Les modèles murins de la leucomalacie périventriculaire

Résumé

Nous avons créé des souris modèles de la leucomalacie périventriculaire (PVL), la lésion cérébrale prédominante chez les prématurés caractérisée par des lésions de la substance blanche périventriculaire. L'hypoxie / ischémie avec / sans infection systémique sont les principales causes de PVL. Unilatérale ligature carotidienne et l'exposition hypoxie avec / sans injection de lipopolysaccharide crée PVL lésions semblables chez les souris P6.

Résumé

Nous décrivons un protocole pour l'établissement de modèles de souris de leucomalacie périventriculaire (LPV). PVL est la forme prédominante des lésions cérébrales chez les prématurés et l'antécédent le plus commun de paralysie cérébrale. PVL est caractérisée par des lésions substance blanche périventriculaire avec des blessures oligodendrogliales proéminent. L'hypoxie / ischémie avec ou sans infection systémique / inflammation sont les principales causes de PVL. Nous utilisons des souris P6 pour créer des modèles de lésions cérébrales néonatales par l'induction d'une hypoxie / ischémie avec ou sans infection systémique / inflammation avec ligature carotidienne unilatérale suivie d'une exposition à l'hypoxie avec ou sans injection de lipopolysaccharide endotoxine (LPS). L'immunohistochimie de la protéine de myéline de base (MBP) ou O1 et examen au microscope électronique montrent une perte de myéline importante dans la substance blanche cérébrale avec des dommages supplémentaires à l'hippocampe et le thalamus. Création de modèles de souris de PVL va grandement faciliter l'étude de la pathogenèse de la maladie en utilisant des souches de souris transgéniques disponibles, la conduction des essais de médicaments d'une manière un débit relativement élevé pour identifier les agents thérapeutiques candidats, et les essais de transplantation de cellules souches en utilisant des souches de souris immunodéficience.

Protocole

Les procédures détaillées de création d'une lésion cérébrale néonatale chez la souris P6:

1. Postnatale jour 6 (P6) souris sont anesthésiées avec un refroidissement indirect sur la glace au point d'insensibilité à une stimulation nociceptive (anesthésie profonde).
2. Après le nettoyage de la peau avec de l'alcool, une incision médiane ventrale est faite dans le cou antérieur.
3. Sous un microscope à dissection, la bifurcation de l'artère carotide commune droite est approché par les muscles en douceur rétracter omohyoïdien et sternocléidomastoïdien.
4. Le fascia autour de la gaine carotidienne est enlevée, et la branche proximale interne isolé du nerf pneumogastrique et à proximité des ganglions sympathiques avec un crochet. L'artère carotide interne est alors cautérisée avec une pointe de cautériser.
5. Après la cautérisation, l'incision cutanée est suturée et l'animal est gardé au chaud jusqu'à ce totalement éveillé et est ensuite retourné au barrage.
6. Une heure après la ligature, l'animal est placé dans une enceinte étanche infusé avec de l'azote jusqu'à un niveau de 6,0% de O ₂ est atteint. L'animal est alors exposé à 35 min de l'hypoxie.
7. Après l'exposition l'hypoxie, la souris récupère sur un coussin chauffant (33 ° C) pendant 30 min puis est retourné au barrage. Pour la création d'une lésion cérébrale à l'hypoxie combinée / ischémie et infection / inflammation, l'animal est ensuite injecté par voie intrapéritonéale avec 0,015 ml de lipopolysaccharide (LPS, 1 mg / kg).
8. Quatre jours post-hypoxia/ischemia, les souris sont anesthésiées avec un refroidissement indirect sur la glace au point d'insensibilité aux stimuli nocifs, alors perfusés avec du paraformaldéhyde 4% salines et ensuite. Les cerveaux sont retirés et cryoprotégés.

Figure 1. Caractérisation des lésions cérébrales dans le modèle souris hypoxiques / ischémiques avec coloration H & E. Il ya une nécrose focale (flèches) dans la substance blanche cérébrale homolatérale (A) à la ligature des carotides, par rapport à la matière blanche cérébrale controlatérale (B). Nécrose focale homolatéral et micro-infarctus sont observées dans l'hippocampe (C) et le thalamus (D) dans le cerveau avec des lésions ipsilatérales substance blanche cérébrale.

Les résultats représentatifs et chiffres:

Des modèles murins de PVL à une hypoxie / ischémie et / ou inflammation / infection sont obtenus par ligature carotidienne unilatérale suivie d'une exposition à l'hypoxie et l'injection de LPS. Nous définissons des modèles de souris nouveaux modèles appropriés PVL. Examen neuropathologique des coupes coronales colorées à l'hématoxyline-éosine et (H & E) à travers l'ensemble du cerveau antérieur révèle une nécrose focale en la matière blanche centrale de l'hémisphère cérébral ipsilatéral à la ligature des carotides (fig. 1A), avec une épargne relative des neurones dans le cortex cérébral recouvrant par rapport à la matière blanche cérébrale controlatéral (Fig. 1B). En la matière blanche nécrotique focale, il est marqué augmentation de la cellularité composé de macrophages et les astrocytes réactifs, comme il est caractéristique de PVL humaine focale. En la matière blanche centrale controlatérale, les noyaux sont disposés en oligodendrogliales fasciculaire-comme des paquets; cette architecture est complètement perturbé par la nécrose focale du côté ipsilatéral. Fait à noter, on observe également une nécrose ipsilatérale dans l'hippocampe (figure 1C) et le thalamus (microinfarctus focale) (Fig. 1D) dans le cerveau avec des lésions ipsilatérales substance blanche cérébrale. PVL homme n'est pas non plus se produire dans l'isolement complet de l'accompagnement des lésions de la matière grise. La caractéristique de PVL est relatif, bien que n'étant pas complète, épargnant du cortex cérébral recouvrant la matière blanche blessés - une caractéristique que nous croyons est présent dans nos modèles de souris.

Figure 2. Échelle de notation de 0-5 pour l'évaluation des lésions de la substance blanche par MBP ou O1 dans des souris modèles de la leucomalacie périventriculaire.

Nos modèles de souris montrent des caractéristiques de PVL, tant au niveau phénotypique et moléculaire. Nous avons utilisé la détection immunocytochimique de la protéine de myéline de base (MBP) ou O1-antigène pour évaluer des blessures, ont établi une échelle normalisée de 0 à 5 au score de l'accident de la substance blanche (Fig. 2), et ont caractérisé la substance blanche pathologique (Fig. . 3). Plus récemment, un test non biaisé stéréologiques a été mis en place pour remplacer la première méthode semi-quantitative. De plus, pour tester les effets corrélatifs de blessure de la substance blanche sur les résultats fonctionnels, nous avons effectué des tests de comportement pour la fonction motrice. Nous avons démontré que les souris présentent des déficits moteurs frappant hypoxie suivantes P10-21 / ischémie, plus LPS à P6. Nous avons établi des critères de notation avec une échelle de 0-4 pour définir la dysfonction membre controlatéral chez des souris blessées au P10-21. Typiquement, les souris normales peut détaler en place un plan incliné à 30 ° (score de 4) et monter un plan incliné à 45 ° sans glisser (score de 3). Souris blessés ont des scores plus faibles en corrélation avec les degrés de blessure de la substance blanche.

Figure 3. Caractérisation des lésions de la substance blanche par la MBP ou O1 coloration et la structure de myéline par microscope électronique (ME). MBP et coloration O1 montrent perte de myéline de la substance blanche cérébrale homolatérale à la ligature, par rapport à la matière blanche controlatérale. EM examen montre axones myélinisés dans la substance blanche cérébrale controlatéral à la ligature et dégénéré de tissus dans la matière blanche homolatérale.

Nous prévoyons que la création de la nouvelle souris modèles de PVL va nous permettre d'étudier les mécanismes spécifiques de PVL comme les blessures au cerveau immature. Nous nous pencherons sur la pathogenèse en utilisant des souches de souris transgéniques pour étudier le rôle des molécules individuelles d'intérêt et d'évaluer des cibles de neuroprotection.

Discussion

Blessure au cerveau en développement conduit à des conséquences dévastatrices neurologiques. Étonnamment, le modèle de lésion cérébrale périnatale est fortement dépendant de l'âge. En nés à terme, elle touche principalement les cortex cérébral avec perte neuronale caractéristique. Cependant, chez les nourrissons prématurés, il affecte sélectivement la substance blanche cérébrale avec des lésions importantes aux oligodendrocytes en développement, un trouble appelé leucomalacie périventriculaire (LPV). L'ampleur du problème de la lésion cérébrale chez le prématuré est extraordinaire. Accouchement prématuré et l'amélioration des soins néonatals intensifs ont conduit à près de 90% de survie des 13 millions de nourrissons prématurés dans le monde (environ 56.000 aux Etats-Unis) par an née avec un poids en grammes 1500, c'est à dire, très faible poids de naissance. Environ 10% des survivants présentent ensuite une paralysie cérébrale et environ 50% ont des déficits cognitifs et comportementaux. PVL est le cerveau de pathologie sous-jacente le plus important de paralysie cérébrale chez les prématurés. Aucun traitement spécifique pour PVL existe actuellement, en partie parce que la pathogenèse n'a pas été bien compris ^1,2.

Bien que l'étiologie de PVL est multifactorielle, périnatale hypoxie / ischémie avec infection intra-utérine de la mère est pensé pour être une cause primaire de PVL. Un modèle hypoxique / ischémique de PVL chez le rat à P7 a été précédemment établi ^3. Ce modèle est unique en ce qu'il ressemble PVL chez les prématurés. La caractéristique de ce modèle est sélectif de la substance blanche pathologique, contrairement à la plupart des modèles course qui se caractérisent par un infarctus matière grise. Toutefois, les limites du modèle hypoxique-ischémique chez le rat ne doit pas être négligée. Tout d'abord, l'étiologie de la PVL est souvent multifactorielle. En plus de l'inflammation hypoxie / ischémie, l'infection materno-fœtale / est fortement associée à la PVL. Ainsi, l'inflammation associée hypoxie / ischémie et infection / serait probablement créer des modèles plus PVL-like. L'âge des rongeurs meilleurs qui corrèle avec la période humaine du développement de plus grands risques pour les lésions de PVL (24-32 semaines de gestation) est parce que la différenciation postnatale oligodendrogliales est surtout un évènement postnatale chez les rongeurs. Comme il est impossible de produire une infection materno-fœtale / inflammation dans les âges postnataux, il serait raisonnable pour simuler une infection à un stade de développement post-natal pertinentes pour créer un modèle rongeur de la PVL. Nous avons cherché à combiner l'injection de LPS avec le modèle hypoxique / ischémique chez la souris à P6, pour produire plus de lésions cliniquement pertinente PVL. Deuxièmement, la preuve optimale de concept pour une approche expérimentale rôle causal d'une molécule nécessite l'utilisation de souris transgéniques; les manipulations génétiques sont beaucoup plus difficiles chez le rat que chez la souris. Ainsi, nous avons cherché à convertir notre modèle expérimental de PVL du rat à la souris.

Des modèles murins de PVL va grandement faciliter 1) l'étude de la biologie et la pathogenèse des maladies en utilisant des souches de souris transgéniques disponibles, 2) la conduction des essais de médicaments pour découvrir les agents des candidats ayant un potentiel thérapeutique; 3) des tests de l'utilité des cellules souches en utilisant des souches de souris immunodéficientes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L4130
Hypoxia Chamber	BioSpherix	A-30274
Surgical hook	F.S.T.	10064-14