Détection de l'aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

Résumé

Un rapide et précise au point de soins de test pour l'aspergillose pulmonaire invasive est présentée. Il tire parti de la technologie de flux latéral en utilisant un anticorps monoclonal spécifique qui se lie à un Aspergillus sécrétée au cours des infections pulmonaires. Le dosage est compatible avec le sérum et le lavage brochoalveolar et représente un test complémentaire de roman pour le diagnostic des maladies.

Résumé

Aspergillose pulmonaire invasive (API) est une des principales causes de morbidité et de mortalité chez les patients une hémopathie maligne et hématopoïétiques bénéficiaires greffe de cellules souches ^1. Détection de l'IPA représente un formidable défi de diagnostic et, en l'absence d'un «gold standard», repose sur une combinaison des données cliniques et microbiologiques et l'histopathologie lorsque cela est possible. Diagnostic de l'IPA doit être conforme à l'Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer et l'Institut national des allergies et maladies infectieuses Groupe d'étude mycologie (EORTC / MSG) définissant un consensus "prouvées", "probable", et "possible" maladies fongiques invasives ² . Actuellement, aucune base d'acides nucléiques tests ont été validés à l'externe pour la détection IPA et ainsi la réaction en chaîne par polymérase (PCR) n'est pas inclus dans les critères diagnostiques actuels EORTC / MSG.

Identification d'Aspergillus dans les coupes histologiques est problématique en raison de Similarités des morphologies des hyphes avec d'autres agents pathogènes fongiques invasives ^3, et l'identification éprouvée exige l'isolement de l'agent étiologique en culture pure. Culture des approches fondées sur compter sur la disponibilité d'échantillons de biopsie, mais ceux-ci ne sont pas toujours accessibles chez les patients malades, et ne donnent pas toujours des propagules viables pour la culture lorsqu'elle est obtenue.

Une caractéristique importante dans la pathogenèse d'Aspergillus est angio-invasion, un trait qui offre des possibilités pour suivre le champignon immunologiquement en utilisant des tests qui détectent caractéristiques antigéniques des molécules signatures dans le sérum et broncho-alvéolaire (LBA) des fluides. Cela a conduit à l'élaboration de la immuno-enzymatique Platelia (GM-EIA) qui détecte Aspergillus galactomannane et un «pan-fongique" test (test Fungitell) qui détecte la composante conservée paroi cellulaire des champignons (1 → 3)-β-D- glucane, mais pas dans les mucorales qui n'ont pas cette composante dans leurs parois cellulaires ^1,4. Estpoursuit autour de l'exactitude de ces tests de ^1,4-6 a conduit à la mise au point récente de la prochaine génération d'anticorps monoclonaux (AcM) basés sur des tests qui détectent des marqueurs de substitution de l'infection ^1,5.

Thornton ⁵ a récemment décrit la génération d'un anticorps monoclonal spécifique d'Aspergillus (JF5) en utilisant la technologie des hybridomes et son utilisation pour développer une immuno-chromatographie en phase latérale débit périphérique (LFD) pour le point-of-care (POC) le diagnostic de l'IAP. Un avantage majeur de la LFD est sa capacité à détecter les activités du MAB depuis JF5 se lie à un antigène de glycoprotéine extracellulaire qui est sécrétée pendant la croissance active du champignon seulement ^5. C'est une considération importante lors de l'utilisation des fluides tels que BAL du poumon pour le diagnostic de l'IPA depuis spores d'Aspergillus sont une composante commune de l'air inhalé. L'utilité de l'appareil dans le diagnostic de l'IAP a été démontrée en utilisant un modèle animal d'infection, où le LFD affiché une sensibilité accrue et spécificationsificity par rapport à la GM Platelia et Fungitell (1 → 3)-β-D-glucane essais ^7.

Ici, nous présentons une procédure simple LFD pour détecter l'antigène Aspergillus dans le sérum et les fluides humains BAL. Sa vitesse et sa précision fournit un complément roman au point de soins de test pour le diagnostic de l'IPA chez les patients une hémopathie maligne.

