Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Résumé

Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.

Résumé

Les cellules de Kupffer sont les macrophages résidents du foie spécifiques et jouent un rôle important dans les fonctions physiologiques et pathologiques du foie ^1-3. Bien que les méthodes d'isolement des macrophages du foie ont été bien décrits ^4-6, la plupart de ces méthodes nécessitent des équipements sophistiqués, comme une élutriateur centrifuges et des compétences techniques. Ici, nous proposons une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages du foie, en nombre suffisant et la pureté du mélange des cultures primaires de cellules de foie de rat adulte, comme illustré schématiquement à la figure 1.

Après dissociation des cellules du foie en deux étapes la méthode de perfusion ^7,8, une fraction essentiellement composée des hépatocytes parenchymateux est préparée et ensemencée dans T75 flacons de culture tissulaire avec un milieu de culture composé de DMEM et 10% des hépatocytes FCS.Parenchymal perdent la morphologie des cellules épithéliales dans quelques jours dans la culture, dégénèrent ou se transforment en cellules de type fibroblaste (figure 2). Comme le produit de la culture, autour du jour 6, contraste de phase-lumineux, rond cellules de type macrophage commencent à proliférer sur la feuille de cellules fibroblastiques (figure 2). La croissance des cellules de type macrophage poursuivre et atteindre des niveaux maximum autour de 12 jours, couvrant la couche de cellules sur la surface du flacon. En secouant les flacons de culture, les macrophages sont facilement en suspension dans le milieu de culture. Le transfert ultérieur et d'incubation est courte dans le résultat des plats en plastique dans l'adhésion sélective des macrophages (figure 3), où, comme d'autres cellules contaminantes restent suspendues. Après plusieurs rinçages avec du PBS, les macrophages attachés sont récoltés. Plus de 10 ⁶ cellules peuvent être récoltées à plusieurs reprises à partir du même flacon T75 culture de tissus de deux à trois jours d'intervalle pendant plus de deux semaines (figure 3). Les puretés des macrophages isolés étaient de 95 à 99%, évaluée par cytométrie de flux ou immunocytochimie avec des macrophages chez le rat des anticorps spécifiques (figure 4). Les cellules isolées montrent phagocytose active de perles polystylene (figure 5), réponse proliférative à la GM-CSF recombinant, la sécrétion des maladies inflammatoires / anti-inflammatoires des cytokines après stimulation par le LPS, et la formation de cellules géantes multinucléées ^9.

En conclusion, nous proposons une méthode simple et efficace pour obtenir des macrophages du foie, en nombre suffisant et la pureté sans équipement complexe et skills.This méthode pourrait s'appliquer à d'autres espèces de mammifères.

Protocole

1. Perfusion du foie

1. Anesthetize un adulte mâle Sprague-Dawley rats (de 10 à 15 semaines, âgé; poids corporel 150-200 g) par une injection intrapéritonéale d'une solution de pentobarbital de sodium (poids 50 mg de sodium pentobarbital / kg).
2. Placez l'animal dans une casserole inoxydable et de pulvérisation d'éthanol à 70% sur son abdomen et du thorax.
3. Faire une petite entaille et retirez la peau. Ouvrez l'abdomen par le couper avec une paire de ciseaux.
4. Confirmez l'emplacement de la veine porte, passer un fil chirurgical dans la veine porte et lâche bouquet.
5. Clump la partie distale de la veine cave inférieure et la veine mésentérique pour empêcher le reflux sanguin dans le foie. Ouvrez la cage thoracique, en coupant la membrane avec des ciseaux, et exposer le cœur.
6. Insérer un cathéter en plastique (2 mm de diamètre) dans la veine porte et serrez fermement le fil autour du cathéter.
7. Connecter le cathéter à un système de perfusion qui est chargé avec une solution de lavage (Ca ^{2 +-Mg 2 +} HBSS libre contenant 0,5 mM, EGTA 10 mM d'HEPES et 4,2 mM NaHCO _3; pH 7,2) préchauffée à 37 ° C.
8. Commencez la perfusion in situ à un taux de 10 ml / min. Dans le même temps, faire une coupe dans le mur de l'oreillette droite. Poursuivre la perfusion pendant 10 min.
9. Mettez la solution de perfusion à la solution de collagénase [HBSS contenant HEPES 10 mM et de 4,2 mm de NaHCO ₃ complété par la collagénase de type I (0,05%) et inhibiteur de la trypsine (50 pg / ml); pH 7,5], et perfuser pendant 10 - 20 min à un taux de 10 ml / min jusqu'à ce que le foie gonfle légèrement et montre le signe de la désintégration de la structure du foie sous la membrane séreuse.

