Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Résumé

Fluorescent In situ (FISH) pour identifier des transcrits d'ARNm dans des cellules individuelles permet l'analyse de l'activité polygénique tel que la transcription simultanée de plus d'un membre de la Var dans Plasmodium falciparum Érythrocytes infectés ¹. La technique est adaptable et peut être utilisé sur différents types de gènes, des cellules et des organismes.

Résumé

L'adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l'homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l'expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var.

Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d'être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l'infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n'est pas claire, ainsi que l'identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l'ARN d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE ^1.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l'utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d'ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système ² (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d'hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d'autres espèces de parasites du paludisme et d'autres organismes et des types cellulaires.

Protocole

1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés

Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l'expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment ^1.

Jour 1

1. Récolte 200 ul de cellules sanguines emballés à partir d'un P. falciparum culture contenant 2-5% IE tardivement par centrifugation à 800 xg pendant 8 min à température ambiante.
2. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de sang de 37 ° C au chaud solution à 0,75% de gélatine dans un tube de 14 ml stérile et laisser reposer pendant 15-20 min à 37 ° C pour permettre l'IE non infectés et la bague au stade de sédiments.
3. Récolter les IE au stade avancé, c'est à dire la phase supérieure, dans un nouveau tube 14 ml et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
4. Diluer 50 ul d'anticorps spécifiques anti-PfEMP1 anticorps dans 2 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias et filtre stérile.
5. Mélanger la chaux stade avancé IE avec l'antisérum dilué stérilisé dans un tube de 14 ml stérile et incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
6. Centrifuger à 800 xg pendant 8 min à température ambiante, et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
7. Lavez 50 pi de la protéine Dynabead Une suspension à deux reprises avec RBC-lavage médias utilisant une DynaMaq-15 aimant.
8. Remettre en suspension les Dynabeads dans 300 ul RBC-WASH pour les médias et les ajouter à la chaux stade avancé IE. Incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
9. Transférer le tube de l'aimant DynaMaq-15. Laissez-le pendant 1-2 min et éliminer tout le liquide.
10. Remettre en suspension les Dynabeads dans 4-5 ml de RBC de lavage médias. Transfert à l'arrière du tube sur l'aimant et le laisser pendant 1-2 min avant de retirer tout le liquide. Répéter l'étape de lavage une fois.
11. Transférer les billes lavées à un 25 cm ² f de culture stérilelask contenant 200 ul fraîchement concentré de globules rouges. Ajouter 5-6 ml de Albumax médias dans la culture. Stockez nuit à 5% de CO ₂ à 37 ° C.

Jour 2

12. Supprimer les Dynabeads de la culture lorsque la ré-envahi IE a sélectionné les cellules rouges du sang frais, en transférant toute la culture dans un tube de 14 ml stérile. Placer le tube sur le DynaMaq-15 aimant et laisser reposer pendant 1-2 min. Ensuite, versez tout le retour du liquide dans un flacon de culture.
13. La culture pour que les cycles possible jusqu'à une parasitémie de 5-10% et les parasites sont à l'ringstage.
14. IE doivent être analysés par FACS pour s'assurer que le phénotype de surface correcte, à savoir l'expression des protéines soit and/orPF11_0008 PFD1235w a été obtenue ^1.

2. Préparation des sondes

Les sondes antisens d'ARN ont été générés à partir des régions les plus variables du PFD1235w et le var PF11_0008 </ Em> des gènes de P. l'ADN génomique falciparum 3D7. L'ADN a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur pSPT18 ou 19 pour la transcription, respectivement selon la description du fabricant (Roche). Les sondes (580 paires de bases (pb) et 590 pb de longueur) ont été marqués par la digoxigénine (DIG) ou biotine en utilisant un kit de marquage DIG ARN ou une biotine ARN étiquetage Mix, respectivement. Nous avons confirmé la spécificité des sondes à la fois par des analyses par Northern blot et par une seule partie analyse FISH ^1.

3. Frottis mince et fixation des parasites Avant hybridation in situ

Jour 1

Toutes les étapes sont réalisées dans un environnement exempt de RNase et tous les réactifs sont sans RNase ou pré-traitées avec diéthyl pyrocarbonate (DEPC) ou RNase Zap (Invitrogen). Les diapositives et les lamelles couvre-objets doivent être nettoyés avec de l'alcool pour enlever la graisse de résidu de fabrication. Il est important d'effectuer le protocole sans aucune pause entre les étapesafin de minimiser le risque de contamination nucléase.

1. Faire un frottis sanguin par la méthode standard propagation ^3. Utilisation de la lentille de l'objectif 100x du microscope, compter l'IE et de calculer le pourcentage d'IE dans la culture. Vérifiez que les stades parasitaires sont en synchronie approximative, dans l'anneau et les premiers stades trophozoïtes du cycle de IE. Il s'agit de la pré-réplication, uni-nucléés étapes, exprimant l'ARNm du gène var et adapté à des dosages de cellules simples de transcription POISSONS de ce type.
2. Transférer 50 ul de la culture du parasite, à une parasitémie de 5-10%, 1,5 ml d'une RNase-free tube Eppendorf. Centrifuger pendant 1 min à 2.000 tours par minute à température ambiante.
3. Retirez le support et ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 en eau traitée au DEPC. Agiter doucement le tube. Répétez l'étape sédimentation centrifuge à deux reprises pour laver les cellules libres de médias et les débris cellulaires.
4. Faites quatre frottis minces de bonne qualité. Pour chaque frottis, faire un frottis surun 11 mm de diamètre et d'une diapositive 4 Les diapositives de verre soit quatre au total, dans une hotte sans RNase (une étape critique). Vague glisse brièvement en l'air pour sécher. Faire trois lames supplémentaires pour les contrôles négatifs tiroir-une sonde de marquage unique pour tout autre gène pertinent à l'aide d'une sonde spécifique, une autre lame pour le traitement RNase et un troisième chariot contenant IE n'exprimant pas le gène d'intérêt. Laisser les lames sécher sur le banc pendant 10-20 min.
5. Fixer les couches minces en ajoutant 60 pl de solution de fixation contenant du paraformaldéhyde à 4% et 5% d'acide acétique glacial dans le puits. Laisser reposer 10 minutes sur le banc à la température ambiante.
6. Laver les lames dans un tampon 2x SSPE pendant 5 minutes par agitation douce à température ambiante. Retirez brièvement l'excès de liquide en touchant les puits contenant les cellules délicatement avec un mouchoir en papier.
7. Couvrir les lames avec de la pepsine 0,01% à 0,01 M HCl pendant 2 min à 37 ° C (une étape extrêmement critique). Laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
8. Diluer la solution RNase à une concentration finale de 10 pg / ml. Recouvrir le frottis de contrôle négatif avec 60 ul de la solution de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C, puis laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
9. Procéder immédiatement à l'étape d'hybridation.

4. L'hybridation des sondes d'ARN aux diapositives fixes

Jour 1

1. Préparer la chambre d'hybridation, comme un ThermoStar 100 HC4 ou une boîte vide pipette pointe mis dans un four propre, par pulvérisation avec de la RNase Zap et essuyant le nettoyer avec un mouchoir en papier. Remplir les canaux de la chambre d'hybridation ou le fond de la boîte à eau traitée au DEPC à faire en sorte que les lames ne sèche pas pendant l'hybridation. Fermer la chambre et préchauffer à 48 ° C.
2. Diluer les sondes dans la solution d'hybridation à une concentration finale de 12 ng / pl. Dénaturer la solution de sonde à 65 ° C pendant 5 min dans un bloc de chauffage. Immédiatement refroidir sur glace.
3. En bref l'air sécher les lames après le lavage 2x SSPE. Retirez délicatement l'excès de liquide dans le puits avec un mouchoir en papier.
4. Ouvrez la chambre d'hybridation et placer les lames dans la chambre. Appliquer une ou deux sondes dans un volume total de 60 ul par puits. Couvrez soigneusement la goutte de liquide avec une lamelle RNase-free à l'aide des pinces stériles.
5. Fermer la chambre et l'hybridation des lames à 48 ° C pendant au moins 16 heures pendant la nuit.

