&#x65F6;&#x4F20;&#x9001;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x4E27;&#x5931;&#x7684;&#x8BD5;&#x5242;&#xFF0C;&#x5B83;&#x53EF;&#x4EE5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7CBE;&#x786E;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x63A7;&#x5236;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x5F0F;&#x3002;

&#x9488;&#x5BF9;&#x4F7F;&#x7528;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x7684;&#x6591;&#x9A6C;&#x9C7C;&#x89C6;&#x9876;&#x76D6;&#x3002;

INTRODUCTION: In vivo electroporation is a method for delivery of plasmids and other oligonucleotide reagents that offers precise temporal control. In zebrafish, in vivo electroporation is particularly well-suited to delivering green fluorescent protein (GFP) expression vectors to the developing central nervous system. This protocol describes a modification of in vivo electroporation that can be used to specifically target the developing optic tectum of zebrafish embryos beginning at 24 h post-fertilization (hpf). The electroporation electrodes required for this approach can be constructed easily from relatively inexpensive materials. Microinjection of plasmid DNA to the midbrain ventricle followed by precise positioning of the electroporation electrodes allows for the targeting of developing neurons in only one hemisphere of the optic tectum. Using this protocol, the optic tectum can be effectively targeted in a high percentage (79%) of expressing embryos. This method can also be used to simultaneously deliver expression vectors and loss-of-function reagents, which can provide precise temporal control of the knockdown of gene function.

Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.

INTRODUCTION: Dans &#xE9;lectroporation in vivo est une m&#xE9;thode pour la livraison de plasmides et d&#x26;#39;autres r&#xE9;actifs oligonucl&#xE9;otidiques qui offre un contr&#xF4;le pr&#xE9;cis du temporel. Chez le poisson z&#xE8;bre, &#xE9;lectroporation in vivo est particuli&#xE8;rement bien adapt&#xE9; &#xE0; la r&#xE9;alisation vertes fluorescentes vecteurs d&#x26;#39;expression de prot&#xE9;ines (GFP) pour le d&#xE9;veloppement du syst&#xE8;me nerveux central. Ce protocole d&#xE9;crit une modification de &#xE9;lectroporation in vivo qui peut &#xEA;tre utilis&#xE9; pour cibler sp&#xE9;cifiquement le tectum optique de d&#xE9;veloppement embryons de poisson z&#xE8;bre en commen&#xE7;ant &#xE0; 24 h apr&#xE8;s la f&#xE9;condation (HPF). Les &#xE9;lectrodes d&#x26;#39;&#xE9;lectroporation requis pour cette approche peut &#xEA;tre construit facilement &#xE0; partir de mat&#xE9;riaux relativement peu co&#xFB;teux. Microinjection d&#x26;#39;ADN plasmidique au ventricule du m&#xE9;senc&#xE9;phale suivie par un positionnement pr&#xE9;cis des &#xE9;lectrodes d&#x26;#39;&#xE9;lectroporation permet pour le ciblage des neurones d&#xE9;veloppement dans une seule h&#xE9;misph&#xE8;re de la toit optique. En utilisant ce protocole, le tectum optique peut &#xEA;tre efficacement cibl&#xE9;es dans un pourcentage &#xE9;lev&#xE9; (79%) d&#x26;#39;exprimer embryons. Cette m&#xE9;thode peut &#xE9;galement &#xEA;tre utilis&#xE9; pour diffuser simultan&#xE9;ment des vecteurs d&#x26;#39;expression et la perte de fonction des r&#xE9;actifs, qui peuvent fournir un contr&#xF4;le pr&#xE9;cis du temporel de l&#x26;#39;inactivation de la fonction des g&#xE8;nes.

Cibler le poisson-z&#xE8;bre Tectum optique utilisant &#xE9;lectroporation in vivo

