La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d'hôte

Résumé

Procédure pour la fertilisation Ovocytes de Xenopus Par la méthode de transmission de l'hôte.

Résumé

Etudier l'apport de molécules hérité de la mère au développement précoce des vertébrés est souvent entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour produire des animaux mutants à effet maternel. De plus, de nombreuses techniques pour surexprimer ou inhiber la fonction des gènes dans des organismes comme le poisson-zèbre et le xénope ne parviennent pas à suffisamment cible critique maternelle voies de signalisation, tels que la signalisation Wnt. Chez le xénope, la manipulation de la fonction des gènes dans les ovocytes en culture et par la suite les fertiliser peut améliorer ces problèmes dans une certaine mesure. Les ovocytes sont manuellement defolliculated à partir de tissus d'ovaire donateurs, injecté ou traité dans la culture comme souhaité, et ensuite stimulées avec de la progestérone pour induire la maturation. Ensuite, les ovocytes sont introduits dans la cavité du corps d'une grenouille hôte ovulation féminine, après quoi ils seront transporté dans l'oviducte de l'hôte et l'acquisition des modifications et des manteaux de gelée nécessaires à la fécondation. Les embryons ainsi obtenus peuvent ensuite être porté à la scène désirée et analysées pour les effets de toute perturbations expérimentales. Cette méthode de transfert de l'hôte a été très efficace dans la découverte des mécanismes de base du développement précoce et permet un large éventail de possibilités expérimentales ne sont pas disponibles dans tous les autres vertébrés organisme modèle.

Protocole

1. Ablation chirurgicale du tissu Ovaire

1. Préparer un nouveau lot de milieu de culture des ovocytes (OCM; Matériaux), entre 400 à 800 ml selon la taille de l'expérience. Ajuster le pH de 07.06 à 07.08, jusqu'à ce que le rouge de phénol vire au rouge foncé (six ou si de petites gouttes de NaOH 5N). Verser une petite quantité de vérifier le pH dans un tube séparé depuis l'électrode pH peut contaminer les médias. OCM doit être conservé à 18 ° C et utilisée dans une semaine.
2. Sélectionnez 3-5 femelles et placer une solution dans ~ 2L anesthésie tamponnée (Matériaux). Nous essayons d'éviter d'utiliser des grenouilles qui ont été nourris sur le jour de ou avant la chirurgie. Alors que la grenouille est de succomber à l'anesthésie, désinfecter la zone chirurgicale avec EtOH 70% et de préparer les instruments chirurgicaux.
3. Stériliser les instruments chirurgicaux de 20 secondes d'immersion dans un stérilisateur à billes chaude à 250 ° C. Les instruments suivants doivent être à portée de main: poignée de scalpel (# 3) et la lame (n ° 10 ou 11), plusieurs paires de Dumont forceps, ciseaux à iris de Bonn (courbe ou droite), Halsey et Olsen Hegar porte-aiguille micro, et les sutures. Placez instruments stérilisés sur une boîte de Pétri stérile ou à l'intérieur de l'emballage de suture pour maintenir stérile. Saisir l'aiguille dans le porte-aiguille dans l'orientation désirée avant de commencer. Nous préférons porte-aiguilles Olsen Hegar depuis la poignée contient des lames de ciseaux, ce qui peut être utilisé pour couper des sutures sans instruments de commutation.
4. Après 10 minutes, vérifier que le plan chirurgical de l'anesthésie a été réalisée. Grenouilles anesthésiés vont arrêter de bouger et de ne pas répondre à un pincement de l'orteil ou d'être remis. L'anesthésie devrait durer 15 minutes, ce qui est plus que suffisamment de temps pour effectuer les opérations. Don tenue appropriée chirurgicale. Cela peut inclure des gants propres (sans latex), sarraus et masques chirurgicaux, en fonction des préférences personnelles et institutionnelles des lignes directrices de soins aux animaux.
5. Note sur la technique aseptique: sécrétions de la peau grenouille contiennent des peptides antimicrobiens que, généralement, de réduire l'incidence de la contamination pendant la chirurgie, bien que technique aseptique doit être suivie autant que possible. Champs chirurgicaux peuvent être utilisés, mais ne peut être exigé par les IACUC institutionnels et peut ne pas fournir beaucoup d'avantages. Généralement «technique astuce» utilisée, où les mains ne touchent les astuces du matériel stérile, les instruments de suture, ou le site d'incision. Les instruments peuvent être stérilisés à nouveau (dans le stérilisateur billes) incision suivants de la peau, et une zone stérile doivent être maintenus sur la paillasse pour les instruments de placement (comme une boîte de Pétri ou forfait de suture). Les exigences institutionnelles peuvent différer de façon significative, alors s'il vous plaît suivre les directives de votre institution et de recevoir une instruction appropriée avant d'effectuer la chirurgie.
6. Retirez la grenouille de l'anesthésie et le lieu en décubitus dorsal sur un linge humide chirurgicale. Remarque. La peau peut être nettoyé par rinçage en iode povidine diluée (1:20) ou la chlorhexidine (0,75%). Cependant, évitez commerciales lavages chirurgicaux, des savons et 70% d'alcool isopropylique, car ceux-ci endommagent la peau délicate des amphibiens.
7. L'utilisation d'un scalpel ou des ciseaux petits iris, faire un petit (1 - 1,5 cm) incision dans la peau dans la partie inférieure de l'abdomen, latérale à la ligne médiane. Incisions ultérieures sur la même grenouille doivent être effectués sur les côtés de remplacement, bien espacés les uns des autres. Les incisions peuvent être faites soit parallèle ou perpendiculaire à la ligne médiane.
8. Faire des incisions de la peau et des muscles abdominaux en deux étapes. Après avoir coupé la peau, lever la couche musculaire et entourant de couleur blanche fascia avec des pinces et faire l'incision dans le muscle soulevées. Utilisez des ciseaux et couper vers le bas, essayer de faire une coupe rapide pour exposer la cavité du corps laissant bords de la plaie propre. Si tout le fascia est coupé, il se rétracte et se faire des points de suture plus difficile. Lifting du muscle aidera à éviter par inadvertance en blessant un quelconque des organes internes. Aussi, essayez d'éviter de couper à travers des cœurs lymphatiques visibles ou des vaisseaux sanguins dans les couches musculaires. Prolonger la durée avec des ciseaux de l'incision de telle sorte que l'ovaire peut être facilement tiré à travers.
9. Ovaire doivent être clairement visibles une fois l'incision est faite. Pour se procurer de l'ovaire, saisir avec une pince et d'externaliser le tissu ovarien. La quantité désirée de tissu est prélevé, et parés à l'arrêt au niveau de la paroi du corps. Ne pas bourrer les tissus dans la cavité coelomique, comme cela pourrait être une source d'infection ou d'autres complications.
10. Immédiatement observer un petit morceau d'ovaire sous un microscope à dissection et defolliculate une ovocytes quelques pour tester leur qualité. Ils doivent être fermes et de taille uniforme et la coloration. Si elles sont acceptables, retirer la quantité désirée de tissu de l'ovaire et de suture de l'incision. Assez pour remplir une boîte de Petri de 90 mm est généralement suffisant pour la plupart des expériences. Si les ovocytes sont de qualité douteuse, suture de la grenouille et répéter avec une femme différente.
11. Fermer l'incision par une suture du muscle et la couche de fascia premier. Insérez le n Eedle quelques millimètres à l'incision latérale, en veillant à passer à travers la couche aponévrose ainsi. Sutures simplement à travers le muscle peut se déchirer le tissu et se détacher. Utilisez une pince pour aider à insérer l'aiguille en bas sur le côté opposé de l'incision. Libération et re-saisir les aiguilles de l'extérieur du corps et de tirer la suture à travers plusieurs pouces jusqu'au environ de la queue reste, en prenant soin de ne pas tirer tout le long.
12. Fermez la plaie avec un modèle simple de suture interrompue. Nous utilisons une cravate instrument de base pour faire des noeuds carrés chirurgien (noeuds récif). Boucle de la longue fin de la suture autour du porte-aiguille, saisir la queue et le passer dans la boucle vers vous et serrez. Boucle et tirez à travers, cette fois tirer le porte-aiguille loin de vous. Un jet de tiers peuvent être utilisés pour plus de sécurité (dans la même direction que le premier). Garniture de la suture, laissant la queue courte et faire une autre de suture dans le muscle à quelques millimètres. Deux sutures sont suffisantes pour les sutures petits, trois pour les grandes. Répétez l'opération pour la couche de peau. Démonstrations vidéo de technique de suture de base sont disponibles sur YouTube - Recherche de "cravate instrument», il ya un assez grand nombre de choix, bien que la technique de base est la même.
13. Rincez la femelle avec de l'eau déminéralisée et sa place dans un seau rempli de récupération fraîche (18 ° C) d'eau. Alors que dans le laboratoire, les grenouilles sont conservés dans l'eau du robinet traitée avec Amquel d'éliminer les chloramines. Toutes les quelques minutes, soulevez doucement la grenouille dans l'eau et chercher avalant ou oeil-bombé mouvements, indicatif de récupération de l'anesthésie.
14. Remarque: la chirurgie de survie n'est pas strictement nécessaire pour obtenir des tissus ovaire, bien que les femelles vont continuer à produire des ovocytes bon après un certain nombre d'opérations. Effectuer une chirurgie de survie seront également réduire le nombre d'animaux utilisés. Soyez sûr de suivre les directives de votre unité de soins aux animaux vertébrés sur la chirurgie des méthodes de survie, soins postopératoires et le suivi et pour le nombre de chirurgies a permis à un individu.

2. La culture et les ovocytes Defolliculating

1. Juste après l'intervention chirurgicale est terminée, subdiviser l'ovaire en petits morceaux (~ 2 cm ²⁾ et stocker dans l'OCM frais, en utilisant 5-6 morceaux par 90 mm ​​plat. Lobes individuels de l'ovaire sont à ciel ouvert, aplatie et coupée en morceaux carrés. Ce sont rincés à l'OCM propre et placés dans des boîtes de culture. Aplatissement et divisant l'ovaire va prolonger sa vie dans la culture et de faire defolliculation facile.
2. Déplacer un lobe d'un petit plat d'OCM et manuellement defolliculate 300-500 ovocytes. Ovocytes transfert en utilisant une solution stérile, polie au feu pipette. Nous avons trouvé que l'utilisation de la variété de coton-branchée est essentiel pour minimiser la contamination des cultures. Stocker les ovocytes à 18 ° C dans 8 ml OCM (dans les plats de support (Falcon 1007)) dans les groupes de 100-150. Avec la pratique, vous devriez être en mesure de defolliculate ovocytes assez en 1-2 heures. Ovocytes Collagenased ne sont pas appropriés pour le transfert de l'hôte, car ils sont pas fécondables.
3. Defolliculating méthode. Nous defolliculate utilisant des horlogers pince (Dumont # ou # 4s 5s, Outils Fine Science), en suivant les méthodes de base décrit dans Smith et al., (1991). En utilisant une paire de pinces (dans votre main dominante), saisir la couche thèque tissu conjonctif qui entoure un ovocyte entièrement développé stade VI près du lieu où le follicule est attaché à l'ovaire (la tige). Avec l'autre paire de pince, saisir l'ovaire adjacent à la première paire. Légèrement déchirer la couche folliculaire en tirant dans l'ovocyte. Doucement taquiner l'ovocyte hors du tissu. Ovocytes avec succès defolliculated sont floppier que ovocytes tout simplement retiré sans enlever la couche de follicule et sera dépourvue de vaisseaux sanguins visibles.
4. Note: Il est essentiel de maintenir une pression très légère sur le bout de la pince, à peine suffisant pour les conseils à respecter. Préhension trop serré est une commune parmi les débutants et les entraînera dans l'ovocyte étant arrachée avec le follicule intact. Gardez une bonne paire de pince exclusivement pour defolliculating. Les conseils doivent répondre précisément et devrait être légèrement émoussé à pince pour faire des explants d'embryons de xénope (Figure 1).
5. Nous faisons régulièrement tester maturité environ 20 avec de la progestérone et avorter l'expérience si le taux de maturation est faible (<50% après 6-7 heures à température ambiante).
6. À ce stade, les ovocytes peuvent être manipulés et cultivé comme vous le souhaitez, telles que la microinjection d'oligo, morpholino ou ARNm. Procédures d'injection varier selon le laboratoire, afin que nous ne décrirons pas ceux qui sont ici. Les ovocytes peuvent être maintenus jusqu'à une semaine dans les OCM, mais généralement, la santé décline donc il est préférable de les utiliser pour le transfert dans les 96 heures d'isolement.
7. Gardez à l'esprit que seulement cinq à six groupes (y compris un contrôle) peuvent être transférées à une seule femelle, en raison de restrictions sur les colorants vitaux, afin de planifier vos expériences en conséquence.

"> 3. Ovocytes maturation et la stimulation des Femmes hôtes potentiels

1. Si vous effectuez une opération de sauvetage de l'épuisement des oligo, injecter votre ARNm (généralement de 50 à 300 pg d'ARN) ~ 24-48 heures après l'oligo. Les oligos aura dégradé par ce temps et ne devrait pas affecter l'ARN injecté.
2. Le soir avant d'effectuer le transfert, ajouter 16 ul de solution de progestérone de travail (1 mM dans EtOH) pour ovocytes dans 8 ml OCM dans les plats de moyenne (concentration de progestérone final est ~ 2 M). Incuber 10-12 heures à 18 ° C pour permettre la maturation ovocytaire.
3. Injecter 3-5 femelles avec 1000 unités par grenouille d'hCG pour induire la ponte. Nos expériences semblent fonctionner mieux si la maturation ovocytaire et l'injection d'hCG sont faites à la même époque, environ 12 heures avant l'implantation dans l'hôte (par exemple, 22 heures -10 heures). Laisser les femmes à la température ambiante ou à 18 ° C pendant la nuit.

4. Préparation et coloration des ovocytes colorant vital

1. Dans la matinée du transfert, permettent ~ 45-60 'à configurer et effectuer la procédure. À ce stade, les ovocytes matures peuvent être congelés pour une analyse ultérieure de l'efficacité de knockdown ARNm ou d'expression de protéines. Aussi, vérifiez que les ovocytes ne sont pas devenus infectés et qu'il y avait un taux de maturation bonne (> 50%). Ovocytes infecté ne sera pas fertiliser. Dégel des colorants vitaux (Matériaux) et tournent à vitesse max pendant 5 min.
2. Couleur des différents groupes expérimentaux en ajoutant 80 pl de la teinture appropriée vitaux (s) pour les plats ovocyte et incuber avec bascule pour 15 '. Pendant ce temps, sélectionnez une femelle hôte et commencer à l'anesthésie. Choisissez une grenouille qui est lentement pondre normalement ou celle qui produit des œufs en abondance avec la compression légère. Oeufs de l'hôte doit être de bonne qualité. Évitez les femelles qui pondent des œufs ou des chaînes d'œufs écrasées.
3. Transférer les oeufs colorés dans un grand plat d'OCM frais, tourbillon brièvement pour se laver et les mettre de côté avant le transfert.
4. Préparer une pipette Pasteur stérile avec un alésage juste assez large pour accueillir un ovocyte (~ 1,5 mm) pour utilisation dans la transplantation des ovocytes. Score de la pipette avec un crayon de diamants et de briser proprement. Incendie polonaise jusqu'au bords sont lisses, en prenant soin de ne pas fondre l'ouverture fermée.

5. Exécution de la transplantation des ovocytes

1. La transplantation d'ovocyte utilise les mêmes procédures chirurgicales comme décrit dans la Partie I, bien au lieu d'enlever l'ovaire, les ovocytes manipulés sont introduits dans la cavité du corps avec une pipette. Idéalement, la procédure de transfert doit être effectué aussi rapidement que possible et de la taille de l'incision doit être maintenu aussi petit que possible.
2. Anesthesize la femelle hôte et préparer les instruments chirurgicaux tels que décrits dans la partie I. Faire une incision et comme décrit dans la partie I. L'incision peut être plus petite, mais elle doit être assez grand pour accueillir l'alésage de la pipette de transfert (figure 2A).
3. Pour transplanter les ovocytes, saisir et d'élever un volet du muscle et du fascia avec une pince et d'introduire les ovocytes expérimentaux utilisant la pipette Pasteur préparé ci-dessus. Swirl le plat d'ovocytes de les recueillir dans le centre et sucer autant que possible. Autoriser les ovocytes de s'installer dans l'extrémité de la pipette pour éviter l'excès de liquide étant introduit et insérer l'extrémité de la pipette dans l'incision et lentement les ovocytes permettent à arriver dans la cavité du corps (figure 2B). Répétez jusqu'à ce que tous les ovocytes ont été transférés. Ne relâchez pas la couche musculaire à tout moment, jusqu'à ce que vous avez commencé à suturer, ou les ovocytes se renverse de l'incision.
4. Une fois les ovocytes ont été transférés, saisir des deux côtés de l'incision avec une pince et de les rassembler, les ovocytes permettant de s'installer dans la cavité du corps. Commencez suture tel que décrit, en prenant soin de maintenir la tension à la hausse sur le muscle et le fascia jusqu'au premier noeud est lié (figure 2C). Cela permet de garder les ovocytes d'être expulsé et permettra aux bords de l'incision à guérir de façon égale. Ajouter un autre de suture dans la couche musculaire / fascia puis suturer la peau.
5. Rincez la femelle avec de l'eau déminéralisée et sa place dans un seau rempli de récupération refroidi (18 ° C) Amquel eau traitée. Surveiller son rétablissement de l'anesthésie comme ci-dessus. Elle devrait commencer à pondre normalement après l'opération.
6. Obtenir les testicules d'une grenouille mâle en utilisant des procédures normales. Stocker les testicules chez l'OCM ou L15 jusqu'à ce que nécessaire. Nous préférons testicule frais quand la fertilisation des expériences de transfert.

6. La fécondation des ovocytes et de récupération in vitro

1. Cils péritonéale va conduire le transfert des oeufs (oeufs et normal cœlomique de l'hôte) pour les ouvertures des oviductes dans la partie antérieure de la cavité du corps. Oeufs colorés peuvent être récupérés commence 2-3 heures après le transfert en serrant la normale. Les œufs peuvent être obtenus à chaque demi-heure ou jusqu'à ce que la femme arrête la ponte.
2. Fertiliser dans un SPEsuspension de rm (dans ~ 4 ROR ml 1x) pendant 4 minutes. Flood et rincer abondamment avec ROR 0.1x. Les œufs doivent activer normalement et commence à cliver ~ 1,5 à 2 heures après la fécondation. Transféré oeufs seront souvent cliver un peu plus tard que les œufs hôte.
3. Enlevez les couches de gelée à la cystéine comme des embryons normaux et trier dans des boîtes séparées. Cela peut être fait à n'importe quelle étape, selon les besoins de l'expérience. Il est plus facile en général à identifier les différentes couleurs autour du stade de 4 cellules et la plus difficile au cours de derniers stades blastula. Culture des oeufs à faible densité (<50 par plat moyennes) en 0,1 x ROR propre. De ce point, les embryons peuvent être traités et manipulés normalement.
4. Retour des grenouilles à l'animalerie et de surveiller en cas de complications au cours des prochains jours.
5. Méthode de la fécondation de rechange; ponte dans un tampon de sel
   1. Après la grenouille a récupéré de l'anesthésie, sa place dans ~ 1L en sel ROR (1.2x). Laisser la femelle à pondre des oeufs dans le tampon d'environ 4-6 heures. Presser les oeufs restant hors, drain ROR 1.2x et trier les oeufs colorés dans un plat à nettoyer, enlever tout le liquide possible.
   2. Laver abondamment avec ROR 0.3x et fertiliser au volume minimal de 0.3x MMR / sperme suspension jusqu'à ce que les œufs d'activer (10 minutes). Flood avec ROR 0,1 x et la culture comme ci-dessus. Cette option est utile si de nombreux oeufs sont nécessaires au même stade ou si l'expression manuelle des oeufs endommage le don d'ovocytes.

Discussion

Un transfert réussi aboutira à la fécondation et de clivage normal de> 50% des ovocytes (Figure 3). Généralement entre 30-60% des ovocytes transfert va survivre dernières étapes neurula. Nous transfèrent habituellement de 75 à 150 ovocytes par groupe expérimental, ce qui donnera suffisamment d'embryons pour plusieurs types d'analyses (in situ, RT-PCR) ainsi que la visualisation du phénotype. L'implantation d'ovocytes nettement plus ne semble pas augmenter considérablement le rendement. En ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Leibovitz milieu L-15 (contenant de la L-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x pénicilline-streptomycine	(Sigma P-0781)
Ajuster le pH à 7.6 au 7.8 avec NaOH 5N
Faire frais hebdomadaires, stocker à 18 ° C.

NaCl 1M

20 mM de KCl

20 mM de CaCl2

MgCl2 10 mM

150 mM d'HEPES

ajuster le pH à 7.6 au 7.8

Conserver à 4 ° C

1 g / L 3-aminobenzoïque ester éthylique d'acide (MS222)	(Sigma A-5040)
Bicarbonate de sodium 0,7 g / L
Dissoudre dans l'eau traitée Amquel
Faire frais hebdomadaires

10 mM de progestérone (Sigma P-0130) dans l'éthanol à 100%

Diluer à 1 mM dans EtOH à 100% pour un stock 500x / solution de travail

Conserver à -20 ° C

Bleu: 0,1% du Nil Bleu Une	(Aldrich 121 479-5G),
Rouge: 0,25% Rouge Neutre	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Vert (80 bleues + 80 ul ul marron),
Mauve (80 ul bleues + 80 rouges ul).
Une couleur sixième, Orange (80 ul rouges + 80 ul brun), peut également être utilisé mais il est souvent difficile à distinguer de brun.