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Method Article
Une question fondamentale dans notre compréhension des circuits corticaux est de savoir comment les réseaux dans différentes couches corticales codent l'information sensorielle. Ici, nous décrivons des techniques électrophysiologiques utilisant des électrodes laminaires multi-contact pour enregistrer une seule des unités et des potentiels de champ local et des analyses actuelles afin d'identifier les couches corticales.
Couches corticales sont omniprésents dans les structures néocortex 1-4 qui se composent de très récurrente des réseaux locaux. Ces dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans notre compréhension des différences dans les propriétés de réponse des neurones dans les différentes couches corticales 5-8, mais il reste encore beaucoup à apprendre si et comment les populations neuronales coder les informations spécifiques à un laminaire manière.
Existants multi-électrodes techniques de tableau, bien instructif pour mesurer les réponses à travers plusieurs millimètres d'espace cortical le long de la surface corticale, sont impropres à l'approche de la question des circuits corticaux laminaire. Ici, nous présentons notre méthode de création et d'enregistrement des neurones individuels et potentiels de champ locaux (LFPs) à travers les couches corticales du cortex visuel primaire (V1) en utilisant des électrodes laminaires multi-contact (figure 1; Plextrode U-Probe, Inc Plexon).
Les méthodes de construction sont inclus appareil d'enregistrement, l'identification des couches corticales, et l'identification des champs récepteurs des neurones individuels. Pour identifier les couches corticales, on mesure le potentiel de réponse évoquée (ERP) de la LFP séries chronologiques en utilisant plein champ stimulus flashé. Nous effectuons ensuite source de courant de densité (CDD) analyse pour identifier les inversions de polarité accompagnés par la configuration du puits-source à la base de la couche 4 (l'évier est à l'intérieur la couche 4, ci-après dénommée couche granulaire 9-12). Source de courant de densité est utile car il fournit un indice de l'emplacement, l'orientation et la densité du flux transmembranaire actuelle, nous permettant de positionner précisément les électrodes pour enregistrer à partir de toutes les couches dans une seule pénétration de 6, 11, 12.
1. NAN microdrive de construction
Nous utilisons les U-Probe en combinaison avec le système d'entraînement NAN électrode. La construction de ce système nécessite 2-3 heures, mais une fois construit, il est très simple à modifier. Nous commençons par l'assemblage de la tour NAN, qui comprend une base de 4 canaux (figure 2a), la chambre de NAN (figure 2b), la grille avec une distance mm (figure 2c), 1-4 microdrives vis (figure 2d), une -4 tubes de guidage (figure 2e, 500 pm de diamètre et coupé à environ 5-7 cm), et 1-4 tours Microdrive (figure 2f). Pour plus de simplicité, nous allons décrire la procédure à suivre pour la construction du système NAN avec une tour et un U-Probe. Après une formation, cette procédure prend généralement 2-3 heures si tous les matériaux sont disponibles.
2. U-Probe de stérilisation
L'électrode laminaire ou Plextrode U-Probe est acheté à Plexon Inc et est disponible à un prix d'environ $ 2000 - $ 4000. Le prix dépend de trois aspects principaux: le nombre de sites de contact, la configuration des sites, et le diamètre de chaque site. Nous utilisons actuellement la version 16 canaux avec une configuration linéaire et d'un diamètre de contact de 25 um. Fait important, l'épaisseur de l'U-Probe est directement liée au diamètre de contact. Dans nos expériences, nous avons toujours utilisé les contacts de diamètre 25 um, qui est égale à un micron d'épaisseur 360. Le coût actuel pour notre modèle de la version est d'environ $ 3500 dollars. Le U-Probe est emballé dans un étui d'électrodes avec des cavaliers et de fil de terre et les délais d'achat à la livraison est d'environ 4-6 semaines.
3. Vers l'U-Probe pour l'enregistrement
Étant donné que la force et l'épaisseur de durée est très variable entre les sujets, nous avons mis en place une procédure générale pour faire avancer le U-Prosoit en utilisant le système NAN microdrive. Surtout, chaque U-Probe est livré avec une analyse détaillée de l'impédance de chaque contact et le garde général de l'U-Probe. Nous avons utilisé des électrodes dont les contacts impédances allant 0,3 à 0,5 MQ. Actuellement, il ya un testeur d'impédance disponibles à l'achat d'Plexon mais malheureusement, au moment de nos enregistrements ce dispositif n'était pas disponible. En conséquence, nous avons été incapables d'effectuer une analyse détaillée de l'impédance.
