Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Résumé

Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.

Résumé

De nombreux agents pathogènes bactériens intracellulaires utiliser des protozoaires d'eau douce comme un réservoir naturel de la prolifération dans l'environnement. Legionella pneumophila, l'agent causal de la légionellose pneumonie, gagne un avantage sur les bactéries pathogènes cultivés in vitro lors de la première récolte de cellules de protozoaires avant l'infection des macrophages de mammifères. Ceci suggère que les facteurs de virulence importants peuvent ne pas être correctement exprimée in vitro. Nous avons développé un système souple pour l'amorçage L. pneumophila par son naturel protozoaire hôte Acanthamoeba castellanii avant l'infection de cellules de mammifères. La contribution d'un facteur de virulence peuvent être examinés en comparant la croissance intracellulaire d'une souche mutante de bactérie de type sauvage après l'amorçage protozoaire. Exprimant la GFP de type sauvage et mutant L. souches pneumophila sont utilisés pour infecter des monocouches de protozoaires dans une étape d'amorçage et a permis de franchir des étapes tardives de la croissance intracellulaire. Bactéries fluorescentes sont ensuite récoltées à partir de ces cellules infectées et normalisée par spectrophotométrie pour générer des nombres comparables de bactéries pour une infection ultérieure par les macrophages des mammifères. Pour la quantification, des bactéries vivantes sont surveillés après l'infection en utilisant la microscopie par fluorescence, cytométrie en flux, et par placage colonie. Cette technique met en évidence et repose sur la contribution de l'expression des gènes de la cellule hôte dépendant en imitant l'environnement qui seraient rencontrées dans un parcours d'acquisition naturelle. Cette approche peut être modifié pour tenir compte de toute bactérie qui utilise un hôte intermédiaire comme un moyen d'obtenir un avantage pathogène.

Introduction

De nombreux agents pathogènes bactériens ont adopté des stratégies généralisées pour exploiter les cellules hôtes pour la survie et la reproduction dans un compartiment intracellulaire. Dans de nombreux cas, les mécanismes pathogéniques sont similaires entre les protozoaires et les métazoaires cellules. Cependant, ces deux micro sont très différents et peuvent aboutir à l'expression différentielle des facteurs de virulence ^1-4. La légionellose bactérie Legionella pneumophila est ubiquitaire associés à des environnements d'eau douce dans le monde ^5. Surtout, L. pneumophila cultivé dans des cellules de protozoaires avant l'infection des monocytes humains obtenir un avantage pathogène, ce qui indique que les profils d'expression des gènes globales de la bactérie sortant d'une cellule de protozoaire est différente de celle de l'organisme cultivé in vitro en ^6-8. Dans la nature, les amibes d'eau douce constituent des nutriments riches limites pour l'amplification rapide d'une bactérie envahissante. Acquisition humaines de L. pneumophila est le plus souvent attribuée à l'inhalation de gouttelettes d'eau contaminées qui contiennent la bactérie. Il est probable que ces gouttelettes port protozoaires associées aux cellules des bactéries; où les cellules de protozoaires sont plus résistants aux pratiques conventionnelles de traitement de l'eau ^9,10. L'infection de macrophages alvéolaires pulmonaires produit d'une manière presque identique au cycle de vie intracellulaire de la bactérie dans les cellules hôtes protozoaires ^11-13.

Afin de survivre et se reproduire dans les cellules eucaryotes, L. pneumophila utilise un système de sécrétion de type spécialisé IVb appelé Dot / Icm de livrer près de 300 «effecteurs des protéines dans le cytosol de la cellule hôte ^14-16. Ces protéines effectrices collectivement fonctionner pour renverser les processus cellulaires afin de générer un compartiment de réplication permissive pour la bactérie ^17,18. Suppressions dans l'un des 26 gènes qui composent le résultat transporteur Dot / Icm dans des souches défectueuses pour mult intracellulaireiplication ^19-23. Historiquement, la suppression des différents gènes codant pour effectrices rarement abouti à des souches atténuées pour la croissance intracellulaire. Ce phénomène a été attribué à plusieurs hypothèses incluant la fonction de redondance et des copies paralogues des effecteurs.