Protocole

1. Collecte, stockage et préparation de sérum et les fluides de lavage broncho-

1. Recueillir le sérum à partir d'échantillons sanguins non traités en permettant la coagulation du sang à 4 ° C, et le sérum magasin comme aliquots à -20 ° C avant de les utiliser. Broncho-alvéolaire (LBA fluides) devrait également être stockées sous forme de fractions aliquotes à -20 ° C. Remarque: stockage de sérum et de BAL comme aliquotes limite le potentiel de dégradation de l'antigène cible par la répétition de congélation-décongélation des échantillons au cours des tests répétés.
2. Faire dégeler les échantillons et mélanger les échantillons de sérum et de BAL soigneusement au vortex et centrifuger pendant 1 min à 14000 rpm.
3. Pour les tests de routine des échantillons de sérum humain, diluer le sérum 01:01 (v / v) avec un milieu de culture de tissus (TCM). TCM est constitué de milieu RPMI-1640, 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 1% (v / v) de la L-glutamine 200 mM solution, et de l'azoture de sodium 0,02% (m / v) en tant que conservateur. Le milieu est préparé à l'avance et peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs mois. Appliquer 100 pi de la DILUTed sérum à la LFD.
4. Pour l'homme liquides de LBA, et pour les fluides BAL de modèles animaux, appliquer 100 pi d'échantillon propre à l'écoute des nouvelles orientations, sans pré-traitement.
5. Pour le sérum à partir de modèles animaux, diluer le sérum 1:2 (v / v) avec un tampon phosphate salin contenant 4% (p / v) d'EDTA, de la chaleur pour 3min dans un bain d'eau bouillante, centrifugeuse pendant 5 min à 14000 rpm, et appliquer 100 ul de surnageant soignée à l'appareil LFD.

2. Application de sérum et de BAL sur le périphérique latérale-débit

1. Stocker les dispositifs latéraux d'écoulement à la température ambiante (23 ° C). A cette température, les appareils sont stables pendant 12 mois. Supprimez les périphériques de leurs poches et les placer sur une surface plane.
2. Utilisation d'un embout de pipette stérile, appliquer 100 pl de pré-traitée échantillon de sérum ou de BAL pur à l'orifice de libération du dispositif.
3. Permettre à l'essai pour une durée de 15 min à température ambiante, au moment où les résultats des tests doivent être consignés. Remarque: En quelques secondes, le liquide sera soifr à migrer par capillarité le long de la membrane de nitrocellulose dans la fenêtre d'observation.

3. Enregistrement et interprétation des résultats LFD

1. Le LFD consiste d'une ligne de commande interne (indiquée par la lettre C sur le boîtier en matière plastique) et une ligne de test (indiquée par la lettre T). La ligne de commande doit toujours apparaître, indépendamment de l'antigène Aspergillus dans l'échantillon de sérum ou de BAL. Cela montre que le test a fonctionner correctement.
2. Si l'antigène Aspergillus est présent dans l'échantillon de sérum ou de BAL, la ligne de test apparaît également dans 15min d'application d'échantillon. Parce que l'intensité de la ligne de test est proportionnelle à la quantité d'antigène présente dans l'échantillon d'Aspergillus, la ligne de test peut apparaître en tant que faiblement positif (+), une moyenne positif (+ +) ou comme une forte positif (+ + +) . Toutefois, aucune ligne de test positif, quel que soit l'intensité, d'indiquer la présence de l'antigène Aspergillus dans l'échantillon. En el'absence de l'antigène e Aspergillus, aucune ligne de test s'affiche, et le résultat est enregistré comme négatif (-).

4. Les résultats représentatifs

Des exemples représentatifs de négatifs, faiblement positif, positif modéré, et fort des résultats positifs avec des échantillons LFD BAL et le sérum sont présentés dans la figure 1.