4. Identification et vérification des couches corticales
Nous avons mis en place une procédure pour identifier les couches corticales à l'aide d'un potentiel réponse évoquée (ERP) de paradigme et source de courant de densité (CDD) d'analyse. Nous nous sommes appuyés sur les CDD, car elle fournit un indice de l'emplacement, l'orientation et la densité du flux transmembranaire actuelle, nous permettant de positionner précisément les électrodes pour enregistrer à partir de toutes les couches d'une pénétration unique. En effet, Charles Schroeder et ses collègues ont déjà combinée d'enregistrement laminaire, microlesion, et la reconstruction histologique de valider l'efficacité de la méthode ERP / CDD dans l'identification fonctionnelle de couches corticales en V1 9-12. D'autres méthodes utilisant les oscillations générées spontanément ont été utilisées pour identifier la profondeur corticale corticales telles que les broches et haut / bas états 13-15.
Pour cette analyse, nous utilisons la boîte à outils pour MATLAB ICSD, qui calcule la CDD en fonction de la dérivée deuxième spatiale de la LFP de séries chronologiques sur les contacts équidistants de l'U-Probe ( http://software.incf.org/ logiciel / csdplotter / home ) 9,10,16,17.
5. Identification des neurones individuels et la cartographie de terrain réceptif
Nous avons eu beaucoup de succès avec l'isolement et l'enregistrement de plusieurs unités simples de l'U-Probe. Sur un enregistrement en général, on peut s'attendre à avoir 60 à 10 unités bien isolées et 14-16 locales signaux potentiels sur le terrain. Pour trouver des unités simples est aussi plus fiable avec le U-Probe comparativement aux électrodes unique. Même si l'on devait utiliser tout le matériel nécessaire à l'avance précisément 16 électrodes, ils ne seraient pas en mesure d'explorer les populations réseau en fonction des couches corticales plus précisément avec le U-Probe. Enfin, nous avons généralement pouvez enregistrer avec le même U-Probe pour les pénétrations 30-40.
6. Les résultats représentatifs: Enregistrements des unités uniques et LFPs travers les couches corticales du cortex visuel primaire
Une des étapes les plus importantes dans l'analyse en utilisant des électrodes laminaires est d'identifier de manière fiable les couches corticales et de vérifier cette identification à travers de nombreuses heures et les séances. Ainsi, nous avons mesuré les potentiels réponse évoquée (ERP) de LFPs travers des contacts laminaire en réponse à un stimulus plein champ flashé (figure 3a). Figure 3b donne un exemple du type d'information que l'on doit obtenir afin de calculer la densité de courant-source (CDD) pour identifier les couches corticales. Nous avons ensuite utilisé l'analyse de la LFP CDD séries chronologiques afin d'identifier l'inversion de polarité accompagnés par la configuration du puits-source à la base de la couche 4. La figure 4a illustre l'analyse CDD en localisant les couches corticales travers la profondeur corticale en fonction du temps - la position de supragranular (SG), granulés (G) et infragranular (IG) est resté stable, même les couches quatre heures après la session d'enregistrement a commencé. Figure 4b contient des traces CDD, qui représentent la moyenne de ces contacts attribué à une couche donnée - dans cet exemple, la couche granulaire subit une nette diminution des CDD amplitude à ~ 50 ms. Cette analyse a servi de référence pour attribuer les contacts des électrodes au-dessus et en dessous de la couche granulaire aux couches supragranular et infragranular, respectivement (le contact avec le plus grand puits de centre de masse a servi de référence à la couche granulaire 0 m).
Une autre analyse critique en utilisant l'électrode laminaire est d'identifier et de localiser précisément le champ des neurones réceptifs. Cette procédure est indispensable pour le positionnement de la relance pour générer la réponse la plus robuste des neurones. La figure 5a est un exemple de deux parcelles de terrain réceptif des neurones dans visuel primaire Cortex (V1). L'origine de ces parcelles est le point de fixation, qui est un petit cercle blanc apparaît au centre sur un écran d'ordinateur noir. La couleur de ces parcelles représente la cadence de tir de chaque neurone en réponse à un stimulus corrélation inverse dynamique. Nous utilisons cette information à la position du stimulus pour une expérience donnée (par exemple une onde sinusoïdale caillebotis). Stimuli qui sont présentés sont plus grandes que la taille moyenne des champs récepteurs afin d'englober endroits champ récepteur de tous les neurones enregistrés simultanément.
Après nous identifions les couches corticales et de la position du stimulus dans l'emplacement du champ réceptif optimale, nous pouvons procéder au protocole expérimental dans lequel nous présentons divers stimuli visuels tandis que l'animal exécute des tâches soit la fixation ou la discrimination. Après l'expérience, nous effectuons nos pointes de forme d'onde d'analyse afin d'isoler les unités mono-, nous avons pu enregistrer la même chaîne. Cette procédure prend souvent un certain temps à maîtriser et est constamment amélioré en tant que logiciel d'analyse et de nouvelles techniques sont mises à disposition. La figure 5b est un exemple du type de la sortie on pouvait s'y attendre après l'utilisation de trieuse Hors Plexon. L'utilisation de ce logiciel, les appareils d'isolation unique est effectué par une inspection visuelle. Groupes distincts sont identifiés sur la base du poids de la première et deuxième composantes principales, la largeur pic, vallée, et les propriétés de pointe.
Figure 1. Électrodes laminaires multi-contact en utilisant des électrodes laminaires multi-contact, nous avons enregistré simultanément l'activité de dopage à partir isolés neurones individuels et d'unités LFP travers les couches corticales de V1. Chaque U-Probe se compose de 16 contacts des électrodes équidistantes (100 um) couvrant une longueur totale de 1,6 mm. Chaque contact des électrodes est de 25 m de diamètre et est composé de platine iridié.
Figure 2. NAN NAN La construction de la grille microdrive système offre plus de stabilité et de précision sur le classique à vis axée microdrive. Chaque groupe d'électrodes est indépendante manipulée dans les plans XY, au sein d'un utilisateur défini la plage de travail. Chaque groupe d'électrodes est manipulé de façon indépendante dans la direction Z dans une profondeur de travail définis par l'utilisateur (jusqu'à 100 mm) et la gamme de vitesse variable à partir 0.001mm / s à 0,5 mm / sec et une résolution élevée de 1 micromètre (un) 4. - canal de base, (b) de la chambre de NAN, (c) la grille avec une distance mm, (d) 1-4 microdrives vis, (e) 1-4 tubes de guidage (500 um de diamètre et coupé à environ 5-7 cm) , (f) 1-4 tours microdrive et (g) le système complété NAN et de la base du cylindre.
Figure 3. Evoqués paradigme de la réponse potentielle et des séries chronologiques LFP (a) Pour identifier les couches corticales, nous avons mesuré le potentiel de réponse évoquée (ERP) au cours d'une tâche fixation passive alors que les singes ont été exposés à un écran plein champ noir que blanc flashé (~ 1 Hz) à 100 ms, et est ensuite retourné au noir. (b) Les réponses LFP enregistré avec le laminaire U-Probe ont été traitées pour obtenir des traces d'ERP pour chaque contact. La couche granulaire a été déterminée dans toutes les sessions en localisant une inversion de couler axée dans l'amplitude de la réponse dans les traces d'ERP, et par la présence de l'inversion de polarité accompagnés par la configuration du puits-source à la base de la couche 4. La boîte pointillée indique le calendrier de la période de temps où l'inversion s'est produite.
Figure 4. Identification couche en utilisant une analyse de densité de courant-source (a) analyse la densité de courant-source (basé sur la dérivée 2 ème spatiale de la LFP séries chronologiques) a été utilisé pour identifier l'inversion de polarité accompagnés par la configuration du puits-source à la base de l' couche granuleuse. Nous avons évalué la stabilité de l'identification des couches corticales est maintenue au fil du temps (de gauche à droite). Dans ces exemples, le puits de courant (bleu) représente la couche granulaire et s'étend sur environ 400 um. (B) Les traces CDD-dessous de chaque parcelle représente la moyenne de ces contacts CDD assignés à une couche donnée. Cela nous a permis de déterminer le moment précis de l'évier initiale (dans ces exemples ~ 50-60 ms. CDD enveloppes traces représentent l'écart-type et des barres noires indiquent la durée du stimulus flashé (100 ms).
Figure 5. Le tri Spike et cartographie sur le terrain réceptif (a) Tout d'abord, un demi-degré visuelle est calculée et doublé. Ensuite, les stimuli corrélation inverse sont présentés dans les correctifs sur un moniteur CRT consisting de réseaux orientés à des degrés 0, 45, 90 et 135. Taux de tir pour chaque neurone sont calculés de façon indépendante à intervalles de 5 ms entre 40 à 120 ms après les stimuli sont présentés pour chaque emplacement spatial. Le taux maximum de tirs sont calculés et ensuite le centre de gravité pour chaque temps de retard. Puis, à chaque retard de la distance entre les emplacements adjacents centroïde et cadence de tir est calculée. Le temps de retard avec la distance minimale est choisie comme champ récepteur. (B) de Spike propriétés d'onde telles que la hauteur maximale, la profondeur de la vallée, le pic en temps vallée, le temps de pic ou de la vallée, etc sont analysés à l'aide d'un programme de tri déconnecté du logiciel ( Plexon). Spikes sont triés en fonction des propriétés similaires jusqu'à des formes d'onde d'un neurone sont regroupés sans chevauchement d'un autre.
Figure 6. Shuffled CDD profil. Même convention que dans la figure 3a, mais nous avons réalisé une procédure de brassage qui compile au hasard d'une nouvelle matrice de la CDD avec les emplacements de contact mixte. Cette analyse est utilisée pour mieux valider l'évier granulaires en mélangeant les positions d'électrode de quitter le domaine temporel inchangé. A partir de ces exemples affiché au cours du temps, mélanger les contacts des électrodes en fonction de la profondeur du cortex détruit toute spécificité laminaire.
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Multi-unit enregistrements sont devenus la norme pour analyser comment les réseaux neuronaux dans le cortex coder les informations de relance. Etant donné les récents progrès dans la technologie d'électrodes, la mise en oeuvre d'électrodes laminaire permet une caractérisation locale sans précédent de circuits corticaux. Bien que multi-électrodes enregistrements offrent des informations utiles sur la dynamique des populations de neurones, électrodes laminaire multiples permettent une plus grande résol...
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Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Nous remercions Ye Wang pour des discussions et Sorin Pojoga de formation comportementale. Soutenu par le programme EUREKA NIH, National Eye Institute, le Programme de Pew Scholars, la James S. McDonnell (VD), et une subvention de formation Vision NIH (BJH).
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom de l'équipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
Nan microdrive système de | Nan Instruments | NAN-S4 | Figure 2. Colliers personnalisés sont nécessaires pour utiliser le U-Probe. Tout mentionnée à l'exception de l'U-Probe est fourni par les instruments NAN. |
Vis microdrives | Atelier d'usinage du MIT | Tout ce qui est en mesure d'obtenir un tube guide à la grille NAN doivent être appropriées. | |
Tubes en acier inoxydable Guide | Petites pièces | B00137QHNS (1) ou B00137QHO2 (5) | Ce sont 60 en long et coupé à la taille dans le laboratoire en utilisant une perceuse à main Dremel |
Plexon U-Probe | Plexon, Inc | PLX-UP-16-25ED-100-SE-360-25T-500 | See U-Probe spécifications disponibles au www.plexon.com voir aussi la figure 1. |
Tableau 1. Matériel.
Nom du logiciel | Société | Site Web | Commentaires |
NAN logiciels | NAN | http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm | Interface informatique nécessite un port série supplémentaire pour adapter les systèmes et le matériel Plexon NAN |
Trieuse Hors, FPAlign, PlexUtil, MATLAB programmes | Plexon | http://www.plexon.com/downloads.html # Software | Sous 'packages d'installation » |
NeuroExplorer | NeuroExplorer | http://www.neuroexplorer.com/ | Sous «Ressources» |
Version 0.1.1 CSDplotter | Klas H. Petterson | http://arken.umb.no/ ~ klaspe / user_guide.pdf |
Tableau 2. Software.
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