Dosage pour Pathogen-Associated Molecular Motif (PAMP)-Triggered Immunité (PTI) chez les plantes

Résumé

A la mort cellulaire à base d'analyse pour PTI dans les plantes de Nicotiana benthamiana est décrite.

Résumé

Pour percevoir des agents pathogènes potentiels dans leur environnement, les plantes utilisent Pattern Recognition Receptors (PRR) présents sur leurs membranes plasmiques. PRR reconnaître les caractéristiques microbiennes conservées appelé pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) et cela conduit à la détection PAMP déclenché par l'immunité (PTI), qui empêche efficacement la colonisation des tissus de la plante par des non-pathogènes ^1,2. Le système le plus étudié dans PTI est le ³ voie FLS2-dépendante. FLS2 reconnaît le flg22 PAMP qui est une composante de la flagelline bactérienne.

Pathogènes réussissent possèdent des facteurs de virulence ou des effecteurs qui peuvent supprimer PTI et permettre à l'agent pathogène à causer la maladie ^1. Certaines plantes possèdent à leur tour des gènes de résistance qui permettent de détecter des effecteurs ou leur activité, ce qui conduit à effecteur déclenché par l'immunité (ETI) ^2.

Nous décrivons une mort cellulaire à base d'analyse pour PTI modifié depuis Oh et Collmer ^4. Le test a été normalisé en N. benthamiana, qui est en plus utilisées comme un système modèle pour l'étude des interactions plante-pathogène ^5. PTI est induite par l'infiltration d'une souche non pathogène bactérien dans les feuilles. Sept heures plus tard, une souche bactérienne qui cause la maladie ou qui actionne ETI est infiltré dans une zone de chevauchement de la zone d'infiltration d'origine. PTI induite par l'infiltration premier est capable de retarder ou d'empêcher l'apparition de la mort cellulaire due à l'infiltration deuxième défi. Inversement, l'apparition de la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'inoculation indique une panne de PTI.

Quatre combinaisons différentes avec des inducteurs du PTI et inoculations défi ont été normalisées (tableau 1). Le dosage a été testé sur la non-taire N. benthamiana qui a servi de contrôle et de silence pour les plantes qui ont été prédites FLS2 d'être compromises dans leur capacité à développer PTI.

Protocole

Partie 1: La croissance des plantes et l'entretien

Nicotiana benthamiana utilisé dans le dosage devrait être d'environ 7 semaines. Ils doivent être taillés au moins 4-5 jours avant le test d'enlever toutes les branches et les fleurs axillaires. C'est une bonne idée d'enlever les branches axillaires, peu après leur apparition afin de rendre les plantes plus gérable.

Partie 2: culture bactérienne

JOUR 1:

1. Assiettes ou des cultures de toutes les souches utilisées dans le test sont lancés au même moment. Pour les Pseudomonas spp. qui comprennent deux inducteurs et 3 souches d'épreuve, les bactéries série sur des plaques contenant KBM les antibiotiques appropriés de stocks de glycérol congelé (tableau 2). Une petite quantité de bactéries doivent être répartis sur le centre de la plaque. Incuber la plaque à 30 ° C pendant environ 18-24 heures. Pour Agrobacterium, démarrer une culture liquide en 2 ml LB à partir d'une plaque fraîche et poussent durant la nuit à 250 rpm, 30 ° C.

JOUR 2:

2. Pour Pseudomonas, ajouter 150 à 200 l de liquide à la KBM bactéries et les étaler sur toute la plaque à l'aide d'un épandeur de verre stériles. Mettez la plaque arrière dans l'incubateur et le laisser grandir pour un autre 20-24 heures. Il devrait y avoir une pelouse sur la plaque bactérienne, le lendemain, indiquant une bonne croissance. Pour Agrobacterium, démarrer une culture secondaire dans environ 5-10 ml LB avec 20 acétosyringone pM et laisser pousser durant la nuit de 20 heures à 250 rpm, 30 ° C.

Partie 3: Préparation des plantes pour le dosage

JOUR 2:

1. Un jour avant le dosage des plantes devrait être transféré dans une chambre à 22-24 ° C, ~ 35-40% de lumière RH et constante.
2. Marquer les cercles sur les feuilles qui sont au moins 1,5 cm de diamètre en utilisant un gros marqueur noir. Deux à quatre cercles peuvent être marqués par feuille. Les cercles doivent être bien espacées et de préférence pas traverser une grosse veine. Choisissez bien élargi feuilles. Evitez les feuilles plus âgées ou les feuilles qui sont durs ou épais au toucher et éviter de marquer des cercles sur la partie inférieure de la feuille.

Marquage des cercles d'une journée avant l'expérience n'est pas indispensable pour le protocole. Cependant, il fait gagner du temps s'il ya un grand nombre de plantes à détecter, et le rend plus facile à réaliser une synchronisation précise entre l'induction de PTI et inoculations défi.

Partie 4: Induction de PTI

JOUR 3:

1. Récolter les cellules de la plaque dans 10 mM MgCl ₂ pour P. fluorescens et P. putida. Pour Agrobacterium, centrifuger la culture pour recueillir des cellules et de remettre en suspension dans 10 mM MgCl ₂ + 10 mM MES pH 5,6. Répétez la centrifugation et la remise en suspension dans le MgCl _2-MES solution. Mesurer la densité optique (DO) des cellules à 600 nm. Réglez le SACO à des valeurs finales nécessaires tel que décrit dans le tableau 2. Pseudomonas devrait être finalement remis en suspension dans 10 _mM de MgCl2 et Agrobacterium dans le MgCl _2-MES solution. Un volume total de 25 ml est suffisante pour inoculer environ 40-50 points.
2. Infiltrez les inducteurs PTI dans les cercles pré-marqués sur les feuilles à l'aide d'une seringue de 1 ml sans aiguille. Notez l'ordre dans lequel les plantes ont été infiltrés et le moment exact où l'infiltration a été commencé.

Partie 5: inoculation d'épreuve

1. Préparer P. syringae pv. tomates DC3000, DC3000 Pst Δ hopQ1-1 et Ps pv. tabaci à relever le défi que décrit dans la partie 4.1 et le tableau 2.
2. Sept heures après l'infiltration inducteur, effectuer l'infiltration défi dans le même ordre de plantes que l'induction a été effectué. Généralement, un point sur la périphérie du cercle première inoculation peut être utilisé comme le centre du cercle deuxième inoculation. S'il ya des taches multiples sur une feuille, puis assurez-vous que les infiltrations ne se chevauchent pas.
3. Dilutions plaque de série de toutes les cultures utilisées pour l'essai sur des plaques KBM ou LB contenant les antibiotiques appropriés pour déterminer le nombre exact UFC.

Partie 6: Notation de la rupture du PTI

Jour 5:

1. Cherchez l'apparence de la mort cellulaire due à l'ETI dans les endroits qui ont été contestées avec Pst DC3000. La mort cellulaire à l'intérieur de la zone de chevauchement de l'infiltration indique une panne de PTI et doivent être comptés comme un phénotype positif.

Jour 7:

2. Cherchez l'apparence de la mort cellulaire due à la maladie dans les endroits qui ont été contestées avec Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ou Ps pv. Tabaci . Score pour un phénotype positif dans la même manière que décrit dans la partie 6.1.

Lorsque les plantes de contrôle (qui ne devrait pas être compromis pour PTI) commencent à montrer la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'infiltration, arrêter de faire d'autres observations.

Partie 7: Les résultats représentatifs

La figure 1 montre les résultats d'un essai lorsque P. fluorescens a été utilisé comme inducteur et DC3000 Pst comme le défi.

Figure 1. P. fluorescens a été infiltré sur N. benthamiana feuilles (cercle noir) pour induire PTI et 7 heures plus tard, le spot a été contestée avec Pst DC3000 (cercle blanc). Plantes silence pour FLS2 a montré une rupture de PTI dans la région où P. fluorescens a été infiltré (A), tel que vu par la mort cellulaire. Contrôle des plantes qui n'ont pas été réduits au silence n'a montré aucune mort cellulaire dans la zone de chevauchement en raison de l'induction de PTI (B). Les flèches rouges indiquent l'absence ou la présence de la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'infiltration. Les photographies ont été prises 2 jours après l'infiltration. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Inducteur PTI	Mort cellulaire provoquant défi	Nature de la mort cellulaire	Code de
Pseudomonas fluorescens 55	Pseudomonas syringae pv tomate (Pst). DC3000 6	ETI	Pf / DC
P. putida KT2440	Pst DC3000	ETI	Pp / DC
P. fluorescens 55	Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6	Maladie	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	P. syringae pv. tabaci 11528R	Maladie	Agro / PTAB

Tableau 1: Combinaisons d'induire la mort cellulaire et de PTI-susciter des microbes utilisés dans le dosage de la mort cellulaire par PTI.

Souche bactérienne	Milieu de sélection	DO finale utilisée dans l'expérience	Correspondant UFC / ml
P. fluorescens 55	KBM Ampicilline (100 ug / ml)	0.5	1 x 10 9
P. putida KT2440	KBM Ampicilline (100 ug / ml)	0.5	1 x 10 8
A. tumefaciens GV2260	LB Rifampicine (100 ug / ml)	0.5	5 x 10 8
Pst DC3000	KBM rifampicine (100 ug / ml)	0,02	2 x 10 7
Pst DC3000 Δ hopQ1-1	KBM rifampicine (100 ug / ml)	100 de dilution de 0,1 fois	1 x 10 6
P. syringae pv. tabaci 11528R	KBM rifampicine (100 ug / ml)	100 de dilution de 0,1 fois	1 x 10 6

Tableau 2: Les conditions de culture et de niveaux d'inoculum utilisé dans le dosage. La DO et les niveaux correspondants UFC peut varier entre différentes marques de spectrophotomètres.

Discussion

Dosage de la mort basée sur la cellule peut être utilisée pour déterminer l'implication d'un gène dans le PTI. Par exemple, la perte de fonction des mutants pour un gène d'intérêt peut être testée en utilisant ce dosage. Sur les quatre combinaisons d'inducteur et inoculations défi, étant donné dans le tableau 1, il est possible que seule une combinaison peut entraîner un phénotype dans votre fond végétal. Nous avons observé que les plantes réduit au silence pour FLS2 montrent une répartition de PTI dans le Pf / DC et des combinaisons de Pf/Q1-1 inducteur et inoculations défi (tableau 1).

Il est essentiel que les conditions environnementales pour le dosage sont aussi proches que possible de celles décrites dans la partie 3.1. Faible taux d'humidité provoque la mort cellulaire de procéder trop rapidement, ce qui rend le dosage difficile de marquer. Si les conditions décrites dans notre protocole ne fonctionne pas dans votre laboratoire, alors essayez de modifier le niveau d'inducteur ou d'inoculation d'épreuve. Un autre paramètre qui peut être modifié, c'est l'écart de temps entre l'induction et le défi, mais nous avons constaté que les écarts de temps plus courte causé le dosage de briser trop rapidement dans les plantes de contrôle.

Nous recommandons que au moins 4-5 plantes être testée dans une expérience et un phénotype positif doit être répété dans au moins 3-4 expériences indépendantes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730