Résultats de l'antigène de tests positifs pour RAJ (faible et forte) ou négatifs des tests utilisant des fluides LFD BAL de leucémie myéloïde aiguë (LMA) patients diagnostiqués selon l'EORTC / MSG critères diagnostiques sont indiqués dans le tableau 1. Inclus dans ce tableau sont les correspondants clinique et mycologique (galactomannane et de la culture) de données, et les résultats d'un test de PCR spécifique d'Aspergillus mis au point à Saint-Barthélémy Hôpital ^8, pour chaque patient. Le diagnostic de la maladie a été fondée sur des facteurs d'accueil (neutropénie, l'utilisation prolongée de corticostéroïdes, le traitement avec d'autres reconnus des cellules T immunosuppressants), les critères cliniques et de positivité pour GM BAL (définie ici comme une valeur d'indice GM> 0,8). Sous les 2002 EORTC / MSG lignes directrices ^10, 12 patients, 13 et 16 ont été diagnostiqués avec «possible» IA sur la base de facteurs de l'hôte et les critères cliniques ou de positivité GM. Selon la version révisée (2008) EORTC / MSG directives ^2, facteurs de l'hôte et la positivité GM seuls ou facteurs de l'hôte et les critères cliniques ne suffiraient pas à indiquer «possible» infection fongique invasive moins d'être accompagné par les pièces justificatives à partir de données cliniques et mycologiques, respectivement. Patient 6 a été diagnostiqué avec «probable» IA dans les deux 2002 et 2008 des lignes directrices en raison de facteurs de l'hôte, majeurs et mineurs des caractéristiques cliniques et la positivité GM. Notez que tandis que ni la LFD, ni PCR sont actuellement inclus dans les lignes directrices EORTC / MSG, il ya une grande concordance entre les deux tests et le test commercial galactomannane indiquant la présence de l'antigène Aspergillus et de l'acide nucléique dans l'échantillon BAL s de patients 6 et 12. D'autres résultats d'essais démontrant l'efficacité des tests LFD et PCR dans le diagnostic IPA peuvent être trouvés dans Johnson et al ^8.

Figure 1. Négatif (ligne de commande uniquement) et positif (contrôle et test en ligne) les résultats des tests de LFD utilisant du sérum et BAL. Les intensités des réactions de ligne de test sont proportionnelles à la concentration de l'antigène cible dans les échantillons de sérum et BAL. Réactions varient généralement de faible (+) par le biais modérée (+ +) à forte (+ + +). Indépendamment de l'intensité de ligne de test, tous trois sérum réaction positive indique invasif maladie pulmonaire aspergillose due à la présence d'antigènes circulants dans le sang d'Aspergillus. Des réactions positives BAL (faible, modérée ou forte) indiquerait la germination des spores et le développement des hyphes potentiellement pathogène dans les poumons.

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Aucun patient.	Patient l'information	Les critères cliniques 1	La culture BAL 2	GM EIE indice 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR résultat	Résultat LFD
6	-	Principaux signes TDM (nodule et halo) et une mineure	Négatif	0,9 (positif)	Probable	Probable	Positif	Faiblement positif (+)
12	Présumé infection fongique précédente	Aucune modification importante, un mineur	Candida glabrata	6,43 (très positif)	Possible	Aucun	Positif	Fortement positive (+ + +)
13	Staph à coagulase négativeylococcus et E. coli dans le sang	Aucune modification importante, deux mineures	Négatif	0,25 (négative)	Possible	Aucun	Négatif	Négatif (-)
16	Infection à la poitrine	3 critères mineurs, y compris épanchement pluriel nouvel infiltrat en plus	Négatif	0,16 (négative)	Possible	Aucun	Négatif	Négatif (-)

¹ nodules ou des halos sur une tomodensitométrie est évocatrice d'une infection fongique
² Candida glabrata dans le liquide BAL serait considérée comme un contaminant, en est la levure deuxième plus fréquemment isolé dans le cadre de la flore normale de l'homme ^9
3 Un indice de> 0,8 dans le test de GM EIE du BAL est révélatrice de l'infection Aspergillus
⁴ Basé sur les 2002 EORTC / MSG critères diagnostiques pour 'possible »,« probable »ou« prouvée »la maladie fongique invasive ^10
5 Basé sur la version révisée (2008) EORTC / MSG critères diagnostiques de la «possible», «probable» ou «prouvée» la maladie fongique invasive ²

Tableau 1. Les résultats des tests d'échantillons LFD BAL de la leucémie myéloïde aiguë avec IPA probable et de patients atteints de LAM de contrôle (aucun signe d'infection) et l'EORTC / MSG diagnostic de l'infection.

