Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Princeton University

&#x632F;&#x8361;&#x4E2D;&#x5F88;&#x5927;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4E0E;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x5173;&#x8054;&quot;&#x4EE3;&#x8C22;&#x5468;&#x671F;&#xFF0C;&quot;&#x901A;&#x5E38;&#x88AB;&#x89C6;&#x4E3A;&#x4EC5;&#x5728; prestarved&#x3001; &#x8FDE;&#x7EED;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9C7C;&#x7684; mRNA &#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x6765;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x632F;&#x8361;&#x53D1;&#x751F;&#x5728;&#x7ED8;&#x5236;&#x5728;&#x6052;&#x5316;&#x5668;&#x5448;&#x6307;&#x6570;&#x7EA7;&#x589E;&#x957F;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x6587;&#x5316;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5047;&#x8BBE;&#x3002;&#x4ECE;&#x540C;&#x6B65;&#x6587;&#x5316;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x6570;&#x636E;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x9884;&#x6D4B;&#x7684;&#x5206;&#x6CCC;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x6210;&#x5BF9;&#x4ECE;&#x91CD;&#x5408;&#x5916;&#x89C2;&#x3002;&#x9C7C;&#x7ED3;&#x679C;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x663E;&#x793A;&#x589E;&#x957F;&#x7F13;&#x6162;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x9650;&#x5236;&#x6216;&#x78F7;&#x9650;&#x5236;&#x5355;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x9884;&#x6D4B;&#x7684;&#x632F;&#x8361;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x51FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x5468;&#x671F;&#x662F;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7684;&#x5185;&#x5728;&#x5C5E;&#x6027;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x540C;&#x6B65;&#x6216;&#x5916;&#x90E8;&#x9650;&#x5236;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x78B3;&#x6E90;&#x3002;

&#x4EE3;&#x8C22;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x6216;&#x78F7;&#x9178;&#x4E0A;&#x6709;&#x9650;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x7A33;&#x6001;&#x7684;&#x4EBA;&#x53E3;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x5FAA;&#x73AF;&#x3002;

Oscillations in patterns of expression of a large fraction of yeast genes are associated with the "metabolic cycle," usually seen only in prestarved, continuous cultures of yeast. We used FISH of mRNA in individual cells to test the hypothesis that these oscillations happen in single cells drawn from unsynchronized cultures growing exponentially in chemostats. Gene-expression data from synchronized cultures were used to predict coincident appearance of mRNAs from pairs of genes in the unsynchronized cells. Quantitative analysis of the FISH results shows that individual unsynchronized cells growing slowly because of glucose limitation or phosphate limitation show the predicted oscillations. We conclude that the yeast metabolic cycle is an intrinsic property of yeast metabolism and does not depend on either synchronization or external limitation of growth by the carbon source.

Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.

Oscillations dans les modes d&#39;expression d&#39;une grande partie des g&egrave;nes de la levure sont associ&eacute;es avec le &laquo; cycle m&eacute;tabolique, &raquo; g&eacute;n&eacute;ralement vu seulement dans les cultures prestarved, continues de levure. Nous avons utilis&eacute; des poissons de l&#39;ARNm dans des cellules individuelles pour v&eacute;rifier l&#39;hypoth&egrave;se que ces oscillations se produisent dans les cellules provenant de cultures non synchronis&eacute;s en croissance exponentielle en ch&eacute;mostats. Donn&eacute;es d&#39;expression g&eacute;nique de cultures synchronis&eacute;es furent utilis&eacute;es pour pr&eacute;dire l&#39;apparition co&iuml;ncide d&#39;ARNm de paires de g&egrave;nes dans les cellules non synchronis&eacute;s. Analyse quantitative des r&eacute;sultats poisson montre que les cellules individuelles non synchronis&eacute;s de plus en plus lentement &agrave; cause de la limitation de la glyc&eacute;mie ou limitation de phosphate montrent les oscillations pr&eacute;dites. Nous concluons que le cycle m&eacute;tabolique de la levure est une propri&eacute;t&eacute; intrins&egrave;que du m&eacute;tabolisme de la levure et ne d&eacute;pend pas de la synchronisation ou limitation externe de la croissance par la source de carbone.

M&eacute;tabolique cyclisme dans les cellules de levure unique provenant de populations de stationnaire non synchronis&eacute;es limit&eacute;es sur le glucose ou le phosphate.

Schwingungen im Muster des Ausdrucks der ein gro&szlig;er Teil der Hefe-Gene sind &quot;metabolische Zyklus,&quot; in der Regel nur in prestarved, kontinuierliche Kulturen der Hefe gesehen zugeordnet. Wir verwendet Fisch von mRNA in einzelne Zellen, um die Hypothese zu testen, dass diese Schwingungen in Einzelzellen, gezeichnet von nicht synchronisierten Kulturen exponentiell in Chemostats passieren. Genexpression Daten aus synchronisierten Kulturen wurden verwendet, um zusammenfallenden Darstellung von mRNAs von Paaren der Gene in den Zellen nicht synchronisierten vorherzusagen. Quantitative Analyse der Fisch Ergebnisse zeigt, dass nicht synchronisierte Einzelzellen w&auml;chst langsam wegen Glukose Beschr&auml;nkung oder Phosphat-Beschr&auml;nkung die vorhergesagten Schwingungen zeigen. Wir schlie&szlig;en, dass der Hefe metabolische Zyklus eine intrinsische Eigenschaft des Hefe-Stoffwechsels ist und Synchronisierung oder externe Beschr&auml;nkung des Wachstums durch die Kohlenstoffquelle nicht abh&auml;ngig.

Metabolische Radfahren in einzelne Hefezellen nicht synchronisierten station&auml;ren Bev&ouml;lkerungen begrenzt auf Glukose oder Phosphat.

Oscillazioni nel pattern di espressione di una grande frazione dei geni di lievito sono associate con il &quot;ciclo metabolico,&quot; di solito visto solo nelle culture prestarved, continue di lievito. Abbiamo usato il pesce di mRNA nelle singole celle per testare l&#39;ipotesi che queste oscillazioni accadono in singole cellule provenienti da culture non sincronizzate cresce esponenzialmente in chemostati. Dati di espressione genica da colture sincronizzate sono stati utilizzati per predire coincida aspetto dei mRNAs da coppie di geni nelle cellule non sincronizzate. Analisi quantitativa dei risultati pesce dimostra che le singole celle non sincronizzate cresce lentamente a causa della limitazione di glucosio o la limitazione di fosfato Visualizza le oscillazioni predetta. Concludiamo che il ciclo metabolico di lievito &egrave; una propriet&agrave; intrinseca del metabolismo del lievito e non dipende dalla sincronizzazione o limitazione esterna della crescita con la fonte di carbonio.

Metabolica in bicicletta in cellule di lievito singolo non sincronizzate steady-state popolazioni limitate su glucosio o fosfato.

&#x9175;&#x6BCD;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x632F;&#x52D5;&#x300C;&#x306E;&#x307F; prestarved&#x3001;&#x9023;&#x7D9A;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;&#x57F9;&#x990A;&#x306F;&#x901A;&#x5E38;&#x898B;&quot;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x300D;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x632F;&#x52D5;&#x306F; chemostats &#x3067;&#x6307;&#x6570;&#x95A2;&#x6570;&#x7684;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x304C;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x306E;&#x6587;&#x5316;&#x304B;&#x3089;&#x63CF;&#x304B;&#x308C;&#x305F;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x8D77;&#x3053;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E; mRNA &#x306E;&#x9B5A;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x540C;&#x671F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6587;&#x5316;&#x304B;&#x3089;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7D44;&#x304B;&#x3089;&#x306E; Mrna &#x306E;&#x4E00;&#x81F4;&#x306E;&#x5916;&#x89B3;&#x3092;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9B5A;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3086;&#x3063;&#x304F;&#x308A;&#x3068;&#x6210;&#x9577;&#x3057;&#x3066;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x30BB;&#x30EB;&#x4E88;&#x6E2C;&#x306E;&#x632F;&#x52D5;&#x3067;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9175;&#x6BCD;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3057;&#x3001;&#x540C;&#x671F;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5916;&#x90E8;&#x5236;&#x9650;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x70AD;&#x7D20;&#x6E90;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3092;&#x7DE0;&#x7D50;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x4EE3;&#x8B1D;&#x5358;&#x4E00;&#x9175;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x9650;&#x5B9A;&#x672A;&#x540C;&#x671F;&#x306E;&#x5B9A;&#x5E38;&#x96C6;&#x56E3;&#x304B;&#x3089;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xD6A8; &#xBAA8; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD070; &#xBD84;&#xC218;&#xC758; &#xD45C;&#xD604;&#xC758; &#xD328;&#xD134;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4;&#xB3D9; &quot;&#xB300;&#xC0AC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;,&quot; &#xBCF4;&#xD1B5; &#xD6A8; prestarved, &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xB9CC; &#xBCFC; &#xC218;&#xC640; &#xAD00;&#xB828;&#xC774; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9C4;&#xB3D9; chemostats &#xAE30; &#xD558; &#xAE09;&#xC218;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB824;&#xC9C4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC140;&#xC5D0; Mrna&#xC758; &#xC0DD;&#xC120;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC30D;&#xC5D0;&#xC11C; Mrnas&#xC758; &#xC77C;&#xCE58; &#xBAA8;&#xC591;&#xC744; &#xC608;&#xCE21; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB41C; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xC81C;&#xD55C; &#xB610;&#xB294; &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xC81C;&#xD55C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xCC9C;&#xCC9C;&#xD788; &#xC131;&#xC7A5; &#xC608;&#xCE21;&#xB41C; &#xC9C4;&#xB3D9; &#xD45C;&#xC2DC; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACB0;&#xB860; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC740; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB300;&#xC0AC;&#xC758; &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC778; &#xC18D;&#xC131; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB610;&#xB294; &#xC678;&#xBD80; &#xD0C4;&#xC18C; &#xC18C;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC131;&#xC7A5; &#xD55C;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB300;&#xC0AC; &#xD55C; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xB610;&#xB294; &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xC81C;&#xD55C; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC548;&#xC815; &#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC758; &#xC778;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xB9C1;.

Las variaciones en los patrones de expresi&oacute;n de una gran parte de los genes de la levadura se asocian con el &quot;ciclo metab&oacute;lico,&quot; generalmente se observa s&oacute;lo en las culturas prestarved, continuas de levadura. Utilizamos peces de ARNm en c&eacute;lulas individuales para probar la hip&oacute;tesis de que estas oscilaciones ocurren en las c&eacute;lulas extra&iacute;das de culturas sincronizadas creciendo exponencialmente en chemostats. Datos de expresi&oacute;n g&eacute;nica de culturas sincronizadas fueron usados para predecir la aparici&oacute;n coincidente de mRNAs de pares de genes en las c&eacute;lulas no sincronizadas. An&aacute;lisis cuantitativo de los resultados de pescado demuestra que las c&eacute;lulas individuales sincronizadas creciendo lentamente debido a la limitaci&oacute;n de la glucosa o limitaci&oacute;n de fosfato Mostrar las oscilaciones previstas. Concluimos que el ciclo metab&oacute;lico de la levadura es una propiedad intr&iacute;nseca del metabolismo de la levadura y no depende de sincronizaci&oacute;n o limitaci&oacute;n externa de crecimiento por la fuente de carbono.

Metab&oacute;licos en las c&eacute;lulas de levadura sola en bicicleta de poblaciones de estado estacionario no sincronizadas limitadas en glucosa o fosfato.

A yeast strain lacking Met4p, the primary transcriptional regulator of the sulfur assimilation pathway, cannot synthesize methionine. This apparently simple auxotroph did not grow well in rich media containing excess methionine, forming small colonies on yeast extract/peptone/dextrose plates. Faster-growing large colonies were abundant when overnight cultures were plated, suggesting that spontaneous suppressors of the growth defect arise with high frequency. To identify the suppressor mutations, we used genome-wide single-nucleotide polymorphism and standard genetic analyses. The most common suppressors were loss-of-function mutations in OPI1, encoding a transcriptional repressor of phospholipid metabolism. Using a new system that allows rapid and specific degradation of Met4p, we could study the dynamic expression of all genes following loss of Met4p. Experiments using this system with and without Opi1p showed that Met4 activates and Opi1p represses genes that maintain levels of S-adenosylmethionine (SAM), the substrate for most methyltransferase reactions. Cells lacking Met4p grow normally when either SAM is added to the media or one of the SAM synthetase genes is overexpressed. SAM is used as a methyl donor in three Opi1p-regulated reactions to create the abundant membrane phospholipid, phosphatidylcholine. Our results show that rapidly growing cells require significant methylation, likely for the biosynthesis of phospholipids.

Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.

