Amélioration de la visualisation et l'analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

Résumé

Micropatterns adhésif qui normalisent l'architecture cellulaire peut être utilisé pour augmenter la sensibilité dans la détection des effets des médicaments, améliorer la reproductibilité et de simplifier l'acquisition automatique d'images et d'analyse. Une telle technologie bénéficieront tests de dépistage de drogue / siARN, réalisée sur conventionnelles soutient la culture cellulaire et par conséquent souffrent d'excès de cellule à cellule variabilité.

Résumé

À ce jour, la plupart des HCA (analyse de contenu haute) des études sont réalisées avec des lignes de cellules adhérentes cultivées sur un substrat homogène en culture de tissus traités micro-plaques. Dans ces conditions, les cellules réparties et diviser dans toutes les directions résultant en une variabilité inhérente à la forme des cellules, la morphologie et le comportement. La grande cellule à cellule variance de la population globale font obstacle au succès du HCA, en particulier pour le développement de médicaments. La capacité de micropatterns pour normaliser la forme et la polarité interne de chaque cellule individuelle offre une formidable opportunité pour résoudre ce goulot d'étranglement critiques ^1-2.

Pour faciliter l'accès et l'utilisation de la technologie micropatterning, CYTOO a développé une gamme de prêt à l'emploi micropatterns, disponible en formats lamelle et micropuits. Dans cet article, vidéo, nous fournissons des protocoles détaillés de toutes les procédures de l'ensemencement de cellules sur micropatterns CYTOOchip, le traitement médicamenteux, la fixation et la coloration à l'acquisition automatisée, traitement d'image automatique et d'analyse des données finales. Avec cet exemple, nous illustrons comment micropatterns peut faciliter dosages cellulaires. Les altérations du cytosquelette de la cellule sont difficiles à quantifier dans les cellules cultivées sur des substrats homogènes, mais la culture de cellules sur les résultats micropatterns dans une organisation reproductible du treillis d'actine due à un positionnement systématique des contacts d'adhérence cellulaire dans chaque cellule. Une telle normalisation de l'architecture intracellulaire permet de quantifier, même de petits effets sur le cytosquelette d'actine comme l'a démontré dans ces ensemble de protocoles utilisant blebbistatin, un inhibiteur de l'interaction actine-myosine.

Protocole

1. Préparation des cellules et des semis sur micropatterns

1. Placer 2 CYTOOchips dans 2 puits d'une plaque indépendante 6 ainsi s'assurer que vous lisez "CYTOO" dans le coin inférieur droit de l'CYTOOchip. Micropatterns peut être marqué par fluorescence avec des colorants Cy3 ou Cy5. CYTOOChips utilisés pour cette expérience ont marqué par fluorescence Cy3 micropatterns.
   ATTENTION: Gardez les puces dans l'obscurité.
2. Recueillir les cellules HeLa (confluentes ~ 80%) par trypsinisation. Vérifiez sous un microscope que les cellules sont correctement dispersées par le traitement à la trypsine. Recueillir et centrifuger les cellules à 300g pendant 4 min, puis doucement resuspendre le culot cellulaire. Compter les cellules et diluer à une concentration de 15 000 cellules / ml dans les milieux de culture DMEM/F12 complété.
3. Distribuer 4 ml (60 000 cellules) dans chaque puits contenant un CYTOOchip.
   ATTENTION: La plaque doit être déplacé aussi peu que possible afin d'éviter toute induction de mouvements de rotation dans le milieu comme cela aura tendance à concentrer les cellules au centre.
4. Laissez les sédiments des cellules pendant 10 min sous le capot, puis déplacez-les dans l'incubateur de cellules. Après 10-20 min, les cellules commencent à adhérer à la micropatterns. Après 10 minutes, vérifier régulièrement sous le microscope.
5. Dès que les cellules ont joint, changer le milieu cellulaire et doucement rincer la surface à l'aide lamelle la procédure suivante:
6. Maintenir la plaque plane, doucement aspirer le support avec une pipette du côté du puits.
   ATTENTION: Ne jamais laisser la puce à sec, cela signifie ne jamais aspirer hors tout le liquide, laissant assez pour couvrir le CYTOOchip à tout moment.
7. Ajouter 4 ml de PBS et aspirer à nouveau au premier démarrage du centre de la puce, puis de passer à côté du puits. Aspirer le PBS comme décrit sans exposer la puce à l'air. Répéter 3-4 fois.
8. Vérifiez sous le microscope des cellules flottantes:
   • Si un grand nombre de cellules flottantes restent, répétez la procédure de lavage.
   • Si vous voyez très peu de cellules, aspirer une partie de la PBS et le remplacer par 2 ml de milieu frais. Aspirer et ajouter 4 ml de milieu frais deux fois.
9. Placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pour un minimum de trois heures pour permettre aux cellules de réaliser pleinement la propagation.
   REMARQUE: En utilisant cette méthode entre 10-30% (2000-6500) micropatterns seront occupés par un seul ou plusieurs cellules.
   ATTENTION: Le temps nécessaire pour les cellules d'adhérer avant l'étape de lavage et le temps nécessaire pour toute propagation de cellules sur micropatterns seront spécifiques à chaque lignée cellulaire.

2. Traitement Blebbistatin

1. Dissoudre le blebbistatin dans le DMSO à 100% pour obtenir une solution stock de 17 mM. Diluer la solution mère suite à 5 mm avec du DMSO à 100%. Faire une dilution finale en milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 5 blebbistatin uM dans DMSO à 0,1%.
2. Pour les conditions de contrôle, de préparer 4 ml de milieu contenant du DMSO 0,1% seulement.
3. Aspirer les médias sur les cellules et le remplacer par le moyen 4 ml préparée pour les conditions de traitement et de contrôle.
4. Incuber les cellules pendant 1 heure à 37 ° C.

3. Fixation des cellules et la coloration de l'actine

1. Préparation de solution pour la fixation des cellules
   S'il vous plaît voir la section réactif pour la préparation du cytosquelette tampon (CB) et l'IFP 5%. CB est particulièrement recommandé pour le marquage par fluorescence des filaments d'actine et les microtubules.
   • Préparer 1xCB-saccharose: ajouter 1 g de saccharose à 2 mL de CB.
     L'inclusion de saccharose contribue à préserver les structures cellulaires internes.
   • Préparer 4% PFA-CB-saccharose: Ajouter 1 mL de 1xCB-saccharose à 4 ml d'eau tiède PFA 5%.
     ATTENTION: Cette solution peut être conservé à 4 ° C pendant quelques jours seulement.
2. Fixation PFA
   • Utilisez une pince pour ramasser les CYTOOchip sur le logo et le placer CYTOO (sans lavage) dans un puits d'une plaque de 6 puits contenant 2 mL de 4% PFA-CB-saccharose solution
   • Incuber 10 min à température ambiante
   • Retirer PFA-CB-saccharose et laver une fois avec du PBS
   • Faites un deuxième lavage avec 2 ml de 100 mM de NH ₄ Cl pendant 10 min afin d'étancher activité résiduelle de réticulation PFA
     REMARQUE: diapositives PFA fixes peuvent être stockées dans du PBS pendant plusieurs jours à 4 ° C avant la coloration fluorescente pour l'imagerie organite.
3. Perméabilisation de la membrane cellulaire avec du Triton X-100
   Perméabilisation des cellules avec un détergent permet d'anticorps ou d'autres sondes de pénétrer la membrane cellulaire et élimine certains de la piscine cytosolique des protéines du cytosquelette qui peut réduire autrement le contraste des polymères du cytosquelette qui rend difficile d'analyser leur localisation.
   • Retirer NH ₄ Cl et ajouter 2 ml / puits de 0,1% de Triton X-100-CB pendant 3 min à température ambiante
   • Laver deux fois avec 2 ml de PBS
4. Coloration d'actine
   Fluorescent-phalloïdine quih lie à l'actine natif est uniquement utilisé pour colorer les filaments d'actine.
   • Ajouter 2 mL de conjugué FITC dilué 1:2000 phalloïdine dans du PBS avec 1,5% de BSA
   • Incuber 1 h à température ambiante
   • Laver une fois avec 2 ml de PBS
5. Coloration des noyaux
   • Ajouter 2 mL de Hoechst (tache avec 1 pg / ml dans PBS)
   • Incuber 3 min à température ambiante
   • Laver 2 fois avec 2 ml de PBS
6. Montage de diapositives
   • Ramassez la CYTOOchips sur le logo et le CYTOO CYTOOchip monter sur une lame de microscope standard à l'aide de 25 à 30 uL de Mowiol ou toute autre solution de montage.

4. Installation du microscope et de l'acquisition d'images automatisé

De nombreux logiciels d'imagerie existent qui contrôlent le microscope pour l'acquisition rapide d'images automatisé et l'affichage. Cet exemple utilise le logiciel d'imagerie Metamorph et acquisitions automatiques sont effectués sur un microscope Nikon Eclipse Ti équipé d'une caméra CCD Hamamatsu et une Intensilight mercure fibre illuminateur. Les images sont acquises à un grossissement de 20x en trois longueurs d'onde correspondant au DAPI (noyaux), Cy-3 (micropatterns) et phalloïdine-FITC (actine). Le nombre de micropatterns visualisées par champ varie en fonction de la caméra et les réglages objectif. Micropatterns CYTOO sont positionnés à des intervalles définis les uns des autres (100 ou 130 um) à travers la puce facilite grandement l'acquisition.

1. Sélectionnez un grossissement de 20x
2. Ouvrez Acquisition (Multidimensional dans la barre de Menu: Applications / Acquisition multidimensionnelle) et mettre en place les différents paramètres de l'expérience:
   • Nombre de longueurs d'onde: 3
   • Types de longueur d'onde: DAPI, FITC, Cy3
   • Réglez le temps d'exposition pour chaque longueur d'onde d'abord se concentrer sur un champ de cellules
   • L'autofocus peut être effectuée sur chaque longueur d'onde
   • Sélectionnez où vous souhaitez enregistrer les données
3. Sélectionnez Cy3 longueur d'onde et la position de la caméra de sorte que 12 micropatterns sont visualisés et centré dans le champ de la caméra (4 colonnes et 3 rangées de motifs).
4. Créer un journal courir Acquisition multidimensionnelle. La procédure de création d'un journal est décrit dans la figure 1.
5. Ouvrez la fonction phase de numérisation (dans la barre de menu: Périphériques / Stage / Scan scène). Afin d'acquérir 24 images contenant chacun 12 micropatterns à un grossissement de 20x, entrez 6 colonnes et 4 rangées avec -400 um taille de pas X et la taille de 300 um Y étape. Dans Journal SET pour exécuter, téléchargez le MDA.JNL journal. Ensuite, appuyez sur Scan pour démarrer l'acquisition automatisée de l'ensemble du bloc dans les trois longueurs d'onde.
   REMARQUE: Les X et Y tailles étapes indiquées ici peuvent varier selon le nombre de micropatterns présents dans un champ de la caméra. Selon votre stade de mettre en place, la direction en X et / ou Y peut exiger des valeurs négatives pour le mouvement dans la bonne direction.

5. Traitement d'image automatisée et l'analyse

De nombreux packages d'image des logiciels de traitement et d'analyse existent. Les procédures décrites ci-dessous le traitement d'image et de décrire les étapes d'analyse effectué par deux faits sur les macros écrites pour le programme source ouverte ImageJ. Le premier CellRef macro crée une cellule de référence, l'hypoténuse seconde rigidité des mesures / effondrement de la membrane cellulaire. Les deux sont disponibles sur simple demande auprès www.cytoo.com .

1. Créer des piles d'images pour les trois canaux centrés sur micropatterns (macro CellRef).
   L'utilisation de cellules micropatterns évite le regroupement et l'agglutination, qui simplifie grandement la première étape du traitement automatisé des images qui est la localisation et la segmentation des cellules individuelles. Les images marquées par fluorescence Microdétail sont utilisés pour définir et délimiter les régions centrées sur les micropatterns. Ces régions sont ensuite transposées sur les images acquises dans d'autres canaux et recadrée. Correspondant images recadrées sont ensuite assemblés en piles pour chaque longueur d'onde. Un RVB-pile est également créé à partir de la fusion des trois canaux (figure 2).
2. Appliquer sélection en une seule cellule de filtrage (macro CellRef)
   Comme indiqué ci-dessus, 10-30% (2000-6500) de l'micropatterns sont occupés par une seule cellule ou plusieurs cellules, tandis que le reste micropatterns sont vides. Pour sélectionner des images qui montrent micropatterns occupé par seulement une seule cellule, la macro détecte le nombre de noyaux par l'image et élimine de toutes les piles (RVB et différentes longueurs d'onde) ceux contenant plus d'un noyau ou sans noyau (Figure 3).
3. Éliminer non normalisées et les cellules qui ne sont pas entièrement tendu au Microdétail aide de coupure secteur cellule de filtrage (macro CellRef)
   Pour supprimer la division des cellules qui ont échappé au filtre des noyaux, un autre filtre en utilisant le canal FITC pour l'actine est appliquée. Zone de cellule est calculée et ceux en dessous d'une certaine hors coupées (zones de cellules d'environ 2 fois moins que la zone de cellules en interphase) sont retirés de toutes les piles. La zone de l'enveloppe cellulaire est déterminée par la taille du motif.
4. Aligner les images cellulaires (macro CellRef)
   Des étapes précédentes, les images contenant des cellules uniques micropatterned ont été sélectionnés. Même si ces images sont centrées sur micropatterns, ils ne sont jamais tous parfaitement alignés les uns aux autres. Pour conclure le traitement d'image, un plugin ImageJ (MultiStackReg) est appliqué à toutes les images collectées réaligner et tous les canaux basé sur la position Microdétail. Cette étape génère des piles alignées des images individuelles qui peuvent désormais être utilisés pour l'analyse seule cellule ou la création d'une cellule de référence (figure 4)
5. Construction d'une cellule de référence (macro CellRef)
   Des cellules en croissance sur le micropatterns signifie que toutes les cellules ont des formes similaires. Cette normalisation permet un alignement précis et la superposition des images de cellules nombreuses. Résumant le signal dans chaque image sur la pile entière permet de visualiser et de mesurer un «effet moyen des médicaments". L'image finale globale ou cellule de référence est un outil unique et utile pour la représentation et l'analyse d'image et ne peut être obtenu avec des cellules micropatterned (figure 4). En ImageJ, la cellule de référence est construit en faisant une projection des images filtrées et alignés sur une pile (Image> Stacks> Z-projet). Plusieurs méthodes de projection peuvent être appliqués tels que l'intensité moyenne ou maximale, mais généralement une projection médiane est retenue ce qui élimine les valeurs aberrantes principal de la pile d'image. Afin de faciliter l'examen des résultats, une LUT (Look Up Tables) convertir l'image monochrome en une carte de fréquence de couleur est appliquée.
6. Mesurer et de quantifier les paramètres d'intérêt (Hypoténuse macro)
   Dans cet article, vidéo, L-micropatterns sont utilisés parce que la forme organise le cytosquelette d'actine dans une fibre de stress majeur unique. En mettant en évidence l'actine de cette façon, l'impact blebbistatin sur le cytosquelette peut être déterminé de plusieurs façons: la mesure des changements dans la courbure de la fibre de stress d'actine, intensité de coloration, la longueur ou l'épaisseur de la fibre de stress, les changements dans les caractéristiques morphométriques des filaments d'actine ou de etc la forme des cellules Ces paramètres peuvent être mesurés soit sur des images de cellules individuelles ou sur la cellule de référence final lui-même.
   Ici, l'impact de 5 blebbistatin uM a été caractérisée par le comptage du nombre de cellules effondrées en utilisant une deuxième ImageJ macro nommée Hypoténuse (figure 7). Brièvement, les images seuillée de la L-Microdétail sont utilisés pour définir une hypoténuse théorique de la forme triangulaire de cellule. Ensuite, seuillage des images tachées actine est réalisée afin de rapprocher la forme des cellules réelle. La zone située entre l'hypoténuse du triangle théoriques cellulaire et la membrane cellulaire réelle concave est alors mesurée. Lorsque la cellule s'est effondré, une zone sous l'hypoténuse théoriques apparaît. Le pourcentage de cellules effondrées est utilisée pour comparer le contrôle et traités conditions.

6. Les résultats représentatifs

Des exemples de ce que les cellules devrait ressembler sur micropatterns immédiatement et pendant plusieurs heures après les étapes de lavage critiques décrites dans 1.6 à 1.8, sont présentés dans la Figure 5. Après 15 min à CYTOOchips, rond cellules HeLa sont observés à des distances égales ce qui indique qu'ils ont adhéré à la micropatterns fibronectine (figure 5a). L'adhérence est complète lorsque les cellules restent immobilisés en dépit agitation douce du récipient de culture. Afin de minimiser le nombre de micropatterns occupé par plusieurs cellules, les puces sont ensuite rincés avec du PBS pour éliminer les cellules flottantes sur les zones cytophobic. Après plusieurs heures, les cellules qui sont entièrement tendu sur la micropatterns ressemblera ceux montrés sur la figure 5b.

Typiques des images seule cellule obtenue après incubation des cellules avec blebbistatin, la fixation et la coloration de l'actine et les noyaux sont présentés dans la figure 6. Après l'acquisition automatisée d'images multiples et le traitement d'image en utilisant les ImageJ CellRef macro, une carte de fréquence de couleur est généré qui dépeint l'intensité de l'actine en moyenne sur toutes les images de cellules (figure 6c et 6f). La comparaison de la cellule de référence pour des conditions non traitées et traitées montre le potentiel de cette approche pour l'observation du phénotype facilement à l'étude et est particulièrement utile pour explorer les effets des médicaments cellulaires.

Un exemple d'une analyse possible de l'effet de blebbistatin sur les cellules est présenté dans la Figure 7. Le nombre de cellules effondrées (ie. les cellules avec une zone vide existant en vertu de l'hypoténuse théorique) détectée dans 50 cellules de contrôle et 50 cellules traitées avec 5 uM blebbistatin détectée par la macro Hypoténuse ImageJ est montré. L'augmentation du nombre de cellules effondrées dans la population traitée blebbistatin reflète relâchement des fibres de stress et donc la tension à la membrane due à l'inhibition des forces blebbistatin actinomyosin contractiles dans la cellule.

Figure 1. Procédure pour créer un nouveau journal avec Metamorph.

Tableau de flux Figure 2. De la procédure de traitement automatique de l'image.

Figure 3. Filtrage des cellules individuelles.

Figure 4. Bâtir une cellule de référence.

Figure 5. Ensemencement cellulaire. A) Des cellules Hela respectées micropatterns après l'étape de rinçage (grossissement 4x) B) les cellules HeLa après complète épandage sur micropatterns L (grossissement 10x).

Figure 6. Comparaison des cellules et des nonpatterned micropatterned dans le contrôle et la drogue conditions traitées. Des cellules HeLa ont été ensemencées pendant 3 heures et traités avec 5 blebbistatin uM pendant 1 heure (panneau inférieur) ou elle n'est pas traitée (panneau supérieur). Dans les cellules de contrôle nonpatterned (a), l'actine assemble en fibres multiples qui démontez imperceptiblement par traitement avec 5 blebbistatin uM (d). Le L-micropatterns, les cellules de contrôle adoptent une forme triangulaire (b) et de développer une fibre d'actine majeurs (fibre de stress) entre les deux sommets de l'L. Par rapport aux cellules nonpatterned (d), blebbistatin induit un changement majeur phénotypiques sur la L-micropatterned cellules (e). La visualisation directe des effets de la drogue et la comparaison des conditions de contrôle et traitées peuvent être visualisées rapidement avec la présentation cellule de référence construit à partir de 20 cellules. Semblables à des cellules individuelles, une fibre de stress intense est clair et présent sur la cellule de référence de contrôle (C), tandis que l'effondrement des cellules traitées blebbistatin et la fibre de stress majeur disparaît (f).

Figure 7. Exemple d'une analyse des effets de la blebbistatin sur les cellules en utilisant l'hypoténuse macro. Alors que 25% des cellules de contrôle ont été regroupées, cette augmentation de 3 fois à 75% dans les 5 cellules blebbistatin uM traitées reflétant l'affaiblissement actinomyosin contractiles réseau (n = 50 cellules).

Discussion

Choix de Microdétail

Alors que les effets de la 5 blebbistatin uM sont à peine détectables sur des supports de culture standard, la quantification efficace est possible sur micropatterns qui concentrent l'actine dans une fibre de stress majeur unique. Cela améliore la visualisation du cytosquelette d'actine aider quantification précise des effets blebbistatin sur la cellule. Le choix de la forme Microdétail est critique dans la conception de l'essai et est conçu en fonction de l'évolution phénotypique d'être mis en évidence dans l'étude.

Conclusions

Micropatterns faciliter la visualisation et la quantification des effets des médicaments, en particulier à de faibles concentrations. Le remplacement des substrats homogènes plane avec micropatterns adhésif pour dosages cellulaires améliore la précision, la sensibilité et la qualité des données produites. En conséquence, moins de cellules sont nécessaires à l'analyse afin de parvenir à des résultats robustes statistiques ^3. Micropatterns adhésives offrent une réelle opportunité pour l'amélioration des études fonctionnelles et d'explorer les changements phénotypiques à des concentrations inférieures de médicaments afin d'éviter d'induire des effets toxiques des médicaments ou indirecte. Si les plates-formes de dépistage appropriées sont utilisées, micropatterns peut répondre aux exigences des compagnies pharmaceutiques pour améliorer les applications de criblage génétique / drogue. Quelques autres exemples de publications récentes qui ont exploité micropatterns pour analyser et quantifier les phénomènes cellulaires sont cités ci-dessous ^3-13.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif		Société	Numéro de catalogue	Commentaires
La culture cellulaire
CYTOOchips 20x20 LM-FN		CYTOO	10-114	CYTOOchips sont disponibles pour l'adsorption de la protéine de votre choix
PBS 1x		Gibco	14040-091
Chambre de comptage (toboggan Kova)		Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax-I		Invitrogen Gibco-	25300-054
FBS (f Tal sérum bovin)		AAP	31331-028
La pénicilline et la streptomycine		AAP	A15-101
6 puits à plaques		Dutscher	353046
centrifugeuse		Fisher Scientific	M65838
Microscope		Nikon
Drogues, la fixation et immunomarquage
Cytosquelette tampon 1X (CB)		Sigma	MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889	MES 10 mM pH 6,1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2 mM EGTA
Saccharose		Sigma	S2395
PFA 32%		Sciences Electron Microscopy	15714
PFA 5%				Mélanger 10 ml de PFA 32% avec 54 ml de CB 1.185X
Triton-X100		Sigma	T9284
Comprimés PBS		Invitrogen Gibco-	18912-014
Bovin albumine sérique (BSA)		Sigma	A7806
Phallodin-FITC		Sigma	P5282
Hoescht		Invitrogen	H3570
Blebbistatin		Euromedex	BN0640
DMSO		Sigma	D8418
NH 4 Cl 0,1 M		Sigma	M11209
Image Acquisition
Microscope à épifluorescence		Nikon	Eclipse Ti
Caméra CCD		TBC	TBC
Logiciel ImageJ		http://rsbweb.nih.gov/ij/