Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l'activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Résumé

Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enregistrement est disponible dans le commerce.

Résumé

Bien que le cerveau représente moins de 5% de la masse du corps, il utilise environ un quart du glucose utilisé par le corps au repos ^1. La fonction de non sommeil à mouvements oculaires rapides (NREMS), la plus grande partie du sommeil par le temps, est incertain. Cependant, un trait saillant de NREMS est une réduction significative du taux d'utilisation du glucose cérébral par rapport à l'état de veille ^2-4. Ceci et d'autres constatations ont conduit à la croyance largement répandue que le sommeil a une fonction liée au métabolisme cérébral. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la réduction du métabolisme du glucose cérébral pendant NREMS restent à élucider.

Un phénomène lié à NREMS qui pourraient avoir une incidence sur le taux métabolique cérébrale est l'apparition d'ondes lentes, des oscillations à des fréquences de moins de 4 Hz, à l'électroencéphalogramme ^5,6. Ces ondes lentes détectées au niveau de la boîte crânienne ou cérébrale surface corticale refléter laoscillations de neurones sous-jacents entre un état ​​dépolarisé / et un état ​​hyperpolarisé / bas ^7. Pendant l'état bas, les cellules ne subissent pas de potentiels d'action pour des intervalles allant jusqu'à plusieurs millisecondes cents. Restauration des gradients de concentration ionique à la suite de potentiels d'action représente une charge importante du métabolisme de la cellule ^8; absence de potentiels d'action pendant les états associés à la baisse de NREMS peuvent contribuer au métabolisme réduit par rapport à réveiller.

Deux défis techniques ont dû être résolues pour que cette relation hypothétique à tester. Tout d'abord, il était nécessaire de mesurer cérébrale métabolisme glycolytique avec une résolution temporelle reflète la dynamique de l'EEG cérébrale (soit plus de quelques secondes plutôt qu'en quelques minutes). Pour ce faire, nous avons mesuré la concentration de lactate, le produit de la glycolyse aérobie, et donc une lecture de la vitesse du métabolisme du glucose dans le cerveau des souris. Lactate étaitmesurée à l'aide d'un capteur à base de lactate oxydase temps réel incorporée dans le cortex frontal. Le mécanisme de détection comprend une électrode de platine-iridium entouré d'une couche de molécules de lactate oxydase. Métabolisme du lactate par la lactate oxydase produisant du peroxyde d'hydrogène, qui produit un courant dans l'électrode de platine-iridium. Si une montée en puissance de la glycolyse cérébrale permet une augmentation de la concentration en substrat pour la lactate oxydase, qui est ensuite réfléchie en courant accrue à l'électrode de détection. Il était en outre nécessaire de mesurer ces variables tout en manipulant l'excitabilité du cortex cérébral, afin d'isoler cette variable à partir d'autres facettes de NREMS.

Nous avons conçu un système expérimental pour la mesure simultanée de l'activité neuronale par l'intermédiaire du elecetroencephalogram, la mesure du flux glycolytique par l'intermédiaire d'un biocapteur lactate, et la manipulation de l'activité neuronale cérébrale corticale via l'activation de la pyramide optogeneticMidal neurones. Nous avons utilisé ce système pour documenter la relation entre le sommeil liés à des formes d'onde électroencéphalographique et la dynamique moment-à-moment de la concentration de lactate dans le cortex cérébral. Le protocole peut être utile pour toute personne qui s'intéresse à l'étude, à se comporter librement les rongeurs, la relation entre l'activité neuronale mesurée au niveau électroencéphalographique et énergétique cellulaire dans le cerveau.

Protocole

1. Préparation chirurgicale des animaux

1. Sujets expérimentaux

Utilisez la souris de l'B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique ^9; souche JAX # 7612) ou d'autres souris exprimant le canal cationique sensible à la lumière bleue, channelrhodopsin-2, dans les neurones corticaux cérébraux. Application de la lumière bleue dans le cortex cérébral du B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique provoque les neurones pyramidaux exprimant channelrhodopsin-2 pour dépolariser et subissent les potentiels d'action ^9,10. À la suite de l'activation des cellules pyramidales, interneurones locaux sont activés, et la variation de potentiel est propagée vers les neurones au-delà du site de stimulation ^10. Opérer dans des conditions stériles dans le respect des directives réglementaires applicables: autoclave des instruments chirurgicaux et softpacks (champ opératoire, des tampons de gaze); chaud cordon stériliser tous les appareils résistants à la chaleur métalliques implantés (canules, les vis et les fils)pour 30 s; Désinfecter la chaleur intolérants dispositifs implantables (câble à fibre optique, connecteur en plastique) avec un pendage de 10 secondes dans de l'éthanol; coup d'éthanol par immersion articles sèche en application de l'air comprimé.