Einleitung: In-vivo Elektroporation ist eine Methode f&uuml;r die Bereitstellung von Plasmiden und andere Oligonukleotid-Reagenzien, die genaue zeitliche Steuerung bietet. In-vivo Elektroporation eignet sich im Zebrafisch besonders die Lieferung Expressionsvektoren gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (GFP) in den Entwicklungsl&auml;ndern Zentralnervensystem. Dieses Protokoll beschreibt eine &Auml;nderung der in-vivo Elektroporation, die verwendet werden kann, um gezielt gegen die entwickelnden Optik Tectum Zebrafisch-Embryonen, die beginnend bei 24 h Post-fertilization (hpf). Die Elektroporation Elektroden f&uuml;r diesen Ansatz k&ouml;nnen leicht von relativ preiswerte Materialien konstruiert werden. Microinjection der Plasmid-DNA um die Mittelhirn-Ventrikel, gefolgt von der pr&auml;zisen Positionierung der Elektroporation Elektroden erm&ouml;glicht die gezielte Entwicklung von Neuronen nur eine Hemisph&auml;re von der Optik Tectum. Dieses Protokoll verwenden, kann die Optik Tectum effektiv in einem hohen Prozentsatz (79 %) auszudr&uuml;cken Embryonen ausgerichtet werden. Diese Methode kann auch verwendet werden, und liefert gleichzeitig Ausdruck Vektoren und Verlust der Funktion Reagenzien, die pr&auml;zise zeitliche Steuerung der Niederschlag der Genfunktion liefern k&ouml;nnen.

Im Visier der Zebrafisch Optik Tectum mit in-vivo Elektroporation.

Introduzione: elettroporazione In vivo &egrave; un metodo per la consegna di plasmidi e altri reagenti del oligonucleotide che offre un controllo temporale preciso. In zebrafish, elettroporazione in vivo &egrave; particolarmente adatto a fornire i vettori di espressione della proteina fluorescente verde (GFP) di sviluppo del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive una modifica di elettroporazione in vivo che pu&ograve; essere utilizzati per indirizzare specificamente la tectum ottica lo sviluppo degli embrioni di zebrafish cominciando a post-fertilization h 24 (hpf). Gli elettrodi di elettroporazione richiesti per questo approccio possono essere facilmente costruiti da materiali relativamente poco costosi. Microiniezione del DNA del plasmide al ventricolo mesencefalo seguito da un posizionamento preciso degli elettrodi elettroporazione permette per il targeting di sviluppare neuroni in un solo emisfero dell&#39;ottica tectum. Utilizzando questo protocollo, il tectum ottica pu&ograve; essere efficacemente mirati in un&#39;alta percentuale (79%) di esprimere gli embrioni. Questo metodo pu&ograve; essere utilizzato anche per fornire simultaneamente i vettori di espressione e perdita di funzione reagenti, che possono fornire un controllo temporale preciso di atterramento di funzione del gene.

Il Danio rerio optic tectum usando elettroporazione in vivo di targeting.

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Introducci&#xF3;n: En la electroporaci&#xF3;n in vivo es un m&#xE9;todo para la entrega de los pl&#xE1;smidos y otros reactivos de oligonucle&#xF3;tidos que ofrece un control temporal preciso. En el pez cebra, electroporaci&#xF3;n in vivo est&#xE1; particularmente bien adaptado a la entrega de prote&#xED;na verde fluorescente (GFP) vectores de expresi&#xF3;n para el desarrollo del sistema nervioso central. Este protocolo describe una modificaci&#xF3;n de la electroporaci&#xF3;n in vivo que se puede utilizar para apuntar espec&#xED;ficamente el tectum &#xF3;ptica de desarrollo de embriones de pez cebra a partir a las 24 horas post-fecundaci&#xF3;n (HPF). Los electrodos de electroporaci&#xF3;n necesarios para este m&#xE9;todo se pueden construir f&#xE1;cilmente a partir de materiales relativamente baratos. La microinyecci&#xF3;n de ADN del pl&#xE1;smido con el ventr&#xED;culo del cerebro medio seguido de la colocaci&#xF3;n precisa de los electrodos de electroporaci&#xF3;n permite la orientaci&#xF3;n de las neuronas en desarrollo en s&#xF3;lo un hemisferio del techo &#xF3;ptico. El uso de este protocolo, el techo &#xF3;ptico puede orientar de manera efectiva en un alto porcentaje (79%) de expresar embriones. Este m&#xE9;todo tambi&#xE9;n puede usarse para suministrar simult&#xE1;neamente vectores de expresi&#xF3;n y los reactivos p&#xE9;rdida de funci&#xF3;n, que pueden proporcionar un control preciso temporal de la ca&#xED;da de la funci&#xF3;n g&#xE9;nica.

John H. Horne

Department of Biology

Pace University

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

John H. Horne

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Pace University

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Department of Biology