Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Résumé

Procédé pour mesurer la longueur de persistance ou la rigidité en flexion de biopolymères est décrit. La méthode utilise une kinésine axée sur les microtubules glisse test pour déterminer expérimentalement la longueur de persistance des microtubules individuels et est adaptable à l'actine des essais à base de glisse.

Résumé

Les microtubules sont des polymères du cytosquelette qui jouent un rôle dans la division cellulaire, mécanique cellulaire et le transport intracellulaire. Chacune de ces fonctions nécessite microtubules qui sont raides et droites assez pour couvrir une fraction significative du diamètre cellulaire. En conséquence, la longueur de persistance des microtubules, une mesure de rigidité, a été activement étudiée pour les deux dernières décennies ^1. Néanmoins, des questions restent ouvertes: microtubules courts sont 10-50 fois moins rigide que les microtubules longues ^2-4, et même microtubules longs ont mesuré la longueur de persistance qui varient d'un ordre de grandeur ^5-9.

Ici, nous présentons une méthode pour mesurer la longueur de persistance des microtubules. La méthode est basée sur une analyse axée sur la kinésine microtubules glisse ^10. En combinant rares marquage fluorescent des microtubules individuels avec suivi de particule unique de fluorophores individuelles attachées à des microtubules, le Glidintrajectoires g de microtubules simples sont suivis du nanomètre-niveau de précision. La longueur de persistance de la trajectoire est la même que la longueur de persistance de l'microtubules dans les conditions utilisées ^11. Un sous-programme de suivi automatisé est utilisé pour créer des trajectoires des microtubules à partir de fluorophores liés aux microtubules individuels, et la longueur de persistance de cette trajectoire est calculée à l'aide des routines écrites en langage IDL.

Cette technique est rapidement réalisable, et capable de mesurer la longueur de persistance de 100 microtubules dans un jour de l'expérimentation. La méthode peut être étendue pour mesurer la longueur de persistance sous une variété de conditions, y compris la durée de persistance en fonction de la longueur le long des microtubules. En outre, les routines d'analyse utilisés peuvent être étendus à la myosine à base de tests effet de glisse, pour mesurer la longueur de persistance des filaments d'actine ainsi.

Introduction

The cytoskeleton, a network of biopolymers found in most eukaryotic cells, plays a role in cellular organization, intracellular transport, and cell mechanics. The mechanical characteristics of the biopolymers of the cytoskeleton (primarily actin and microtubules) play a significant role in determining the mechanical characteristics of the cell as a whole¹². Since whole cell mechanics can characterize healthy and diseased cells^13,14 and is involved in cellular motility¹⁵, the mechanical properties of the underlying cytoskeletal components have been an active area of study for the past two decades¹.

The flexibility (or stiffness) of biopolymers is characterized by the persistence length, the length of polymer which bends by approximately one radian under thermal fluctuations at ambient temperature. A number of techniques have been developed to measure persistence length¹⁶, for example active techniques which involve bending the polymer using hydrodynamic flow, optical traps, or electric fields^4,17,18 , and passive techniques which measure the fluctuations of free polymers in solution^5,6 . The active measurements, however, require specialized setups to implement known forces on the micrometer scale, and the free-fluctuation measurements can be challenging due to diffusion out of the plane of focus of the microscope used.

In this article, we describe a complementary, passive, technique to measure the persistence length of microtubules, a cytoskeletal polymer. The technique involves gliding assays, which ensure that the polymer always remains in the focal plane¹⁹. Moreover, it involves tracking single fluorophores attached permanently to the polymer of interest, so that specific locations along the polymer are well characterized.

A cartoon of the method is shown in Figure 1. Kinesin moves specifically toward the + end of microtubules, so the microtubules in a gliding assay are propelled unidirectionally. The leading end of the microtubule, beyond the last kinesin attached, is free to fluctuate under the thermal forces of the surrounding solution. As the microtubule is propelled forward, the end fluctuates until binding to a new kinesin molecule further along the glass slide freezes in a given fluctuation. Because kinesin attaches microtubules very strongly, the microtubule is constrained to follow the path of the leading end. Therefore, the statistical fluctuations frozen into the microtubule trajectory are the same as the statistical fluctuations of the free end of microtubules¹¹, and can therefore be used to calculate the persistence length according to²⁰

where l_p is the persistence length of the microtubule, θ_s is the angle between tangents to the trajectory separated by a contour length s, and <> denotes an average over all pairs of positions separated by a contour length s.

The gliding assay itself uses kinesin biotinylated at the coiled-coil²¹ specifically bound to the glass slide via a streptavidin-biotin linkage. This attachment ensures that the motor domains are free to bind to and propel microtubules. In order to follow microtubule trajectories, microtubules are sparsely labeled with organic fluorophores^22,23 - the labels must be sparse enough that single fluorophores are resolvable using single molecule fluorescence microscopy. Single fluorophores are tracked using image analysis routines written in IDL. The trajectories of each fluorophore bound to a given microtubule are combined into a composite microtubule trajectory automatically²⁴. The tangent angles θ to each point along a trajectory are calculated; from these tangent angles the <cosθ_s> value is calculated for each contour length s. Finally, these data are fit to Eq. 1 in order to extract a persistence length for a given microtubule, or for many microtubules in the same gliding assay.

The method is robust enough to work with microtubules prepared in a wide variety of conditions (with different stabilizing agents or other small molecules bound to the microtubule, with bound microtubule associated proteins (MAPs), or with a variety of viscous solutions). In our lab, the technique has been used to characterize the persistence length of microtubules as a function of length along the microtubules and microtubules with different stabilizing agents. The main restriction is that the microtubules must still support kinesin motility. Since kinesin is a robust motor enzyme, this is a fairly loose restriction. By replacing microtubules with actin and kinesin with a myosin family enzyme, the persistence length of actin can be measured using the same technique.

Protocole

1. Microtubules vol à voile Assay Solutions mères

Préparer à l'avance de dosage glisse.

1. Polymériser 0,5 mg microtubules peu marquées avec un fluorophore organique lumineuse ^22. La concentration étiquette cible est de 1 fluorophore par micromètre de microtubules, soit une densité étiquetage d'environ 1 fluorophore par 1.500 dimères de tubuline. Entreposer à la température ambiante, la lumière protégée avec de l'aluminium, une feuille pour un maximum de deux semaines.
2. Purifier biotine-kinésine ²¹ à environ 1 uM. Conserver à -80 ° C en 5 aliquotes pour utilisation dans des expériences individuelles.
3. Préparer le tampon de dosage (AB) de 50 mM imidiazole, 50 mM de chlorure de potassium (KCl), 4 mM de chlorure de magnésium (MgCl _2), 2 mM d'éthylène-glycol d'acide tétraacétique (EGTA), pH 6,7. Filtre stérile et conserver à 4 ° C.
4. Dissoudre biotinylé albumine de sérum bovin (BSA-biotine) à 2 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue.Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un mois.
5. Dissoudre la streptavidine (SA) à 10 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 20 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
6. Dissoudre α-caséine à 5 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
7. Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l'eau déminéralisée à 200 mM. Conserver à -20 ° C en aliquotes de 100 pi, utiliser dans les 8 heures de décongélation. Peut-être recongelé.
8. Dissoudre le paclitaxel (PT) en HPLC du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 4 mM. Boutique en 10 aliquotes à -80 ° C à long terme, de -20 ° C à court terme. Utiliser dans les 8 heures suivant la décongélation. Peut-être recongelé.
9. Dissoudre le glucose dans de l'eau désionisée à 120 mg / ml. Conserver dans aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Peut-être recongelé.
10. Disrésoudre l'adénosine triphosphate (ATP) dans de l'eau déminéralisée à 150 mM, pH 7,0. Boutique en 5 aliquotes à -80 ° C, utiliser dans les 8 heures de décongélation.
11. Préparer stocks d'oxygène 100x balayage ²⁵ par dissolution de 10.000 unités de glucose-oxydase et catalase 156.000 unités dans 600 ul du tampon de dosage total. Centrifuger brièvement dans une microcentrifugeuse à granulés solides; surnageant filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 10 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant une semaine.

2. Microtubules Gliding test, même Préparation de la solution Jour

Préparer les solutions de 02.01 à 02.06 le jour de l'expérience. Avec la pratique, les solutions de 2.2 à 2.6 peuvent être préparés pendant l'écoulement des cellules lavage. Sauf indication contraire, gardez solutions mères sur la glace.

1. Préparer AB, 1 ml de tampon de dosage avec 10 ul de la TNT stock (AB avec 2 mM de DTT). Conserver à température ambiante.
2. Préparer bio-BSA tampon, 40 & mu, L d'un mélange 1:1 du stock biotine-BSA et AB. Conserver à température ambiante.
3. Préparer un tampon BSA, mélangeant 645 ul de AB avec 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA dans AB). Conserver à température ambiante.
4. Préparer un tampon SA, en mélangeant 57 ul de AB avec 3 streptavidine actions ul (0,5 mg / ml de streptavidine dans AB). Conserver à température ambiante.
5. Préparer α-caséine tampon, mélanger 200 pi de tampon BSA, 50 ul de stock caséine et 0,8 ul de 15 uM (1 mg / ml α-caséine, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM d'ATP dans AB) ATP. Conserver à température ambiante.
6. Préparer la fluorescence anti-eau de Javel tampon, mélangeant 95 pl de tampon α-caséine, 2,5 ul de stock de glucose, 1 ul mélange d'oxygène 100x balayage, 1 stock paclitaxel pi, 1 pi 2-mercaptoéthanol (ßME). Ajouter ßME sous une hotte. Utilisez la fluorescence anti-eau de Javel tampon dans 1 h de préparation. ATTENTION: ßME est hautement toxique et sent mauvais. Assurez-vous d'être ouvert uniquement sous la hotte. Bouteille dans le magasinl'absence de lumière, la lumière dégrade ßME et sa capacité à réduire photoblanchiment.

3. Microtubules Gliding Assay

1. Construire environ quatre voies d'écoulement entre une lamelle 24 x 60 mm et 22 mm x 22 lamelle avec de la graisse à vide, extrudés à partir d'une seringue à travers un embout de pipette, comme un élément d'espacement. Chaque voie d'écoulement doit être d'environ 10 pi en volume (échelle des volumes suivants en conséquence).
2. Lavez 10 ul de bio-BSA tampon dans chaque couloir. Incuber 5 minutes pour permettre BSA pour revêtir les surfaces de verre.
3. Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour enlever la biotine libre-BSA, tout en continuant à bloquer la surface de glissement. Utilisez un Kimwipe ou de papier filtre pour éliminer le tampon du côté opposé de chambre d'écoulement, en étant sûr de ne pas laisser de bulles d'air à passer par la chambre d'écoulement.
4. Lavez 15 pi SA-tampon dans chaque couloir. Attendre 10 minutes, ou jusqu'à 2 heures. La streptavidine se lie à la biotine lié à la surface-BSA.
5. Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour retirer gratuitement SA, tout en continuant de bloquer la surface de glissement.
6. Laver chaque voie avec 15 ul de tampon α-caséine. α-caséine permet en outre de bloquer liaison non spécifique de la kinésine et des microtubules dans le verre.
7. Diluer kinésine à 10 nM dans α-caséine tampon et laver chaque voie avec 15 ul de cette kinésine - α-caséine solution. Attendre 15 minutes (ou jusqu'à une heure) de la kinésine biotinylé de se lier spécifiquement à la streptavidine liée à la surface. Les domaines kinésine moteur resteront libres de lier les microtubules.
8. Diluer le paclitaxel à 40 pM dans la température ambiante α-caséine tampons, et laver chaque voie avec 15 ul de cette solution pour laver la kinésine libre et de pré-charger chaque chambre d'écoulement avec une solution de paclitaxel pour éviter de dépolymérisation des microtubules. Froide dépolymérise également microtubules, alors assurez-vous que ces étapes se produisent à température ambiante avec salle de temre des solutions.
9. Diluer marqué par fluorescence microtubules 1:100-1:1,000 de la fluorescence anti-eau de Javel tampon avec 1 mM d'ATP. Lavez 15 ul dans une voie et d'observer dans les 30 minutes.

4. Collecte des données

1. Observez le glissement des microtubules en utilisant la microscopie à fluorescence, un microscope capable de résoudre fluorophores simples comme une installation commerciale ou maison de construction FRBR est nécessaire ²⁶ (figure 2).
   Les microtubules devrait être propulsé par les moteurs de kinésine sur le substrat à environ 0,5 mm / s, en fonction de la température. Si le champ de vision du microscope est de 50 um, les microtubules individuels doit être visible pendant environ 100 secondes. Réglez l'intensité lumineuse de telle sorte que les fluorophores simples ne photoblanchiment plus vite que 100 sec. Si l'on utilise une excitation laser, un réglage de puissance de l'ordre de 3-5 mW est approprié.
2. Recueillir des séquences d'images pour l'analyse. 600 images à5 Hz (2 min au total) fonctionne bien. Utiliser des séquences assez longtemps que les microtubules traversent l'ensemble du champ de vision.

5. Analyse des données

Une routine IDL, get_lp.pro , est annexé. Cette routine renvoie une valeur de longueur de persistance basée sur les microtubules glisse dans une séquence d'images donné. Soit exécuter cette routine sur chaque séquence d'images, la modification des paramètres d'intensité en fonction de la configuration de votre microscope particulier, ou procédez comme suit:

1. Suivre chaque fluorophore attaché à un microtubule à créer des trajectoires fluorophores.
2. Mélanger tous les trajectoires des fluorophores sur un microtubule donné dans une trajectoire globale des microtubules; répétez pour chaque microtubules dans la séquence d'images (figure 3).
3. Calculer l'angle de la tangente à chaque point le long de la trajectoire (figure 4), Et calculer θ _s> dans l'équation. 1 en faisant la moyenne du cosinus de la différence d'angle pour chaque paire de points séparés par un chemin de longueur l (figure 5). Trouver la longueur de persistance pour un microtubule ou un groupe de microtubules par θ _s> à Eq. 1, la pondération des points de données individuels dans l'ajustement par le nombre de valeurs indépendantes du cos θ _s qui sont utilisés pour calculer la moyenne.

Résultats

A snapshot from a gliding assay is shown in Figure 2. A good microtubule density is 1-10 microtubules per field of view; substantially more will result in mistracking as microtubules cross each other. A plot of the 11 microtubule trajectories from the gliding assay in Figure 2 is shown in Figure 3. Typical trajectories are 10 to 30 μm long; some trajectories have gaps where one microtubule crosses another. These trajectories may be discarded from analysis.

...

Discussion

Les mesures de longueur de persistance sont une bonne caractérisation des propriétés mécaniques des biopolymères individuels. Dans cet article, nous avons décrit une méthode de mesure de la longueur de persistance des microtubules. Comme indiqué dans l'introduction, cette méthode est facilement étendu à l'examen des propriétés mécaniques des microtubules dans une variété de conditions tout simplement en faisant varier les réactifs, la température, la viscosité ou à l'étape finale de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
biotinylated BSA	Thermo Scientific	29130
α-casein	Sigma-Aldrich	C6780
streptavidin	Thermo Scientific	21125
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
catalase	Sigma-Aldrich	C100
glucose	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Buy small amount.
24X60 mm No. 1 1/2 cover glass	VWR	48393-252
22X22 mm No. 1 cover glass	Gold Seal	3306
High Vacuum Grease	Dow-Corning	NA
Equipment
TIRF microscope	many	NA	The TIRF microscope used in this method was home-made.
IDL (software)	Exelis	NA	Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software.