2. Anesthésie, de placement stéréotaxique et le dédouanement des Skull

Utilisez le IMPAC ⁶ intégré des patients (Multi Vet Equip Inc) Système d'anesthésier la souris. Utiliser 5% d'oxygène Isoflurane/95% pour l'induction et 3% d'oxygène Isoflurane/97% pour l'entretien pendant la chirurgie. Placez l'animal sur une couverture à circulation d'eau réglé à 37 ° C. Il n'est pas nécessaire de surveiller la température du corps si la couverture est maintenue à cette température.

3. Préparation du crâne pour l'implantation

Préparer le site d'incision en se rasant tous les poils du haut du crâne. La zone rasée devrait s'étendre latéralement jusqu'aux oreilles et antéro-postérieur de l'œil à l'extrémité postérieure du crâne. Désinfecter la peau exposée avec trois CONSÉCUTIFStampons e de la bétadine puis de l'éthanol. Faire une incision médiane sur le sommet du crâne, entre les yeux de l'arrière du crâne. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d'hydrogène et une solution saline stérile (NaCl 0,9%). Contrôler le saignement avec un outil de cautérisation. Repérez et marquez bregma et lambda pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques. Coordonnées stéréotaxiques pour les configurations d'électrodes de stimulation / optogenetic que nous avons utilisées sont présentées dans le tableau 1 et schématisé sur la figure 1A.

4. Préparation des sites d'implantation sur Skull

Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec un peu 0.5mm balle bavure d'établir chaque site d'implantation dans le crâne. Chanfreiner le bord externe de chaque trou avec une balle de 0,7 mm bavure bits pour faciliter l'insertion de vis.

5. Insertion et fixation des canules, EMG Leads et prospects EEG

Insérer les vis EEG (0,8 mm de longueur, avec 2 cm de 3 non couché0-jauge conserve-bus en cuivre fil pré-soudé à la tête de vis) dans les trous et les enfoncer avec un tournevis manuel à fentes révolutions environ 4-5 pour obtenir la profondeur désirée. Tenez canules guides en place d'un support stéréotaxique canule et fixez-les sur le crâne et les ancres avec du ciment acrylique. Chaque canule guide devrait contenir un mannequin canule / stylet (Plastics One, pièce n ° C312 DC \ 1) à partir du moment de la chirurgie de la période d'expérimentation (10-14 jours) pour maintenir la perméabilité.

6. La fermeture du site opératoire

Une fois que l'EEG et des canules de guidage sont positionnés dans le crâne, les coller ensemble avec du ciment acrylique dentaire (Dental Lang - Ortho-Jet ciment). Après prise du ciment, positionner le connecteur en plastique (qui fait partie de la technologie Pinnacle # 8402) au-dessus du monticule ciment séché. Souder les extrémités des fils conducteurs provenant de l'EEG sur les contacts sur le connecteur en plastique. Enveloppez les fils conducteurs dans le ciment. Ensuite, tirer les fils EMG dans le muscle nuques en les faisant coulisser dans le cylindre d'une aiguille 21ga percé muscle. Attachez noeud de chirurgien à deux de de 5-0 suture de nylon autour de ces fils juste en aval de l'endroit où ils sortent le muscle. Suturer la peau ainsi que fut rentré pour accéder au tissu musculaire avec noeuds simples chirurgien interrompus, à l'aide d'un revers de coupe P-3 et 5-0 aiguille de suture en nylon.

7. L'analgésie post-opératoire et la récupération

Administrer la buprénorphine comme un analgésique (0,1 mg / kg, sous-cutanée) et la flunixine méglumine (0,1 mg / kg, sous-cutanée) comme un anti-inflammatoire immédiatement après la chirurgie, et tous les jours sur les jours 1-2 après la chirurgie. Permettre aux animaux de récupérer dans des conditions standard de logement colonie pendant au moins sept jours avant l'expérimentation. En l'absence de soins supplémentaires au-delà du logement colonie standard, canules peuvent s'attendre à rester brevet pour au moins deux semaines avec les stylets à demeure fixé en place. Capteurs EEG et EMG peut également s'attendre à conserverfonctionnalité de cette durée.

