Method Article
Nous présentons ici une méthode électrophysiologique basé sur membranes supportées solides en mettant l'accent sur ses applications pour la caractérisation des transporteurs membranaires électrogènes.
La méthode électrophysiologique nous présentons est basée sur une membrane solide supporté (SSM) composée d'une couche octadécanethiol chimisorbée sur une puce de capteur revêtu d'or et une monocouche de phosphatidylcholine sur le dessus. Cet ensemble est monté dans un système de cuve contenant l'électrode de référence, un fil d'argent chlorée.
Après adsorption de fragments de membrane ou des protéoliposomes contenant la protéine de membrane d'intérêt, un échange de solution rapide est utilisé pour induire l'activité de transport de la protéine de membrane. Dans l'unique solution change protocole deux solutions, l'une non-activation et une solution d'activation, sont nécessaires. Le débit est régulé par l'air sous pression et un système de vanne et le tube intérieur d'une cage de Faraday.
La cinétique de l'activité de transport électrogène est obtenue par l'intermédiaire d'un couplage capacitif entre le MSS et les protéoliposomes ou des fragments de membrane. La méthode, par conséquent, ne cède que transient courants. Le courant de crête représente l'activité de transport fixe. Les courants de transporteur en fonction du temps peuvent être reconstruites par l'analyse du circuit.
Cette méthode est particulièrement adaptée pour les transporteurs procaryotes ou des eucaryotes transporteurs de membranes intracellulaires, qui ne peuvent être étudiés par patch-clamp ou des méthodes de serrage de tension.
Ici, nous démontrons une nouvelle approche électrophysiologique basé sur une membrane solide supporté (SSM) pour la caractérisation des protéines membranaires électrogènes.
Le support solide est constitué d'une couche mince d'or sur une lame de verre, la puce de capteur. La surface de l'or hydrophile est utilisé pour lier le groupe thiol d'un réactif alcanethiol. Ensuite, auto-assemblage d'un monolyer de phosphatidylcholine achève la formation de la SSM.
Pour mesurer les réactions électrogènes de protéines membranaires, protéoliposomes ou des fragments de membranes sont adsorbées à la SSM (Figure 1). La protéine contenant la membrane et le MSS former ensuite un système de membrane à couplage capacitif. Par conséquent, la translocation de charge à la membrane contenant des protéines peut être détecté par couplage capacitif via le SSM. Cette méthode ne donne que des courants transitoires. Le courant de crête représente l'activité de transport fixe. Le temps cu transporteur dépendrrents peuvent être reconstruites par l'analyse du circuit.
La puce de capteur est monté dans un système de cuve (figure 2). La cuve a un volume de cuve cylindrique de 17 pi (volume net avec o-ring monté). Une broche de contact à ressort crée le contact à l'amplificateur. Un raccord de sortie est vissé à la partie supérieure de la partie principale et porte l'électrode de référence, un fil d'argent chlorée.
La cuvette est montée dans une cage de Faraday. Elle est reliée à un passage de fluide, qui est utilisé pour induire l'activité de transport de la protéine de la membrane en réponse à un échange de solution rapide (figure 3). Dans l'unique solution change protocole deux solutions, l'une non-activation et une solution d'activation, sont obligatoires. Le débit est régulé par l'air sous pression à l'aide d'un logiciel de commande de soupape sur un ordinateur ou un commutateur manuel sur un boîtier d'interface.
1. Mise en place d'un dispositif pour SSM à base d'électrophysiologie
Des détails sont donnés dans deux de nos publications techniques, qui contiennent également des schémas et des photographies de nos cuves et mis en place 1, 2. Différentes configurations de change de solution et les protocoles de flux sont également abordés dans notre document de la méthode 2.
Dans ce qui suit, nous ajoutons quelques améliorations récentes et les détails techniques qui ont un rapport direct à la vidéo de présentation.
Vanne de régulation et d'acquisition de données
Le boîtier d'interface contient un / interface commerciale USB numérique sortie analogique (NI USB 6009 de National Instruments) et les pilotes de la vanne. Il contrôle le débit de la solution et est responsable de l'acquisition des données. Les vannes sont normalement entraînés avec 12 V. Cependant, pour la commutation rapide des vannes peuvent être commandées avec une tension allant jusqu'à 18 V. Dans la vidéo, nous utilisons une alimentation de 12 V.
Le circuit de commande de la valve peut fonctionner quatre soupapes. Il a été fabriqué par l'atelier de l'Institut Max Planck de biophysique. Les soupapes peuvent être commandées par ordinateur ou manuellement via les interrupteurs sur le panneau avant. Ce dernier est commode nettoyage-procédures-et rinçage. Pendant la mesure, le boîtier d'interface est contrôlée par ordinateur en utilisant une commande de la vanne et le logiciel d'acquisition de données (2 R surfe logiciel, IonGate Biosciences).
2. Préparatifs
Dans cette section, les différents protocoles pour la préparation d'une expérience électrophysiologie SSM à base sont mentionnés.
Faire 2.1 la solution de lipide pour la formation du SSM
2.2 La chloration de l'électrode de référence
Les électrodes de référence doivent être chloré dans des intervalles réguliers due à l'abrasion.
2.3 Préparation du pont sur gel de polyacrylamide
2.4 Préparation des solutions de mesure
En raison de la forte interaction des solutés avec le SSM, des artefacts électriques sont produites lorsque des solutions de composition différente sont échangés. Par conséquent, la préparation des solutions est une étape cruciale. Prenez les précautions suivantes pendant le processus de préparation de la solution pour réduire les artefacts de change de la solution.
3. Une expérience électrophysiologie SSM basée
Nous présentons ici un protocole typique pour une expérience électrophysiologique SSM basée.
3.1 Préparation de l'installation de SSM
Bien que la configuration de la SSM n'est pas utilisé, les tubes sont remplis avec un 30% d'éthanolSolution / eau afin d'éviter la prolifération bactérienne.
3.2 Montage de la cuvette
3.3 Paramètres de la membrane de mesure
Pour vérifier la qualité de la SSM, la capacité et de la conductance sont évalués en utilisant le générateur de fonction.
3.4 Vérification des artefacts de change de la solution
Après les paramètres de la membrane ont été vérifiés, les tampons de mesure doivent être testés pour des objets d'échange de solution.
3,5 ajouter l'échantillon de protéine
Habituellement protéoliposomes ou des fragments de membranes sont conservés congelés à -80 ° C. Pour une mesure d'une aliquote d'environ 30 pi est nécessaire.
3.6 Procédure générale d'une expérience basée sur SSM
3.7 Mesures de contrôle
Un récapitulatif du signal lors d'une série de mesures pourrait se produire en raison de la dégradation des protéines ou une perte d'adsorption. Chaque expérience de SSM dois-jenclure un contrôle de diminution des effectifs. Cela se fait par des mesures répétées avec des solutions identiques. Les moyens de commande de vissage minimale une mesure au début et l'autre à la fin de l'expérience, en utilisant la même solution.
Nous vous recommandons de faire le contrôle de diminution des effectifs dans des conditions où que vous attendez le plus haut pic d'amplitude dans l'expérience. Cela rend plus facile à quantifier la diminution des effectifs du signal.
La diminution des effectifs du signal peut être quantifiée par une comparaison des amplitudes des pics des deux contrôles délabrés. Le pourcentage ainsi obtenu peut être utilisé pour corriger les signaux mesurés par l'hypothèse d'une dépendance du temps linéaire de la diminution des effectifs.
3.8 Contrôles d'artefacts
Si possible, essayez de valider vos résultats par inhibition de la protéine d'intérêt après l'expérience. Signaux restants sont probablement des artefacts de change de la solution. Les signaux doivent alors être corrigées pour les objets mesurés.
3.9 Après l'expérience
Jusqu'à présent, SSM basée électrophysiologie a été utilisé pour caractériser plus de 20 transporteurs, principalement d'origine procaryotes, par exemple MELB 3, 4 et NHAA PutP 5 (résumé dans 6). Mais aussi des transporteurs eucaryotes à partir membranes intracellulaires, par exemple ClC7 7 ainsi que les canaux ioniques, par exemple le récepteur nicotinique de l'acétylcholine 8 ont été étudiés.
Ici, nous présentons comme un exemple des mesures du sucre / H + cotransporter LacY d'Escherichia coli en utilisant protéoliposomes avec au moins 85% à droite sur orientée LacY à un LPR sur 5 9, 10. Nous nous concentrons sur les principales étapes menant à un modèle cinétique minimale de cette protéine de transport.
1. Caractérisation électrophysiologique de type sauvage LacY
La première étape est une caractérisation générale de la réaction électrogène par la mesure de différentes valeurs de pH ( > Figure 4), les concentrations de substrat (Figure 5) et de substrats. Pour valider la technique, les valeurs pK K M et donné dans la littérature ont été reproduites.
La dépendance au pH de LacY montre deux réactions différentes électrogènes. Le courant augmente couplage capacitif entre pH 5 et pH 8,5, mais aussi des changements de forme. Dans des conditions alcalines transport de l'état d'équilibre est observé, tandis que pour les valeurs de pH acide seulement une réaction rapide électrogène reste. Pour distinguer les signaux de l'état d'équilibre des réactions rapides électrogènes, nous avons utilisé l'analyse des circuits de reconstruire les courants de transporteur (Figure 6).
A un pH de 7 le signal monophasique devient biphasique. Cela indique également qu'il ya deux réactions différentes électrogènes. Estimée à partir de la charge transférée (intégrale des signaux), les deux réactions ont environ 6% et 94% de la electrogenicity totale du cycle de transport.
ove_step ". Affectation des réactions électrogènes> 2Pour attribuer les deux réactions électrogènes à des étapes particulières du cycle de réaction de dentelle, la variante LacY E325A a été mesurée (Figure 7). Cette variante ne montre échange lactose mais est insuffisante pour tous les modes de transport actifs, en raison de l'inhibition de la libération de protons. Le signal de E325A LacY représente un transitoire rapide et constante pour toutes les valeurs de pH mesurées. La forme et l'amplitude du signal est semblable au signal de type sauvage LacY dans des conditions acides. En outre, nous observons une petite phase négative après le pic de courant en baisse, ce qui est caractéristique pour les courants transitoires rapides mesurées dans les systèmes de couplage capacitif. Parce contraignant lactose et la libération n'est pas électrogène, le transitoire rapide doit être en corrélation avec une transition conformationnelle électrogène suite lactose contraignant.
On sait que l'étape de libération du proton est le taux limiting pour LacY chiffre d'affaires dans le gradient mode de transport axée sur la concentration en lactose. Dans ce cas, nous nous attendons à une augmentation de la vitesse de transport à pH alcalin, parce libération de protons est favorisée. C'est le cas pour le transport à l'état stable signal du type sauvage LacY corrélées. En outre, il a pu être démontré par la mesure de gradient de pH que seul le pH interne influe sur le transport à l'état stable de LacY (inédit). Par conséquent, la grande réaction électrogène pourrait être confiée à l'étape de libération de protons.
3. Mesures pour l'analyse cinétique
Après l'identification des réactions électrogènes sur et en dehors des tarifs de transport ont été déterminés en utilisant une configuration de SSM avec une haute résolution temporelle de l'ordre de 4,5 ms. Cela n'est possible que dans des conditions de réaction quand on domine le signal. Dans ce cas, les constantes de vitesse peuvent être obtenus à partir des courants transitoires à l'examen de la résolution temporelle des signaux en utilisant un processus itératif des moindres carrés de algorithme de convolution (Figure 8). Les constantes de vitesse déterminées ainsi que le modèle cinétique minimale proposée (Figure 9) a finalement été utilisées pour la simulation de la cinétique des transporteurs. Les courbes simulées reproduisent les données de SSM qui prouve en outre le modèle cinétique.
Figure 1. Adsorption géométrie des protéoliposomes sur la SSM. La SSM est formé sur une puce de capteur, une lame de verre d'or revêtue structurée. Pour mesurer les réactions électrogènes de protéines membranaires, protéoliposomes ou fragments de membranes sont adsorbées à la SSM. Les deux membranes constituent un système couplé de manière capacitive. C'est pourquoi seuls les courants transitoires sont détectés.
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Figure 2. Le MSS cuvette porte la puce de capteur et l'électrode de référence. La puce de capteur est prise en sandwich entre le fond de cuve et la tête de cuvette. L'électrode de référence est isolée de la voie d'écoulement par un pont salin sur gel de polyacrylamide.
Figure 3. Pathway fluide et le circuit électrique de l'installation de SSM. Dans le protocole d'échange de solution unique un non-activation (NA) et un activateur (A) solution sont nécessaires. Le flux est contrôlé par deux vannes 2 voies (V1) et une vanne de connexion (V2). Les interrupteurs de valves terminales entre les solutions non-activation et à activer, en dirigeant une des solutions à la cuvette et l'autre solution à un conteneur de déchets (W). La puce de capteur (SSM) est relié à l'amplificateur (E / G), tandis que l'électrode de référence (AgCl) est reliée au générateur de fonction (F) dans le circuit électrique extérieur. Un ordinateur (PC) et un boîtier d'interface sont utilisés pour le fonctionnement de la vanne et de l'acquisition des données.
Figure 4. Courants transitoires mesurés avec protéoliposomes Lacy type sauvage après 100 mm lactose concentration sauts à différentes valeurs de pH. L'solution non-activation contenait 100 mM de glucose tandis que la solution d'activation contient du lactose 100 mM. Toutes les solutions sont préparées dans du tampon phosphate de potassium 100 mM à pH indiqué avec 1 mM de DTT. Pour plus de détails sur les conditions de mesure dans ce domaine et les figures suivantes veuillez vous référer à 9 et 10.
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Figure 5. Des courants normalisée moyenne mesurée avec protéoliposomes Lacy type sauvage après des sauts de concentration en lactose à différentes concentrations et les valeurs de pH. Les valeurs K m sont obtenues à partir des crises hyperboliques.
Figure 6. Reconstruction des courants de transporteur. Les courants transitoires (A) utilisé pour reconstruire les courants de transporteur (B) ont été mesurées avec protéoliposomes Lacy type sauvage après 100 mm lactose concentration sauts à pH 8,5 (bleu trace) et pH 5,2 (trace rouge). À pH 8,5 chiffre d'affaires continue est observée alors à pH 5,2 une réaction rapide électrogène survient. Ceci est clairement observé dans le courant reconstruit (B).
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Figure 7. Courant transitoire mesurée avec E325A protéoliposomes Lacy après une mM lactose concentration saut 100 à pH 5,2. Cette variante LacY est inhibée dans l'étape de libération de protons du cycle de transport et donc le transport déficient. La petite composante négative observée est caractéristique de courants transitoires rapides mesurés dans les systèmes à couplage capacitif et est provoqué par la décharge de la capacité de la membrane après une réaction rapide électrogène. Son π0 constante de temps est déterminée par les capacités et les conductances du système (figure 1).
Figure 8. Courants transitoires mesurés avec protéoliposomes Lacy type sauvage AFTEr concentration différente sauts de lactose à pH 5,2. Dans ces conditions, aucune de transport à l'état stable est observée, mais une transition conformationnelle électrogène sur lactose contraignant. La ligne en pointillés montre la fonction de transfert représentant la résolution dans le temps du système. L'encart montre la détermination de la sur et en dehors des constantes de vitesse des kobs constantes de vitesse observées avec un ajustement hyperbolique aux données. La constante de vitesse observée a été déterminée à partir des courants transitoires avec un algorithme de déconvolution itératif des moindres carrés 10.
Figure 9. Un modèle cinétique pour le cycle de réaction de dentelle. Deux étapes électrogènes pourrait être identifiée et caractérisée par des mesures de SSM. Une réaction fortement électrogène représente ~ 94% du déplacement total de charge dans la réactionle cycle n'est observée que pour des valeurs de pH neutres et basiques. Il pourrait être confiée à l'étape de libération de protons (flèche bleue). Une étape faiblement électrogène est observée à pH acide lorsque le roulement continu de type sauvage LacY est inhibée. Nous avons attribué cette réaction à une transition conformationnelle électrogénique sur lactose liaison, qui représente 6% de la course totale de la charge dans le cycle de réaction.
1. Avantages de l'électrophysiologie SSM basée par rapport aux méthodes conventionnelles
Électrophysiologie SSM à base s'est avérée un outil précieux de la boîte à outils électrophysiologiques. Il est particulièrement utile dans les cas où la convention électrophysiologie, à savoir patch clamp et méthodes de serrage de tension, ne peut être appliqué: Mis à part quelques rares exceptions près transporteurs bactériens ne peuvent pas être étudiés en utilisant pince de tension ou de méthodes de patch-clamp en raison de la petite taille des bactéries et parce que ils sont difficiles à exprimer dans des cellules de mammifères ou des ovocytes. Mais aussi les transporteurs mammifères pertinentes peuvent être étudiés physiologiquement. Dans ce cas, l'électrophysiologie SSM basée est attractive pour les transporteurs de membranes intracellulaires et pour les applications de dépistage dans la découverte de médicaments en raison de sa robustesse et de son potentiel pour l'automatisation.
SSM-basedUsing électrophysiologie, le temps caractérisation conventionnelle résolu de transporters est difficile. Depuis le chiffre d'affaires des transporteurs est faible, un «correctif géant» ou une configuration «cellule entière» est nécessaire, qui ont une résolution intrinsèquement faible de temps dans une expérience d'échange de solution. La complication peut être surmonté en utilisant communiqué de substrat photolyse. Toutefois, seul un nombre limité de substrats sont adaptés à cette approche. Voici l'échange de solution rapide à la SSM offre l'opportunité unique de réaliser des études électrophysiologiques avec une haute résolution temporelle en utilisant des substrats arbitraires.
2. Limitations et les étapes critiques
Contrairement au patch-clamp et techniques de serrage de tension, l'électrophysiologie SSM à base ne peut pas être utilisé pour appliquer un potentiel. Caractérisation Transporter est donc limitée aux modes de transport qui ne reposent pas sur un potentiel de membrane.
En général, l'électrophysiologie SSM-fondé a aucune limitation concernant le type de transporteur (électrogène). Mais cl tensionamp ou un patch méthodes de serrage peut avoir des avantages, si les composants intracellulaires comme les protéines de liaison sont nécessaires pour la fonctionnalité des protéines.
Limitations peuvent survenir, si l'échange de solution crée des courants d'artefacts. Cela se produit lorsque le substrat interagit fortement avec la SSM comme dans le cas de composés lipophiles. contrôles d'artefacts peuvent être utilisés pour corriger les signaux mesurés. Fond de sel plus élevée dans tous les tampons de mesure peut être utilisée pour réduire les artefacts. Mais dans les cas où la taille de l'artefact est comparable au signal de la protéine, il est presque impossible d'isoler le signal associé à une protéine à partir de l'artefact. Heureusement, les artefacts sont élevés inhabituel dans un échange de solution optimisée.
Il ya quelques étapes qui sont essentielles pour la réalisation réussie d'une expérience électrophysiologie SSM basée. La préparation de l'échantillon de protéine est la partie la plus importante. Si protéoliposomes sont utilisés, s'assurer que les reconsprocessus de titution donne un échantillon reproductible propre d'un LPR suffisante et le transporteur est orienté dans le bon sens. Le LPR peut être vérifiée par microscopie électronique d'une fracture de gel et de l'orientation par une expérience ELISA si les anticorps sont disponibles.
Utilisez uniquement un SSM qui affiche les paramètres optimaux pour l'incubation de l'échantillon de protéine. L'injection de la protéine est une autre étape critique. Sonication est essentielle et les bulles d'air doit être évitée pendant l'injection. Après incubation de l'échantillon lui-même les mesures sont critiques, car les bulles d'air vont éliminer l'échantillon de la protéine adsorbée à partir de la puce de capteur. Il faut donc toujours éliminer les bulles d'air après le changement solutions. Néanmoins un aperçu du signal peut se produire. Pour corriger une possible diminution des effectifs du signal, il est indispensable de réaliser des contrôles dégradés au cours de l'expérience.
3. Systèmes spécialisés
Le SSM-configuration peut être modifiée en fonction de son application. En outre tici sont complètement différentes configurations hautement spécialisés disponibles.
Il ya la possibilité de mesurer des signaux de protéines dans des conditions asymétriques, par exemple sous un gradient de pH. Pour établir compositions tampons asymétriques à l'intérieur et à l'extérieur des protéoliposomes une troisième solution, la solution au repos, doit être introduite et cela nécessite une configuration à double échange. Ici une vanne trois voies supplémentaire de commutation entre les solutions non-activation et de repos sont nécessaires.
Pour augmenter la résolution temporelle du système que nous avons développé une voie de circulation alternatif manque la soupape de terminal, mais en utilisant un autre type de cuvette. Ici, la jonction de la solution d'activation et de non-activation se trouve à l'intérieur de la cuve, 3 mm en avant de la SSM. Cette configuration est bien adaptée pour l'analyse cinétique des processus de transport rapides. Il a pu être démontré qu'une résolution temporelle aussi bas que 2 msec est possible.
F CommercialUlly systèmes automatisés sont disponibles visant à un débit nettement plus élevé pour le criblage de médicaments. Une unité mobile recueille les solutions et les injecte sur la surface de capteur dans des plaques à 96 puits dans un format de plaque de microtitration standard.
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Nous remercions J. Garcia-Celma, je Smirnova et R. Kaback pour les contributions à des mesures Lacy et E. Bamberg pour le soutien et discussions utiles.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |
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