Discussion

L'identification définitive de l'IPA ne peut vraiment être atteint par l'isolement de l'agent étiologique à partir d'échantillons de biopsie, mais la récupération des échantillons appropriés n'est souvent pas possible chez les patients très malades et Aspergillus est rarement récupérable à partir du sang. Si des progrès considérables ont été accomplis dans l'utilisation de la tomodensitométrie à balayage de la poitrine dans le diagnostic IPA, caractéristiques qui sont suggestifs de l'IPA pulmonaires chroniques telles que le "halo" ou "air-Croissant-Rouge" signes sont soit transitoire ou peut être attribué à des artefacts respiratoires ou d'autres infections fongiques ^11,12. Ces données sont donc complétées par des techniques sérologiques visant à identifier des molécules de signature (GM et β-glucane) à partir de champignons qui circulent dans le sérum du patient ou qui sont présents dans les fluides, les expectorations ou BAL échantillons d'urine ^13. Bien que ces essais montrent une sensibilité satisfaisante, ils manquent de spécificité suffisante ou qui souffrent d'interférences, sous certaines conditions ^1,6 .

Le test LFD pour la détection IPA présentée ici permet de diagnostiquer le «point-of-care» de la technologie IAP et les exploits qui a été utilisé à ce jour dans les tests pour la détection de virus, bactéries, parasites et toxines ^14-19 et, le plus célèbre, pour la grossesse à la maison teste la première fois par Unipath en 1988. Dans le LFD Aspergillus décrit ici, le Aspergillus AcM spécifique JF5 est immobilisé sur une zone de capture (la ligne de test) sur une membrane de nitrocellulose poreuse. Immunoglobuline anti-souris immobilisé sur la membrane dans une zone séparée servi comme témoin interne (conduite de commande). Le addition de sérum ou le liquide BAL à l'orifice de relâchement, conjugué anticorps monoclonal or JF5-colloïdale dans le tampon de libération se lie à l'antigène cible et le complexe passe ensuite le long de la membrane poreuse par action capillaire. AcM JF5 immobilisé dans la zone de capture se lie à l'JF5-or colloïdal-antigène complexe résultant en une ligne de mesure rouge. Toute non liée JF5-or colloïdalconjugué se lie aux procédures de contrôle interne qui indique que le test a fonctionner correctement. Il en résulte une ligne de contrôle rouge.

Le test est rapide, ne prenant que 15 minutes pour effectuer, n'est pas cher par rapport à des tests sériques et BAL sur la base de GM et β-glucane de détection, et ne nécessite pas de matériel coûteux ou des installations de laboratoire approfondies à courir. En outre, MAb JF5 ne pas de réaction croisée avec les médicaments ou les contaminants qui ont été montrés pour causer de faux-positifs de réaction dans le MM et le β-glucane essais ^1,4,6. Un avantage supplémentaire majeur par rapport aux tests de diagnostic actuels, c'est la capacité SMMO pour détecter l'activité qui est indicative de la croissance invasive des espèces d'Aspergillus.

Une étape cruciale dans la procédure LFD est la nécessité de lire les résultats 15 minutes après l'application de l'échantillon de sérum ou de BAL à l'appareil. Le test ne doit pas être laissé pour plus de 15 minutes avant d'enregistrer les résultats, car cela pourrait entraîner biais interpretatile. Une faible réaction ne sera pas renforcée par l'extension de la période d'incubation. Le traitement thermique de sérum à partir de modèles animaux d'infection n'a été trouvé pour améliorer la sensibilité du test. Une limitation de l'essai, c'est qu'il est de nature qualitative, et s'appuie sur l'opérateur de procéder à une évaluation subjective de la positivité. L'intensité de la ligne d'essai varie selon les teneurs en antigènes d'échantillons de sérum et BAL (Figure 1). Cependant, une réaction positive (déterminée par comparaison aux négatifs connus) indique la présence de l'antigène d'Aspergillus et donc l'infection. Pour limiter la subjectivité des tests de LFD, les appareils portatifs sont disponibles qui permettent la quantification des intensités des raies LFD de test et de permettre à l'établissement de valeurs seuils pour ²⁰ détection de l'antigène.

Les développements futurs de la LFD comprennent sa commercialisation et le développement d'un LFD multiplex qui permet la détection simultanée de pathogènes fongiques invasives autresen utilisant anticorps monoclonaux très spécifiques ^3.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aspergillus LFD	Université d'Exeter		Disponible auprès de l'auteur correspondant à la demande
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-glutamine	Sigma	G7513
Sérum de veau foetal	Biosera	S9100	Autres sources de sérum de veau foetal peut être utilisé dans la préparation de la MTC
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1