5. Conjugaison d'anticorps et d'amplification de fluorescence

Jour 2

Les étapes suivantes sont basées sur le CST Plus System Palette de fluorescence de Perkin Elmer. Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante.

1. Laver les lames 3 fois dans du tampon TNT pendant 5 min sous agitation douce.
2. Bloquer le puits dans 150 ul de tampon TNB pendant 30 min.
3. Diluer le conjugué HRP-α-DIG anticorps dans un tampon TNB dans un rapport de 1:100 et le conjugué HRP-α-biotine dans du tampon TNB, selon un rapport de 1:500. Retirez tout excès de tampon TNB les lames avec un mouchoir en papier. Lors de la détection deux transcrits simultanément, les deux anticorps peut aller à la fois. Appliquer un montant total de 100 ul de la solution d'anticorps-TNB par puits et soigneusement couvrir avec une lamelle. Incuber les lames pendant 2 h.
4. Retirez les lamelles avec précaution. Laver les lames dans du tampon TNT 3 fois pendant 5 min.
5. Diluer le FITC-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un ratio de 1:500 et appliquer 100 ul de la solution dans chaque puits. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
6. Retirez le couvercle glisse avec précaution et laver les lames 3 fois pendant 5 minutes dans le tampon TNT par agitation douce.
7. Diluer le Cyan3-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un rapport de 1:500. Ajouter 100 ul paret de cette solution. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
8. Retirez le couvercle glisse soigneusement puis rincez rapidement les diapositives par immersion dans du tampon TNT.
9. Laver les lames 3 fois avec du tampon TNT pendant 5 min.
10. Immerger les lames rapidement en eau traitée au DEPC.
11. Laisser les lames sécher à l'air. Monter les préparations anti-décoloration réactif contenant du DAPI. Sceller les coins des lamelles avec du vernis à ongles.
12. Les diapositives sont maintenant prêts pour la microscopie. Gardez les lames recouvertes d'une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C si l'expérience doit être rempli le jour suivant. Une étanchéité complète des faces des lames peut être effectuée 24 heures après l'application du réactif anti-décoloration. Cela permettra aux diapositives à numériser jusqu'à une semaine après le protocole a été complété.

6. Visualisation des sondes hybridées

1. Allumez le microscope. Un microscope standard immunofluorescence est sufficient pour ce genre d'expérience, mais si vous avez accès à un microscope confocal, vous pouvez également l'utiliser pour des images en 3D ou pour obtenir des vidéos de vos cellules colorées. Laissez microscope pour se réchauffer pendant 15-30 min. Allumez l'ordinateur et le logiciel.
2. Vérifier la qualité de la coloration au microscope par immunofluorescence. Choisissez un endroit contenant quelques parasites.
3. Ajuster le gain de chaque laser manuellement. Ajuster le séjour de pixels à 4-6 m ^{-1 -1} s et les étapes à 512 x 512 pixels.
4. Prenez une photo de test en utilisant Cadre Lambda. Réajuster le gain laser.
5. Prenez un minimum de 20 bonnes photos de fluorescence des cellules individuelles. Au moins 2-5 photos d'un champ contenant 5-20 parasites sont nécessaires afin d'obtenir une vue d'ensemble juste le pourcentage des parasites positifs.

Résultats

La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN.

Une série d'images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l'invasion érythrocytai...

Discussion

Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d'ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l'intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription <...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique	Sigma / Aldrich	338 826-100ml
Albumax médias: solution de RPMI Glutamine 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 Une solution à 5 ml de glutamine
Albumax médias: Gentamicine sulfate Albumax solution	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamycine sulfate 50 ml de solution Albumax
Albumax solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hypoxanthine
Albumax solution: AlbuMAX II	Jenvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litres du milieu RPMI 1640 Dissoudre avec aimant au max. 50 ° C. Filtrez stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Résine de deionize formamide.
Anti-biotine conjugué à la peroxydase de chèvre pAb	Calbiochem	203206
Anticorps anti-DIG	Novus biologiques	NB100-41330
Anti-fade réactif avec DAPI	Invitrogen	P36931	Les milieux de montage doit durcir pendant 24 heures avant de sceller complètement la diapositive.
Biotine ARN étiquetage Mix	Roche	11685597910
Appareil photo numérique	Numérique Nikon F11 de vue CC
Lamelles de	Menzel-Glaser	631-1570
flacon de culture de 25 cm 2 de surface Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC dans 1000 ml d'eau deinonized. Ajouter un barreau aimanté et remuer pendant 12 h. Autoclave pendant 30 min.
Appareil photo numérique	Numérique Nikon F11 de vue CC
Protéines Dynabeads A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Aimant	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formamide désionisée: 5 g de résine échangeuse d'ions par 100 ml de formamide. Mélanger 30 min. Filtrer sur papier Whatman.
. Gélatine 0 solution à 75%: gélatine	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots.
. Gélatine 0 solution à 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots.
Solution Glutamine: L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtre sterilize et stocker à -20 ° C en aliquots.
Solution Glutamine: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtrer stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots.
Solution d'hybridation: formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, garder congelé à -20 ° C en aliquots 10 ml de formamide désionisée
Solution d'hybridation: Concentré 50x Denhardt	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Solution d'hybridation: Levure tRNARoche blocage réactif	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 ul de 20 mg par ml de levure ARNt
: ADN de sperme de saumon	Fluka / Sigma	31149-106GF	0.4g Roche réactif de blocage 1 ml de 10 mg par ml d'ADN de sperme de saumon (Critique: saumon dénaturent spermDNA à 96 ° C pendant 5 min avant d'ajouter à la solution d'hybridation)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Peut être remplacé par un four d'hybridation et d'hybridation RNase chambres libres rembourrés avec de l'eau DEPC.
Immersion huile transparente aux UV fluorescence gratuit	Sigma	10976-1EA
Microscope confocal immunofluorescence ou	Nikon D-Eclipse TE2000C
Vernis à ongles	Disponible dans n'importe quelle pharmacie
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC désionisée H 2 O			Ajuster le pH à 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldéhyde à 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA dans 80 ml de PBS / DEPC. La chaleur à 65 ° C jusqu'à ce que le PFA dissout. Ajouter 20 ml de PBS, laisser la solution refroidir. Ajuster le pH à 7,4. Filtrer. Boutique en aliquotes à -20 ° C.
Paraformaldéhyde à 4% / acide acétique à 5%			950 paraformaldhyde ul + 50 ul d'acide acétique
Pepsine	Sigma / Aldrich	P7000
Conjugué à la peroxydase anti-biotine	Calbiochem	203206
RBC-milieu de lavage: solution de RPMI Glutamine 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 une solution à 5 ml de glutamine
RBC-milieu de lavage: le sulfate de gentamicine	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamycine sulfate
RNase	Sigma / Aldrich		Faire un 10 mg / ml de solution.
RNase tube de 1,5 ml	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Diapositives 11mm 4 puits	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M
SSC 20x: citrate de sodium dihydraté	Sigma / aldrich	W302600	3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M
PESS 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g de NaCl
PESS 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g de NaH 2 PO 4.
PESS 20x: 4 EDTA en poudre			9,4 g d'EDTA en poudre Ajouter de l'eau DEPC, ajuster le pH 7,4. Autofendit pendant 20 min
TNB mémoire tampon: tampon TNT			10 ml du tampon TNT
TNB mémoire tampon: réactif de blocage			0,05 g de réactif de blocage Pour dissoudre le réactif de blocage, chauffer la solution à 60 ° C pendant une heure sous agitation. Conserver à -20 ° C. (Dérivé de l'Perkin Elmer TSA-protocole).
TNT mémoire tampon: Tris / HCl	Sigma	T1503	1M Tris / HCl, pH 8,0
TNT mémoire tampon: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
Tampon TNT: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajuster le pH à 7,5 à la température ambiante. (Dérivé de l'Perkin Elmer TSA-protocole).
TSA, plus Cyanine3 / fluorescéine système	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Lire le protocole de la TSA Plus System Palette de fluorescence avec soin avant de commencer l'expérience.
Tubes 14 ml stérile	Almeco - CM Aps LAB	91016