Les aminoacyl-ARNt synthétases sont présentes à la fois chez les eucaryotes et les bactéries. Bien que les eucaryotes aient 20 aminoacyl-ARNt synthétases différentes à coupler à 20 acides aminés, de nombreuses bactéries n'ont pas de gènes pour toutes ces aminoacyl-ARNt synthétases. Malgré cela, ils utilisent toujours les 20 acides aminés pour synthétiser leurs protéines. Par exemple, certaines bactéries n'ont pas le gène codant pour l'enzyme qui couple la glutamine avec son ARNt partenaire. Dans ces organismes, une enzyme ajoute de l'acide glutamique à toutes les molécules d'ARNt d'acide glutamique, ainsi que toutes les molécules d'ARNt de glutamine. Ensuite, une deuxième enzyme modifie chimiquement l'acide glutamique en glutamine sur ces dernières molécules d'ARNt, formant ainsi la paire appropriée.

L'importance égale de l'ARNt et de l'aminoacyl-ARNt synthétase a été établie par une série d'expériences dans lesquelles un acide aminé a été chimiquement converti en un acide aminé différent après avoir été attaché à son ARNt apparié. Dans une expérience de synthèse de protéines in vitro, ces "hybrides" de molécules d'aminoacyl-ARNt ont inséré l'acide aminé incorrect à chaque point de la chaîne peptidique où cet ARNt a été utilisé. Les résultats ont montré que l'ARNt et l'enzyme sont également nécessaires pour une traduction correcte de la séquence d'acides aminés codée par l'ARNm.

Dans les cellules, les aminoacyl-ARNt synthétases utilisent la complémentarité structurelle et chimique pour identifier le bon ARNt qui doit être couplé à l'acide aminé lié à son site actif. La plupart des ARNt synthétases contiennent trois poches adjacentes de liaison aux nucléotides, dont chacune est complémentaire en forme et en charge d'un nucléotide dans l'anticodon. Alors que ces poches reconnaissent les nucléotides spécifiques dans la boucle anticodon de l'ARNt, des acides aminés supplémentaires interagissent avec le bras acceptant les acides aminés, permettant ainsi au bon ARNt de s'adapter au site de synthèse de l'enzyme.