2. Préparation de la fraction de cellules du parenchyme hépatocytaire riches

1. Retirer et transférer soigneusement le foie dans un bécher stérile contenant 25 ml de solution de collagénase. Hacher en petits morceaux avec des ciseaux.
2. Ajouter 75 ml de MEM froid dans la suspension cellulaire résultante. Après pipetage doux, filtrat à travers un tamis cellulaire (100 um) pour enlever les tissus conjonctifs et des fragments de tissus non digérés.
3. Transférer le filtrat dans 50 ml tubes coniques et centrifuger à 50 g pendant 1 min à 4 ° C (frein off).
4. Soigneusement jeter le surnageant. Reprendre le culot avec du MEM froid.
5. Répétez 2,4) à trois reprises.

3. Mixte culture primaire de cellules du foie

1. Suspendre les cellules obtenues à 2,5) dans le milieu de croissance composé de DMEM contenant 10% de la chaleur FCS inactivé, supplémenté avec 100 uM β-mercaptoéthanol, 10 pg / ml d'insuline, 100 ug / ml de streptomycine et 100 U / ml de pénicilline, et la semence en cinq à dix flacons de culture tissulaire (superficie: 75 cm ²⁾ à une densité de 6,7 x 10 ⁴ cellules / cm ² (5 x 10 ⁶ cellules / flacon / 12 -15 ml de milieu).
2. Incuber la culture flasksat 37 ° C dans une atmosphère de 5% CO ₂ - 95% d'air.
3. Remplacez le milieu de croissance aux 2 à 3 jours d'intervalle.

4. Isolement sélectif des macrophages

1. Après 12 jours de culture, les macrophages prolifèrent sur la feuille de cellule. Ces cellules sont suspendues par la réciprocité secouer les flacons de culture à 80 - 120 coups par minute pendant 30 min à 37 ° C.
2. Transférer le milieu de culture en 100 mm non de culture de tissus de qualité des plats en plastique. Piscine de la moyenne de deux flacons T75 dans un plat en plastique. Flacons de culture Recharge avec le milieu de croissance et les retourner à l'incubateur.
3. Incuber les plats en plastique pendant 30 min à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO _{2 à} 95% d'air. Les macrophages facilement attacher à des tissus non des boîtes de culture plastique de qualité en vertu du présent processus d'incubation, tandis que d'autres cellules contaminantes pas.
4. Aspirer le milieu et rincer doucement le plat de plastique avec du PBS. Répétez cette étape trois fois.
5. Ajouter 1 ml de solution de TrypLE express dans le plat, et incuber pendant 10min à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO _{2 à} 95% d'air.
6. Ajouter 9 ml de milieu de croissance. Grattez délicatement les macrophages attachés par un racleur de cellules.
7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 180 xg pendant 5 min à 25 ° C (frein).
8. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de croissance. Dissocient en cellules individuelles par pipetage vigoureux. Énumérer le nombre de cellules par un hémocytomètre comptage.
9. Étapes d'isolement peut être répétée avec les mêmes flacons de culture de deux à trois jours d'intervalle pendant plus de deux semaines.
10. Macrophages isolés peuvent être cultivées dans le milieu de croissance décrit dans 3.1.

5. Les résultats représentatifs

Un exemple d'une culture mixte primaire de cellules adultes de foie de rat est montré dans la figure 2. Hépatocytes parenchymateux perdent la morphologie des cellules épithéliales dans les quelques jours de culture, de dégénérer ou se transformer en fibroblastes comme des cellules.Puis, autour du jour 6 à 12, contraste de phase-lumineux, rond cellules de type macrophage vigourouly prolifèrent sur la feuille de la cellule fibroblastique. En secouant les flacons de culture, les macrophages sont facilement en suspension dans le milieu de culture, et le transfert subséquent et l'incubation dans des plats en plastique dans le résultat d'adhésion sélective des macrophages (figure 3). Les cellules de type macrophage peuvent être récoltées dès le jour 8, et les chiffres ont atteint des niveaux maximaux sur les jours 12 à 14. Plus de 10 ⁶ cellules peuvent être récoltées à partir d'un flacon T75 culture répétée 2 à 3 jours d'intervalle pendant plus de deux semaines, permettant un rendement total de cellules par flacon de 10 ⁷ par T75 flacon de culture (figure 3). Les puretés des macrophages isolés étaient de 95 à 99%, tel qu'évalué par flowcytometry ou immunocytochimie avec des rats macrophages anticorps spécifiques, tels que ED-1 (figure 4), ED-3, OX-41 (figure 4) et Iba1 ^9. Les cellules isolées montrent des caractéristiques typiques des macrophages, comme la phagocytose active de perles polystylene (figure 5), réponse proliférative à la GM-CSF recombinant, la sécrétion des maladies inflammatoires / anti-inflammatoires des cytokines après stimulation par le LPS, et la formation de cellules géantes multinucléées ^9.

Figure 1. Un système d'isolement sélectif et de purification des cellules de type macrophage de la culture de cellules primaires mixtes de foie de rat.

Figure 2. Culture primaire de cellules de foie de rat et la prolifération des cellules de type macrophage. La flèche indique une cellule géante multinucléaire. Barre d'échelle = 100 pm. Reproduit de la Revue des méthodes immunologiques, Vol.360, 47-55 (2010) ⁹ avec la permission d'Elsevier.

Figure 3. Isolement sélectif des cellules de type macrophage par le tremblement et la méthode de fixation. Les cellules ont été suspendues dans le milieu de culture en secouant les flacons, par la suite transférés dans des boîtes de culture de tissu non plastique de qualité, et incubées à 37 ° C. Dès 10 min après le placage, cellules de type macrophage attaché à la surface plat, tandis que d'autres cellules fibroblastiques contaminant est resté suspendu. Après rinçage avec du PBS, une population de macrophages hautement purifiée a été obtenue. Ces cellules gagné la morphologie des macrophages typiques après 40 min de la culture, et les cellules mitotiques ont été fréquemment observés (flèches). Les variations ultérieures de nombre de cellules récupérées à partir des flacons à des périodes différentes cultures sont représentées. Les valeurs sont une moyenne ± écart de trois à cinq flacons. Des expériences ont été répétés trois fois et les données sont indiquées par des symboles différents. Barre d'échelle = 100 pm. Reproduit de la Revue des méthodes immunologiques, Vol.360, 47-55 (2010) ⁹ avec la permission d'Elsevier.

Figure 4. Coloration immunocytochimique des cellules de type macrophage avec des anticorps monoclonaux contre les macrophages de rat.

Figure 5. Phagocytose des microbilles marqué FITC par cellules de type macrophage.

Discussion

Nous rapportons ici une méthode simple et efficace d'obtenir des macrophages dans les cultures mixtes primaires de l'adulte les cellules du foie de rat. Notre méthode repose d'abord sur l'activité proliférative roman de macrophages dans la culture mixte de cellules de foie de rat, puis l'isolement et la purification ultérieure de ces cellules sur la base de leurs caractéristiques biologiques comme les macrophages ^9. Il peut être possible les macrophages proliféré dans la culture mixte de cellules primaires du foie adulte peut provenir de Kupffer ou des cellules liées qui ont contaminé dans la fraction du parenchyme hépatocytes. Les macrophages pourraient avoir répondu à des changements environnementaux causés par la transformation du parenchyme hépatocytaire ¹⁰ et d'autres cellules fibroblastiques dans les cultures mixtes primaires.

En conclusion, notre méthode permet d'isoler des cellules de type macrophage, en nombre suffisant et la pureté de la culture primaire de foie de rat en utilisant cellswithout équipements sophistiqués et des compétences techniques. En outre, la procédure d'isolement peut être répétée avec le ballon de la même culture pendant plus de deux semaines. Cette méthode pourrait être applicable à d'autres espèces de mammifères.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Solution de pentobarbital sodique	Kyoritsu Seiyaku	Injection Somnopentyl
Hank solution saline équilibrée (HBSS)	Invitrogen	14185-052
L'éthylène glycol tétraacétique (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
Collagénase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	032-10534	Dissociation cellulaire de grade (Lot vérifier au besoin)
Inhibiteur de la trypsine	Sigma-Aldrich	T-9128
Eagle milieu essentiel minimum (MEM)	Sigma-Aldrich	M-4655
Modifié par Dulbecco Eagle (DMEM)	Sigma-Aldrich	D-6459	Haute de glucose de type
Sérum de veau foetal (FCS)	HyClone	SH30070.03	Inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min. (Lot vérifier au besoin)
TrypLE express	Invitrogen	12605
Phosphate de Dulbecco saline tamponnée (PBS)	Invitrogen	14190	Ca 2 +-Mg 2 + libre
β-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M-7522	Stock: 100 mM dans l'eau distillée
Insuline	Sigma-Aldrich	I-5500	Stock: 10 mg / ml dans HCl 0,1 N
Pénicilline / streptomycine	Invitrogen	15070
Tamis cellulaire	BD Biosciences	352360	Maillage: 100 um
Flacon de culture tissulaire	Sumitomo Bakelite Co., Ltd	MS-21250	Surface: 75 cm 2
Des boîtes de culture tissulaire en plastique non-	BD Biosciences	351005
Grattoir à cellules	Corning Inc	3010
Réciproque agitateur	TAITEC	NR-1