2. Génération d'impulsions lumineuses Timed

1. Programmation de l'unité de stimulation de MC

Connectez l'unité MC-stimulation (systèmes multi-canaux) via une connexion USB à un ordinateur de bureau. Utilisez la feuille de calcul-comme l'interface utilisateur MC-stimulation de programmer l'appareil de stimulation de MC. Entrer la valeur désirée TTL (logique transistor-transistor) de tension pour la période de suite, les durées de stimulus et à l'extérieur des périodes, le nombre de cycles par seconde désirés et le nombre total de cycles répétés de la session de stimulation entier. Pour de plus amples détails, voir MC-stimulation manuel technique:

3. Fabrication / Assemblage de fibres optiques Probé pour Light Delivery au cortex cérébral

1. Fournitures et le matériel nécessaires sont disponibles sur: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
2. Taille et de polissage de la fibre optique. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Assemblée des rongeurs système de stimulation optogenetic

1. Interface de MC-stimulation de l'unité et Laser

Une fois que l'unité de MC-stimulation est programmé, exécutez-le en tant que générateur de signal autonome d'un binaire de 5 volts signal ON / OFF. Connectez l'unité MC-stimulation à l'unité de puissance compatible TTL du laser avec connecteurs BNC.

2. Produire Sortie du laser par fibre optique

Utilisez l'affichage numérique et variable cadran puissance de sortie de l'unité de puissance du laser au manuelly ajuster la puissance de sortie du laser. Connecter l'unité de puissance de laser pour le laser par l'intermédiaire d'un câble ruban. Connecter le FC femelle (embout de connecteur) adaptateur de fibre du laser sur le connecteur mâle FC sur le câble de raccordement à fibres optiques (3 m de longueur, 200 mm diamètre de fibre de verre encastrée dans la conduction de réflexion de lumière de polymère d'acrylate de gainage).

3. Transport du laser à l'animal: Commutateur rotatif

Branchez le câble à fibres optiques d'origine (3 m de longueur) et le câble à fibres optiques livraison (45 cm de longueur) aux extrémités opposées du joint rotatif optique enfermant deux lentilles de collimation (Doric Lenses). La fibre optique joint rotatif sert de collecteur: comme l'animal se déplace de sa cage, le joint rotatif tourne pour empêcher la rupture des câbles à fibres optiques. Utiliser des colliers en matière plastique pour fixer le collecteur à un support en métal placé au-dessus de la cage cylindrique, dans lequel l'animal est logé.

4. Fixation Fiber Optic livraisonÀ la tête de câble

Restreindre la souris en utilisant une seule main à la broche de la souris sous un palmier en forme de coupe. Orientez la tête entre le milieu de l'expérimentateur et l'index. Retirer la canule factice de la canule de guidage placé pour la canule fibre optique. Effacer la canule de guidage de débris à l'aide d'une aiguille stérile 25ga. Insérez le câble à fibre optique à la main et le fixer à la canule guide à fibres optiques avec un bouchon fileté récupéré à partir d'une canule factice. Contrôler la profondeur d'insertion du câble à fibre optique dans le cerveau d'un noeud de suture attaché sur le câble de fibre optique à une distance fixe de l'extrémité plate-fendues. L'ensemble du dispositif expérimental est représenté sur la figure 1B.

5. Mesure de l'EEG défini sommeil et de la concentration de lactate pendant la stimulation optogenetic

1. Précalibration du capteur de lactate

Pré-étalonnage du capteur est effectué avec le lactate in vitroKit (partie Pinnacle Technology # 7000-K1-T). Le capteur est équilibrée en tampon phosphate salin (pH 7,4), puis exposées à trois concentrations de L-lactate de manière progressive selon les protocoles du fabricant.

2. L'insertion de la sonde et du câble Lactate EEG

Insérer le capteur pré-calibré dans le crâne monté sur la canule guide de lactate d'une manière identique à la fibre optique câble d'insertion procédure (section 4.4). Connecter le capteur de lactate au préamplificateur de la Pinnacle 8400 biocapteur avec connecteurs bipolaires. Fixez ce préamplificateur sur le connecteur à 8 broches sur la headmount chirurgicalement implanté.

3. Établir Intensité de stimulation optogenetic

Avant la collecte de données, utilisez le bouton de commande laser d'intensité pour régler l'intensité du stimulus optogenetic. L'amplitude de la réponse EEG variera selon les animaux, en raison de facteurs qui n'ont pas été étudiés de façon systématique, une d doit être vérifiée par inspection visuelle au début de la stimulation. Dans la pratique, une intensité de 80-120 μWatts produit généralement une augmentation de l'amplitude EEG d'environ 50% à la fréquence de stimulation. Post-hoc transformée de Fourier rapide analyse (voir section 5.5) est nécessaire pour quantifier l'ampleur absolue de la réponse.

4. Collecte des données

Recueillir des données en utilisant le système Pinnacle 8400: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Traitement des données avec Neuroscore

Annotez états de sommeil par inspection visuelle des données EEG et EMG avec l'interface Neuroscore (DataSciences, international: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) ou l'interface des siréniens (Pinnacle Technology:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Données de process dans dix secondes époques comme suite, non-rapid eye movement sommeil ou sommeil à mouvements oculaires rapides basées sur l'EEG et EMG. Sauvegardez les données que Microsoft Excel pour une analyse supplémentaire et des tests statistiques.

Résultats

Comme le montre la figure 2, une souris équipée pour la stimulation optogenetic et le lactate / EEG / EMG collecte de données a subi spontanées transitions d'état veille / sommeil tout en EEG, EMG et la concentration du lactate cérébral ont été surveillés en permanence. Actuelle au niveau du capteur de lactate augmenté pendant les périodes de faible amplitude EEG et a diminué au cours des périodes de forte amplitude EEG. Comme le montre la figure 3,

Discussion

Les méthodes présentées ici permettent de mesurer la relation entre le sommeil et les changements dans la concentration dans le cerveau du lactate glycolytique intermédiaire sur une échelle de temps n'était pas possible auparavant. Animaux subissent des transitions spontanées entre sillage, NREMS et REMS. En outre, nous sommes en mesure d'appliquer des stimuli optogenetic alors que les animaux subissent ces transitions. Les données recueillies à ce jour montrent que l'impact à la fois spontané et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Composant	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BASi Souris Guide canule	Pinnacle Technology / BASi Inc	7032
Biocapteur lactate	Pinnacle Technology	7004
Montage en tête	Pinnacle Technology	8402
Veille / Système d'enregistrement des biocapteurs	Pinnacle Technology	8400-K1-SL	2 canaux EEG EMG, 1 canal, & 1 biocapteur
Souris captif in vitro kit d'étalonnage	Pinnacle Technology	K1-7000-T
Fibre optique Guide canule	Plastics One	C312G	Grosseur 21 Guide de canule
Canule Dummy	Plastics One	C312DC	21 Dummy Gauge
Scribe fibre de diamant	Thorlabs	S90W
Connecteur de fibre à sertir	Thorlabs	CT042
Tubes furcation	Thorlabs	FT030	03,0 mm
	Thorlabs	T10S13	Dia. 0,012
Décapant Tube furcation	Thorlabs	FTS3
Bare Fiber Revêtement dur multimode	Thorlabs	BFL37-200	200 Diamètre um, 0,37 NA
Fil Cisailles / Kevlar Ciseaux	Thorlabs	T865
Fibre optique époxy	Thorlabs	F112
Outil à dénuder fibre	Thorlabs
Plaque de polissage de verre	Thorlabs	CTG913
Tampon de polissage en caoutchouc	Thorlabs	NRS913
Eye Loupe	Thorlabs	JEL10
Kim Wipes	Thorlabs	KW32
Air comprimé	Thorlabs	CA3
Polissage Puck	Thorlabs	D50-xx
Portée inspection de la fibre	Thorlabs	CL-200
Films de polissage	Thorlabs	LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
Extrémité du connecteur FC / PC	Thorlabs	30126G2-240	240 Alésage um, SS Ferrule
Unité de stimulation de MC	Multi-Channel Systems	STG-4002
Logiciel de stimulation de MC	Multi-Channel Systems	MC-stimulation V 2.1.5
Blue Laser	CrystaLaser	CL473-050-0
Alimentation Laser	CrystaLaser	CL2005
Fiber Optic Rotary Joint	Doric Lenses	FRJ-v4
			Tableau 2. Matériel et équipements.