Certains facteurs de virulence ne sont exprimés dans le contexte de la croissance intracellulaire de la cellule hôte associée ^24. Nous avons rationalisé que si un effecteur particulier a été exprimé que dans le contexte de l'infection protozoaire, la contribution de l'effecteur ne pouvait pas être comparée à une souche de type sauvage quand les deux ont été cultivées in vitro. L. pneumophila transitions d'une réplication à une phase de transmission en ce début de phase stationnaire dans la culture ^25. Le phénotype commutation de phase représente l'épuisement des nutriments rencontrée lors de la croissance intracellulaire et est illustrée à travers l'ensemble de flagelles pour la mobilité ^26. Parce que L. pneumophila est plus invasive et virulent lorsqu'il est récolté à partir des cellules de protozoaires, nous avons cherché à développer un test qui plus fidèlement représenté l'état pathogène de la bactérie quand il a rencontré macrophages de l'hôte.

À cette fin, nous avons développé un test d'amorçage protozoaire polyvalent qui peut accueillir n'importe quel hôte convenable pour les deux premiers (cellule d'amorçage) et deuxième infections scène (cellule cible). Le processus d'infection est traitable par l'utilisation de bactéries exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP). Le modèle d'infection pour le protozoaire castellanii Acanthamoeba suit une méthodologie largement utilisée dans le domaine ^27. Pour l'étape d'amorçage, L. pneumophila souches sont cultivées in vitro jusqu'à la phase stationnaire dans des milieux liquides pour produire portant la mention «transmetteurs» bactéries (figure 1A). Les bactéries sont ensuite utilisés pour infecter des monocouches de A. castellanii pendant 18 heures pour atteindre un stade tardif du cycle de vie intracellulaire. Grandes vacuoles contiennenttion des bactéries peuvent être visualisés à ce point dans le temps en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1A). Cellules sont ensuite lysées protozoaires et bactéries récupérées à partir du lysat sont mesurées pour l'émission à 512 nm en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence. La fluorescence est corrélée avec la densité optique de calculer la multiplicité de l'infection (MOI) pour l'infection de cellules cibles (figure 1, la courbe de corrélation *). H après l'invasion (T ₀₎ et 18 post-invasion (T _18), les cellules cibles sont quantifiés pour la fluorescence, ce qui représente des bactéries intracellulaires. La fluorescence peut être suivie en microscopie et cytométrie de flux, et les numérations viables peut être mesurée par placage colonie. Le test d'amorçage est toujours accompagnée par des infections de type sauvage avec L. pneumophila et une souche défectueux dans le système Dot / Icm de sécrétion de type IV (Δ DOTA) (figure 1A). Cela permet surtout de contrôle interne pour les comparaisons directes entre un type sauvagend des souches isogéniques mutantes utilisées dans le processus d'infection. L'inclusion de la souche virulente Δ Dota pendant la phase d'amorçage fixe un seuil pour l'observation des phénotypes de croissance atténués associés à isogéniques souches mutantes qui sont cultivées in vitro.

Protocole

1. Préparation des cultures de Legionella pneumophila pour les infections phase d'amorçage

1. Transformer tout L. pneumophila souches utilisées dans l'essai avec le plasmide pAM239, codant pour un isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductible protéine fluorescente verte (GFP) ^28. Strie sur les souches bactériennes de fer et de la cystéine complétée N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES) tamponné gélose à l'extrait de levure de charbon (CYEA) contenant 6,25 mg / ml de chloramphenicol (CM) (pour le maintien du plasmide) et incuber pendant 72 heures à 37 ° C.
2. Transférer un inoculum de la souche bactérienne en bouillon tamponné ACES complétées extrait de levure (AYE) avec 6,25 g / ml CM et 1 mM d'IPTG et cultiver jusqu'à la phase stationnaire (O / N) sur un agitateur orbital à 37 ° C.
3. Confirmer l'expression de la GFP dans les cultures in vitro en utilisant la microscopie à fluorescence. Transférer 10 ul de la culture sur une lame de verre sous un couvercleglissement et de l'image en utilisant un objectif 60x avec excitation GFP / cube d'émission (AMG EVOS fl).
4. Diluer une aliquote de 100 ul de chaque culture in vitro en utilisant stérile à 1:10 H ₂ O. Faites un blanc en utilisant 100 ul AYE médias avec 1 mM d'IPTG et 6,25 g / cm ml et l'eau. Prendre des mesures de DO600 les dilutions à l'aide d'un spectrophotomètre (Bio-Rad intelligente Spec Plus). Calculer le volume nécessaire pour infecter un bien à une MOI = 20 pour chaque culture in vitro: V = [(amibes tête de série) x MOI] / [OD ₆₀₀ x (facteur de dilution) x (constant)] = [(1 X 10 ⁶ ) x (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. Concentration des bactéries est déterminée comme _DO600 = 1,0 = 1 x 10 ⁹ UFC / ml.

2. Infection étape d'amorçage utilisant Acanthamoeba castellanii

1. Maintenir et cultiver les amibes en milieu ATCC PYG 712 en 175 cm ² flacons à température ambiante.
2. Remplacez le support en cul amibestures 24 hr avant de commencer les cultures bactériennes liquides. Le même jour, liquides cultures bactériennes sont démarrés, recueillir et compter les cellules sur un microscope optique à l'aide d'un hémocytomètre.
3. Diluer les amibes par du milieu frais à une concentration finale de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Semences plaques de 12 puits de culture cellulaire avec des aliquotes de 1 ml de la amibes à l'aide d'une pipette à répétition et incuber à température ambiante O / N.
4. Après incubation, laver les puits des plaques de 12 puits de culture cellulaire 3x avec 1 ml de PBS stérile à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et une aide pipette manuelle.
5. Après aspiration du PBS, ajouter 1 ml d'infection des médias (ATCC 712 médias PYG moins de glucose, peptone et l'extrait de levure) avec 1 mM d'IPTG et 6,25 pg / ml cm à chaque puits. Incuber les plaques à température ambiante pendant 1 heure.
6. Infect puits à une MOI = 20. Centrifuger la plaque à 400 xg pendant 5 min (Eppendorf 5810R) et flotter dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 5 min. Placer la plaque à un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 18 heures.
7. Confirmez les infections par imagerie des cellules vivantes sur un microscope à fluorescence avant d'accueillir la lyse des cellules et la récolte des bactéries.

3. Ensemencement des cellules THP-1 pour l'infection des cellules cibles étape

1. (Commencez ce processus 24 heures avant la mise en place des cultures bactériennes liquides). Cultiver cellules THP-1 dans des flacons de 75 cm ² à la culture quasi-confluence en milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum de sérum fœtal bovin (FBS).
2. Compter le nombre de cellules en suspension à l'aide d'un hémocytomètre, diluer les cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 avec 10% de FBS et 100 ng / ml de phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml , et la plaque en aliquotes de 1 ml sur des plaques 12 puits de culture cellulaire. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C, 5% de CO _2.

4. Traitement des bactéries de l'infection des cellules cibles après l'étape de la phase d'amorçage des infections

1. Aspirer les médias de la amibes désamorcée.
2. Lyse l'unmoebae en utilisant 500 ul de glace froide, stérile ultra-filtrée (UF) H ₂ O et incuber à température ambiante pendant 10 min.
3. La piscine de l'lysats selon la souche de type et de prendre une mesure _nm E ₅₁₂ pour chacun des lysats agrégées en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
4. Calculer _une DO600 de mesure pour les lysats communs: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - fond lysat) + 0.0019. La formule a déjà été déterminée en traçant une comparaison directe des deux la DO ₆₀₀ et les ₅₁₂ E _nm mesures de dilutions de L. pneumophila GFP de type sauvage exprimant phase stationnaire de la culture in vitro (Figure 1 *). Les lysats d'amibes non infecté, sous réserve des mêmes conditions expérimentales que l'amibe infectée, sont utilisés comme une vierge et a fourni une valeur de correction (fond lysat par exemple), qui a été incorporé dans l'équation. Le t volume nécessaireo infecter un bien à une MOI = 20 est calculé pour chaque pool lysat: V = [(THP-1 tête de série) x MOI] / [calcOD ₆₀₀ x (constant)] = [(1 X 10 ⁶⁾ x (20)] / [calcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = _20/600 calcOD.
5. Laver les cellules THP-1 3x avec du PBS et ajouter 1 ml de RPMI 1640 frais (10% de FBS) à chaque puits. Incuber les cellules THP-1 pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO _2.
6. Infecter les cellules THP-1 à l'aide de MOI calculé les lysats communs. Laisser un ensemble de puits pour se protéger du virus, servant de témoin négatif pour la cytométrie en flux. Traitement de la phase d'amorçage devrait être achevé en moins de 30 min. Les lysats sont conservés sur la glace pour limiter les changements dans l'expression génétique bactérienne avant l'infection.
7. Centrifuger la plaque, flottent à augmenter la température, et incuber comme dans la phase d'amorçage.
8. Une heure après l'infection, retirer le support par aspiration et laver les puits 3 fois avec du PBS pour éliminer les bactéries extracellulaires.
9. Ajouter 1 ml fréquencesh RPMI 1640 (10% de FBS) dans les puits et retourner la plaque dans l'incubateur. Le temps immédiatement après le remplacement de support sert à zéro le temps (T _0). Incuber les cellules THP-1 pour les 14-16 heures à 37 ° C, 5% de CO _2.

5. Analyse expérimentale

5,1 imagerie des cellules vivantes

L'image des puits infectés à l'aide d'un microscope à fluorescence (AMG EVOS fl) au grossissement 10x ou 20x (figures 1A-D). Les images peuvent être comparées qualitativement ou quantitativement pour déterminer les niveaux d'infection à la fois dans la phase d'amorçage et les infections cibles cellulaires scène.

5.2 La cytométrie en flux

1. Les pics d'émission des différentes infections peuvent être comparés par cytométrie en flux (BD FACS Calibur). Trypsiniser les infectés cellules THP-1 et doucement, lavez les puits en mélangeant dans du PBS avec une pipette.
2. Piscine des cellules par la souche de type dans 15 ml tubes Falcon et le culot à 1800 xg pendant 2min dans la centrifugeuse de table.
3. Suspendre les granules dans 1 ml de PBS et transférer à 1,5 ml microtubes.
4. Centrifuger les suspensions à 1.800 x g (Eppendorf 5424) et remettre en suspension les culots dans 1 ml de PBS. Si les suspensions obtenues sont très turbide (DO ₆₀₀ ≥ 1,0), ils doivent être dilués dans PBS supplémentaire (1:3) pour éviter le colmatage des lignes dans le cytomètre en flux.
5. Utilisez une filtration stérile PBS pour l'équilibrage du cytomètre de flux et pour les étapes de lavage entre les injections de l'échantillon. Tracer la dispersion vers l'avant / latérale de cellules cibles non infectées avant l'injection d'échantillons cibles cellulaires d'infection.
6. Recueillir 20.000 événements totales pour chaque condition en utilisant excitation à 488 nm laser et le canal FL1.
7. Populations cellulaires Porte post-capture d'exclure les cellules non infectées et de l'intensité de fluorescence parcelle dans un histogramme (FlowJo) (figure 1E).

5.3 placage UFC

1. O Examinez le rendementf infection par placage UFC de cellules récoltées pour la cytométrie en flux. Préparer des dilutions en série des échantillons dans ultrafiltrée H ₂ O à 10 ^-1, 10 ^-2, et 10 ^-3.
2. Planche 20 ul de chaque dilution sur 1/3 de la plaque CYEA avec 6,25 mg / ml CM.
3. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 72 heures.
4. Compter les colonies à l'aide d'un cure-dent et compteur de cellules.

Résultats

Un résultat typique pour le processus d'infection ensemble est présenté dans la figure 1. Vivez micrographies de fluorescence de cellules représentant des monocouches de A.castellanii infectées par le type sauvage L. pneumophila pendant la phase d'amorçage est illustré à la figure 1A. Une mesure réussie de l'étape d'amorçage conduirait à une population d'environ 90% des cellules hôtes contenant de grandes vacuoles peuplées par des bact...

Discussion

L'expression du gène bactérien est étroitement contrôlée par une combinaison de la progression du cycle de vie et en réponse à des signaux du micro-environnement environnant. Vacuolaires pathogènes comme L. pneumophila répondre à une multitude de dérivés de cellules hôtes indices quand compartimenté dans un phagosome. Comme un résultat collectif de l'épuisement des nutriments dans la cellule hôte, la bactérie compense en exprimant les facteurs nécessaires à une bonne diffusion dans u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes