Synthèse d&#39;un<em&gt; In vivo</em&gt; Sonde apoptose détectable par IRM

Résumé

La détection précoce de l'apoptose peut identifier les populations cellulaires à risque dans une variété de maladies. Nous démontrons ici une méthode pour lier un début d'apoptose détection de la protéine (annexine V) à une nanoparticule IRM détectables d'oxyde de fer (SPIO). Cette méthode peut être étendue à d'autres protéines d'intérêt pour générer IRM détectables traceurs d'imagerie moléculaire.

Résumé

L'apoptose cellulaire est une caractéristique importante de nombreuses maladies, et cette mort cellulaire programmée se produit généralement avant les manifestations cliniques de la maladie sont évidents. Un moyen pour détecter l'apoptose dans les premiers stades, les réversibles ses offrirait une pré-clinique «fenêtre» pendant laquelle des mesures préventives ou thérapeutiques pourraient être prises pour protéger le coeur contre des dommages permanents. Nous présentons ici une méthode simple et robuste de conjuguer l'annexine V humaine (ANX), qui se lie avidement à des cellules dans les plus anciennes, les étapes réversibles de l'apoptose, à superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIO) nanoparticules, qui servent comme un agent de contraste IRM détectables. Procédé de conjugaison commence par une oxydation des nanoparticules SPIO, qui oxyde des groupes carboxyle sur la coque de polysaccharide SPIO. Protéine purifiée ANX est ensuite ajouté dans le cadre d'une solution de borate de sodium pour faciliter l'interaction covalente avec des ANX SPIO dans un tampon de réduction. Une étape de réduction finale avec borohydrid de sodiume est effectuée pour achever la réduction, puis la réaction est arrêtée. ANX non conjugué est éliminé du mélange par filtration microcentrifugation. La taille et la pureté du produit ANX-SPIO est vérifiée par la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Cette méthode ne nécessite pas l'ajout ou une modification de la, le polysaccharide SPIO shell, contrairement à réticulés fer méthodes particules d'oxyde de conjugaison ou marqué à la biotine nanoparticules. En conséquence, cette méthode représente une approche simple et robuste qui peut être prolongé à la conjugaison d'autres protéines d'intérêt.

Protocole

Adapté de l'étude préalable ^1.

1. Conjugaison de l'annexine V à SPIO

1. Oxyder particules SPIO (Océan Nanotech Inc, 5 mg / ml) pendant 1 heure à 20 ° C dans l'obscurité dans une solution de sodium à 0,15 M periodate (NaIO ₄₎ (4:1 rapport poids: poids) ^2.
2. Incuber la SPIO oxydé pendant 12 heures avec la protéine purifiée ANX (ratio 1:1, poids: poids) dans 0,15 M de borate de sodium (Na ₂ B ₄ O ₇ 10H ₂ O) à 20 ° C.
3. Réduire le mélange en outre pendant 1 h avec du borohydrure de sodium (NaBH ⁴⁾ sous la hotte, puis éta....

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Discussion

Le procédé de conjugaison décrit pour relier SPIO à l'annexine V exploite les groupes latéraux de chaîne amine de l'annexine et les groupements carboxyle de la nanoparticule SPIO. Grâce spécifiques d'oxydo-réduction étapes, la liaison covalente de ces composés peut être réalisée, et la nanoparticule fonctionnalisée obtenue peut être isolé. Cette méthode peut être généralisée à d'autres protéines et des nanoparticules d'intérêt.

Les étapes les pl.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif	Entreprise	Catalogue #
L'oxyde de fer superparamagnétique	Ocean Nanotech, Inc	ICK-40-005
Doxorubicine	Sigma	D1515-10MG
Supermag Separator	Ocean Nanotech, Inc	N / A
Zetasizer Nano DLS machine à	Malvern, Inc	N / A