Une souche de levure sans Met4p, le principal r&eacute;gulateur transcriptionnel de la voie d&#39;assimilation de soufre, ne peut pas synth&eacute;tiser la m&eacute;thionine. Cette auxotrophe apparemment simple ne pousse pas bien dans un milieu riche contenant des exc&egrave;s m&eacute;thionine, formant de petites colonies sur les plaques de dextrose/peptone/Extrait de levure. Croissance rapide de grandes colonies &eacute;taient abondants lorsque les cultures une nuit ou Pluss ont &eacute;t&eacute; ensemenc&eacute;s, sugg&eacute;rant que les suppresseurs spontan&eacute;s de la d&eacute;fectuosit&eacute; de la croissance se posent avec haute fr&eacute;quence. Pour identifier les mutations de l&#39;&eacute;liminateur, nous avons utilis&eacute; le genome-wide single-nucleotide polymorphism et analyses g&eacute;n&eacute;tiques standard. Les suppresseurs plus communs &eacute;taient des mutations perte de fonction OPI1, codant un r&eacute;presseur transcriptionnel du m&eacute;tabolisme des phospholipides. &Agrave; l&#39;aide d&#39;un nouveau syst&egrave;me qui permet une d&eacute;gradation rapide et pr&eacute;cise de Met4p, nous pourrions &eacute;tudier l&#39;expression dynamique de tous les g&egrave;nes suite &agrave; perte de Met4p. Exp&eacute;riences &agrave; l&#39;aide de ce syst&egrave;me avec et sans Opi1p a montr&eacute; que Met4 active et Opi1p r&eacute;prime les g&egrave;nes qui maintiennent les niveaux de la S-ad&eacute;nosylm&eacute;thionine (SAM), le substrat pour la plupart des r&eacute;actions m&eacute;thyltransf&eacute;rase. Cellules d&eacute;pourvues Met4p poussent normalement quand une SAM est ajout&eacute; aux m&eacute;dias ou un des g&egrave;nes SAM synth&eacute;tase est surexprim&eacute;. SAM est utilis&eacute;e comme un donneur de m&eacute;thyl dans trois r&eacute;actions Opi1p r&eacute;glement&eacute;s pour cr&eacute;er le phospholipide de la membrane abondante, la phosphatidylcholine. Nos r&eacute;sultats montrent que les cellules en pleine croissance exigent importante m&eacute;thylation, probablement pour la biosynth&egrave;se des phospholipides.

R&eacute;gulation coordonn&eacute;e du m&eacute;tabolisme du soufre et phospholipides refl&egrave;te l&#39;importance de la m&eacute;thylation dans la croissance des levures.

Un ceppo di lievito privo di Met4p, il principale regolatore di transcriptional del percorso di assimilazione dello zolfo, non pu&ograve; sintetizzare la metionina. Questo apparentemente semplice auxotroph non ha fatto crescere bene in multimediali contenenti metionina in eccesso, formando piccole colonie su piastre di lievito peptone/estrarre/destrosio. Pi&ugrave; veloce crescita grandi colonie erano abbondanti quando culture durante la notte sono state placcate, suggerendo che soppressori spontanee del difetto di crescita si presentano con alta frequenza. Per identificare le mutazioni soppressore, abbiamo usato il polimorfismo a singolo nucleotide genome-wide e standard analisi genetiche. I soppressori pi&ugrave; comuni erano mutazioni con perdita di funzione nel OPI1, codifica un repressore trascrizionale del metabolismo di fosfolipidi. Utilizzando un nuovo sistema che permette la degradazione rapida e specifica di Met4p, noi potremmo studiare l&#39;espressione dinamica di tutti i geni in seguito perdita di Met4p. Esperimenti utilizzando questo sistema con e senza Opi1p ha mostrato che Met4 attiva e Opi1p reprime geni che mantengono livelli di S-adenosilmetionina (SAM), il substrato per la maggior parte delle reazioni di metiltransferasi. Cellule manca Met4p crescono normalmente quando SAM viene aggiunto ai media o uno dei geni sintetasi SAM &egrave; overexpressed. SAM viene utilizzata come un donatore di metile in tre reazioni Opi1p regolamentati per creare i fosfolipidi di membrana abbondanti, fosfatidilcolina. I nostri risultati dimostrano che cellule in rapida crescite richiedano significativa metilazione, probabilmente per la biosintesi dei fosfolipidi.

Regolazione coordinata del metabolismo dello zolfo e fosfolipidi riflette l&#39;importanza della metilazione nella crescita del lievito.

We describe the development and characterization of a system that allows the rapid and specific induction of individual genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae without changes in nutrients or temperature. The system is based on the chimeric transcriptional activator Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Upon addition of the hormone Î²-estradiol, cytoplasmic GEV localizes to the nucleus and binds to promoters containing Gal4p consensus binding sequences to activate transcription. With galactokinase Gal1p and transcriptional activator Gal4p absent, the system is fast-acting, resulting in readily detectable transcription within 5 min after addition of the inducer. Î²-Estradiol is nearly a gratuitous inducer, as indicated by genome-wide profiling that shows unintended induction (by GEV) of only a few dozen genes. Response to inducer is graded: intermediate concentrations of inducer result in production of intermediate levels of product protein in all cells. We present data illustrating several applications of this system, including a modification of the regulated degron method, which allows rapid and specific degradation of a specific protein upon addition of Î²-estradiol. These gene induction and protein degradation systems provide important tools for studying the dynamics and functional relationships of genes and their respective regulatory networks.

Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.

Nous d&eacute;crivons le d&eacute;veloppement et la caract&eacute;risation d&#39;un syst&egrave;me qui permet l&#39;induction rapide et sp&eacute;cifique des g&egrave;nes individuels dans la levure Saccharomyces cerevisiae sans changements d&#39;&eacute;l&eacute;ments nutritifs ou de temp&eacute;rature. Le syst&egrave;me est bas&eacute; sur l&#39;activateur de la transcription chim&eacute;rique Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Lors de l&#39;addition de l&#39;hormone &beta;-estradiol, GEV cytoplasmique se localise au noyau et se lie aux promoteurs contenant des s&eacute;quences de liaison Gal4p consensus d&#39;activer la transcription. Avec galactokinase Gal1p et activateur de la transcription Gal4p absent, le syst&egrave;me est &agrave; action rapide, ayant pour r&eacute;sultat une transcription facilement d&eacute;tectable dans les 5 min apr&egrave;s addition de l&#39;inducteur. &Beta;-Estradiol est presque un inducteur gratuit, comme indiqu&eacute; par g&eacute;nome profilage qui montre une induction involontaire (par GEV) de seulement quelques dizaines de g&egrave;nes. R&eacute;ponse &agrave; inducteur est class&eacute; : interm&eacute;diaire des concentrations de r&eacute;sultat d&#39;inducteur dans la production des niveaux interm&eacute;diaires de prot&eacute;ine produit dans toutes les cellules. Nous pr&eacute;sentons des donn&eacute;es illustrant plusieurs applications de ce syst&egrave;me, y compris une modification de la m&eacute;thode de degron r&eacute;glement&eacute;, ce qui permet une d&eacute;gradation rapide et sp&eacute;cifique d&#39;une prot&eacute;ine sp&eacute;cifique lors de l&#39;addition de &beta;-estradiol. Ces syst&egrave;mes de d&eacute;gradation de l&#39;induction et la prot&eacute;ine g&egrave;ne fournissent des outils importants pour l&#39;&eacute;tude de la dynamique et les relations fonctionnelles des g&egrave;nes et de leurs r&eacute;seaux respectifs de r&eacute;gulation.

Action rapide et presque gratuite induction d&#39;&eacute;puisement expression et prot&eacute;ine de g&egrave;ne chez Saccharomyces cerevisiae.

Descriviamo lo sviluppo e la caratterizzazione di un sistema che permette l&#39;induzione rapido e specifico dei singoli geni nel lievito saccaromices cerevisiae senza cambiamenti nella temperatura o sostanze nutritive. Il sistema si basa sull&#39;attivatore trascrizionale chimerico Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Con l&#39;aggiunta di ormone &beta;-estradiolo, GEV citoplasmatica si localizza nel nucleo e si lega ai promotori contenenti sequenze Gal4p consenso vincolante per attivare la trascrizione. Con galattochinasi Gal1p e attivatore trascrizionale Gal4p assente, il sistema &egrave; fast-acting, con conseguente trascrizione facilmente rilevabili entro 5 min dopo l&#39;aggiunta dell&#39;induttore. &Beta;-estradiolo &egrave; quasi un induttore gratuito, come indicato dal genome-wide profilatura che mostra ad induzione non intenzionale (da GEV) di solo qualche decina di geni. Risposta a induttore &egrave; classificato: intermedio concentrazioni del risultato dell&#39;induttore nella produzione dei livelli intermedi di proteina prodotto in tutte le cellule. Vi presentiamo i dati che illustrano diverse applicazioni di questo sistema, tra cui una modifica del metodo degron regolamentati, che consente la degradazione rapida e specifica di una proteina specifica con l&#39;aggiunta di &beta;-estradiolo. Questi sistemi di degradazione ad induzione e proteina del gene forniscono strumenti importanti per lo studio delle dinamiche e rapporti funzionali di geni e le rispettive reti regolamentari.

Sanford J. Silverman

The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics

Princeton University

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Sanford J. Silverman

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Princeton University

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics