Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Résumé

Les analyses qPCR Solaris expression des gènes sont de nouveaux pré-conçus qPCR amorce / sonde combinaisons conçues pour simplifier le processus de qPCR sans pour autant sacrifier la spécificité et la robustesse de l'analyse.

Résumé

Le test Solaris qPCR l'expression des gènes est un nouveau type d'amorce / sonde, conçue pour simplifier le processus de qPCR tout en conservant la sensibilité et la précision du dosage. Ces ensembles d'amorces / sonde sont pré-conçue pour> 98% des génomes de l'homme et de la souris et améliorations de fonctionnalités importantes de technologies déjà disponibles. Ces améliorations ont été rendues possibles grâce à un algorithme de conception nouvelle, développée par des experts en bioinformatique Thermo Scientific.

Plusieurs fonctionnalités pratiques ont été intégrées dans le test Solaris qPCR pour rationaliser le processus d'exécution quantitative PCR en temps réel. Tout d'abord, le protocole est similaire aux alternatives couramment employées, de sorte que les méthodes utilisées lors de qPCR sont susceptibles d'être familiers. Deuxièmement, le mélange maître est bleu, ce qui rend l'établissement des réactions qPCR plus facile à suivre. Troisièmement, les conditions de cyclage thermique sont les mêmes pour tous les tests (gènes), ce qui permet d'exécuter de nombreux échantillons à moinsemps et en réduisant le risque d'erreur. Enfin, la sonde et les informations séquence de l'amorce sont prévus, ce qui simplifie le processus de publication.

Ici, nous montrons comment obtenir des réactifs appropriés Solaris utilisant la fonctionnalité du produit GENEius recherche sur le site Web de commande (www.thermo.com / solaris) et comment utiliser les réactifs Solaris pour effectuer qPCR utilisant la méthode de la courbe standard.

Protocole

1. Le Thermo Scientific Solaris qPCR algorithme de conception de dosage

1. L'algorithme utilisé dans la conception de Solaris qPCR sonde / amorce paires ajuste la Tm de chaque composant ainsi des conditions favorables à vélo universels. Incorporation de la MGB, ou la reliure petit sillon, fraction de la sonde augmente la Tm et permet de sondes plus courtes pour être conçus pour une plus grande souplesse d'analyse et de performance. Comme leur nom l'indique, BTP sont une classe d'antibiotiques qui peuvent s'insérer dans le petit sillon de la double hélice d'ADN. BTP sont fixés à l'extrémité 3 ou 5 d'une sonde d'ADN. En solution, la fluorescence du reporter FAM de la sonde est trempée par Eclipse Quencher foncé. Lorsque la sonde se lie à une séquence cible, le changement résultant dans 3-D de la sonde s conformation permet à un signal fluorescent intense. La liaison de la sonde d'ADN à séquence cible est stabilisée par le MGB, qui permet l'utilisation de sondes très spécifiques, plus courts, tout en maintenant la température de fusion appropriéepour la PCR. Ainsi, la détection du signal se produit pendant la phase de recuit de l'amplification de cible. Au cours de l'étape d'extension, la sonde MGB dissocie et la fluorescence est de nouveau arrêtée. Parce que la sonde se dissocie, elle n'affecte pas l'efficacité de PCR.
2. Une autre caractéristique de l'algorithme de Solaris est l'utilisation de superbases. Superbases sont des bases modifiées qui ont amélioré les capacités de liaison pour améliorer la stabilité des liaisons AT et éliminer GG auto-association de séquences riches en guanine. En outre, ils n'ont pas étancher fluorophores adjacents attachés à l'extrémité 5. Ces bases sont placés de manière sélective, en fonction de l'algorithme, pour accroître la disponibilité de séquences cibles. Il est ainsi possible d'utiliser des séquences, telles que les régions riches en GC, qui autrement seraient évités dans la conception des amorces et des sondes.
3. Chaque fois que possible, l'algorithme de Solaris intègre jonction exon couvrant les régions dans le site cible. Cette spécificité augmente en évitant l'amplification of ADN génomique contaminant.
4. Surtout, l'algorithme identifie également une séquence consensus pour tous les variants d'épissage connus, tels que tous sont couverts par une seule sonde / amorce ensemble. Donc, un seul test est nécessaire pour un gène d'intérêt particulier.
5. Enfin, l'algorithme Solaris qPCR conception test utilise des paramètres très stricts pour des considérations de conception critiques, y compris la teneur en GC, longueur, Tm, et s'étend de nucléotides homogènes. Les séquences obtenues sont analysées pour BLAST spécificité en utilisant 3 bases de données différentes: génomique, la transcription, et pseudogène.

2. L'obtention de réactifs Solaris

1. Pour obtenir les réactifs Solaris appropriée, visitez www.thermo.com / solaris
2. Une fois sur le site cliquez sur "Recherche produit GENEius". Pour aller directement à la recherche de produits GENEius, allez à l'adresse www.thermo.com / SolarisRechercher
3. Cliquez dans la zone de recherche, et choisissez l'organisme cible appropriée.
4. La recherche de produits GENEius peut traiter de nombreux identificateurs de gènes différents. Ici, entrez l'un des termes de recherche suggérés pour trouver le gène d'intérêt, y compris Ref Seq adhésion, l'ID de Gene, le symbole Gene, une description de Gene, l'ID de Sanger ou le numéro d'accession, ou un numéro de catalogue. Puis, cliquez sur "Recherche".
5. Identifier le gène d'intérêt et cliquez sur "Select" sur le côté gauche. Cela va ouvrir une fenêtre qui affiche les différents produits Thermo Scientific disponibles pour le gène d'intérêt. Sous la rubrique «Produits» sélectionnez l'option "Détection qPCR" Tab.
6. Dans le cadre du "test Solaris Gene Expression» en-tête, vous verrez une conception optimale Solaris sonde / test primaire. Ce test on va couvrir tous les variants d'épissage connus de votre gène cible. Choisissez la quantité désirée. Ils sont disponibles en 100, 200, 400 et
   1000 X 25 pi de réactions (comme si ledire est identifié comme étant faite sur commande, la taille paquet de 100 ne seront pas disponibles). Cliquez sur "Ajouter au panier".
7. Ensuite, sélectionnez le master mix approprié pour le thermocycleur qui sera utilisé. Pour déterminer quel master mix qui fonctionnera le mieux avec la machine disponible, cliquez sur «En savoir Mix Master qui fonctionne le mieux avec votre Cycler PCR!"
8. Trouvez le cycleur qPCR qui sera utilisé dans le menu afin de déterminer qui se mélangent à utiliser.
9. Revenez à la fenêtre de recherche de produits GENEius, et sélectionnez le master mix approprié. Le master mix est disponible en 100, 200, 400, et 1000 tailles réaction. Cliquez sur "Ajouter au panier".
10. Gènes de référence proposées et des kits verso de synthèse d'ADNc peut également être ordonnée pour une complète qRT-PCR.
11. Lorsque les réactifs Solaris qPCR arrivent, les stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation. Les réactifs suivants doivent être reçues: Une solution 20X contenant deux amorces fournies à 800 nm chacune et une sonde d'un gène spécifique prévu à 200 nm, SequInformations référence pour la sonde et les amorces, et Solaris Gene Expression qPCR Master Mix 2X à une concentration. Solaris analyses qPCR l'expression des gènes sont stables pendant une durée minimale de 12 mois. Eviter les congélations répétées décongélation.

3. configuration qPCR

1. Commencer le protocole qPCR avec l'ADNc. L'ARN total doit être extrait à l'aide d'une méthode de la colonne. Le Thermo Scientific kit de synthèse d'ADNc Verso est recommandé pour la transcription inverse pour produire l'ADNc.
2. Préparez-vous pour qPCR par la fonte des amorces, des sondes, et le mélange maître sur la glace. Également avoir sous la main l'eau de qualité PCR et qPCR blanches opaques plaques, ce qui peut améliorer la sensibilité de la PCR en temps réel.
3. Le mélange maître contient tous les composants pour PCR en temps réel, notamment: 1) l'ADN polymérase Thermo-Start, une version de démarrage à chaud de l'ADN polymérase Thermoprime. Ce type de polymérase est utilisé pour prévenir une amplification non spécifique au cours de la réaction permet de configurer et nécessite étape d'activation à 95 ° C15 min. 2) dans le mélange dNTP Solaris Maître, dTTP remplace dUTP pour maximiser l'efficacité d'amplification 3) tampon de réaction exclusif, optimisé pour fonctionner avec Solaris amorce / sonde essais. Ce tampon de réaction contient un colorant bleu pour augmenter le contraste entre le réactif et le plastique. 4) ROX, si votre instrument qPCR nécessite ROX.
4. Une fois que les solutions sont décongelés, mélanger en tapotant le tube (ne pas vortexer). Isoler les pour éviter la perte de réactif.
5. Ensuite, préparez un tube de 15 ml Falcon stérile pour mettre en place le mélange réactionnel pour le gène d'intérêt, plus un pour le gène de référence, l'intensification en fonction du nombre d'échantillons. Préparez suffisamment de telle sorte que trois répétitions peuvent être préparés pour chaque échantillon, y compris un contrôle de modèle non (NTC) et échantillons de courbe standard, si la méthode de la courbe standard sera utilisé pour l'analyse.
6. Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 96 puits, mélanger le suivant: 5 pi de la 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 pi de la version Solaris amorce / sonde set (20X), Et l'eau de qualité PCR de telle sorte que le volume final de réaction, une fois l'ADNc est ajoutée sera de 25 ul. Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 384 puits mélanger la suivante: 12,5 ul de la 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 pl de la version Solaris amorce / sonde set (20X) et la PCR eau de qualité telle que le volume de réaction final, une fois l'ADNc est ajoutée sera de 10 ul.
7. En utilisant une pipette multicanaux, transférer le mélange-maître dans les puits appropriés de la plaque. Le colorant bleu inclus dans le mélange maître faciliter le suivi des progrès de pipetage sur les plaques blanches. Ensuite, ajoutez le modèle de 1-5 ul d'ADNc (pour une plaque de 96 puits) ou 1-2 pi de matrice d'ADNc (pour une plaque 384 puits). Introduire à la pipette de haut en bas pour mélanger. Placer la plaque dans une centrifugeuse et centrifuger pour éliminer les bulles, car elles vont interférer avec les lectures de fluorescence.
8. Programmer le thermocycleur: L'enzyme doit être activé avec un 95 ° C 15 min (1 cycle). Puis 40 cycles de 95 ° C, la dénaturation pendant 15 secondes, et unenealing et extension à 60 ° C pendant 60 secondes.
9. Placer la plaque dans l'instrument qPCR. Démarrez le programme.

Représentatifs des résultats de qPCR utilisant Solaris

Figure 1. Dosages Solaris donner une détection fiable même à des concentrations très faibles d'entrée, à en juger par l'efficacité de la PCR et les valeurs de r2. Dix à 10 dilutions d'ADNc synthétisés à partir de la séquence amplicon d'ARN synthétique ou une séquence amplicon d'ADN a été amplifié sur un instrument ABI 7900HT l'utilisation de Solaris qPCR Gene Expression Assay pour F2RL1 ou Cdc20, respectivement. Les courbes d'amplification log-échelle et des courbes standard sont représentées avec la performance de chaque test, y compris l'efficacité, la valeur r2, la plage dynamique sur 10 log10 dilutions, et la limite inférieure de détection.

Figure2. Essais Solaris donner des résultats cohérents, même entre les différents chercheurs et des laboratoires. siRNA ciblant ALDOA et PPIB, ainsi que d'un contrôle de non-ciblage (NTC), ont été transfectés dans des cellules HeLa à nM 100, 10, 1 et 0,1 concentrations finales. Les cellules ont été récoltées et l'ARN total isolé 48 heures après le traitement. L'ADNc a été synthétisé en utilisant Thermo Scientific Kit de synthèse d'ADNc Verso. Une aliquote de l'ADNc a été amplifié dans deux laboratoires géographiquement séparés à l'aide de Solaris analyses qPCR l'expression des gènes pour la détection de ALDOA, PPIB, et GAPDH sur LightCycler Roche 480 (384 puits) plate-forme. Knockdown a été calculé selon la méthode ΔΔCq (normalisée par rapport à la GAPDH gène de référence et NTC cellules traitées). Les mêmes niveaux de knockdown ont été démontrées pour les deux cibles génétiques entre les chercheurs des deux sites.

Discussion

Thermo Scientific Solaris analyses qPCR fournir une méthode simple et amélioré pour la réalisation d'analyses qPCR. L'utilisation d'un algorithme de haute stringence, incorporant la technologie et MGB superbases, ces amorces et sonde fixe maximiser la fidélité et la robustesse des expériences de qPCR. Une amorce et un ensemble de sonde reconnaît tous les variants d'épissage connus d'un gène donné. Le site cible, chaque fois que possible, comprend les régions d'exons couvrant, pour veiller à ce que l'ADN génomique n'est pas amplifié. Ces caractéristiques permettent d'exécuter simultanément de nombreux échantillons, ce qui réduit considérablement la quantité de temps nécessaire pour effectuer des expériences complexes. Depuis le master mix est bleu, il est possible d'utiliser des plaques opaques blanches, qui améliorent la sensibilité de la PCR quantitative, sans perdre de pipetage.

Pris dans leur ensemble, les caractéristiques de conception de l'essai qPCR Solaris faire de ce roman qPCR un test simple, mais de haute performance qui est à la fois spécifique et robuste.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif / matériau	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solaris APCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo	AB-4351/INT	100 x 25 uL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master	Thermo	AB-4351 / A	200 x 25 uL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master	Thermo	AB-4351 / B	400x 25 uL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master	Thermo	AB-4351 / C	1000 x 25 uL rxns
Solaris analyses qPCR l'expression des gènes	Thermo	AX-XXXXXX-XX-XXXX *	100 rxns (1 x 125 pi) 200 rxns (2 x 125 pi) 400 rxns (4 x 125 pi) ou 1000 rxns (10 x 125 pi)
Kit de synthèse d'ADNc Verso	Thermo	AB-1453 / A AB-1453 / B	40 x 20 uL rxns 100 x 20 uL rxns
ABgene plaque de 96 puits (jupe, P Bas rofil, Blanc) **	Thermo	AB-0800 / W	25 plaques
ABgene Diamond Ultra 384-Eh bien PCR Plate, blanc **	Thermo	AB-2150 / W	25 plaques
Absolute qPCR adhésif Seal	Thermo	AB-1170	50 feuilles