Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Résumé

Le Ex vivo Modèle dual de la perfusion placentaire humaine recirculation peut être utilisée pour étudier le transfert des xénobiotiques et des nanoparticules à travers le placenta humain. Dans ce protocole vidéo, nous décrivons le matériel et les techniques nécessaires pour une exécution réussie d'une perfusion placentaire.

Résumé

Il ya le placenta humain décennies a été pensé pour être une barrière infranchissable entre la mère et l'enfant à naître. Cependant, la découverte d'anomalies congénitales induite par la thalidomide et de nombreuses études ultérieures ensuite prouvé le contraire. Aujourd'hui, plusieurs xénobiotiques nocifs comme la nicotine, l'héroïne, la méthadone ou de la drogue ainsi que des polluants environnementaux ont été décrits à surmonter cet obstacle. Avec l'utilisation croissante de la nanotechnologie, le placenta est susceptible d'entrer en contact avec de nouvelles nanoparticules soit accidentellement ou intentionnellement par l'exposition dans le cas des applications en nanomédecine potentiels. Les données de l'expérimentation animale ne peuvent être extrapolés à l'homme parce que le placenta est l'organe de mammifère spécifique à l'espèce la plus ^1. Par conséquent, l'ex vivo double recirculation de perfusion placentaire humaine, développé par Panigel et al. ² en 1967 et continuellement modifiée par Schneider et al., En 1972 ^3, peut servir comme un excellent modèle to étudier le transfert des xénobiotiques ou de particules.

Ici, nous nous concentrons sur la double ex vivo recirculation protocole de perfusion placentaire humaine et son développement ultérieur d'acquérir des résultats reproductibles.

Le placenta a été obtenu après consentement éclairé des mères issus de grossesses simples terme subissant une césarienne. Les vaisseaux du fœtus et de la mère d'un cotylédon intact ont été canules et perfusés au moins pendant cinq heures. En tant que particule de modèle de particules de polystyrène marquées par fluorescence avec des tailles de 80 et 500 nm de diamètre, ont été ajoutés au circuit maternelle. Les particules de 80 nm ont été capables de traverser la barrière placentaire et fournir un exemple parfait d'une substance qui est transférée à travers le placenta vers le foetus tandis que les particules de 500 nm ont été retenus dans le tissu placentaire ou circuit maternelle. Le modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo est l'un des rares modèles fournissent des informations fiables surle comportement de transport des xénobiotiques à une barrière tissulaire importante qui fournit des données pertinentes prédictifs et clinique.

Introduction

Le placenta est un organe complexe qui est responsable de l'échange de l'oxygène, du dioxyde de carbone, des nutriments et des déchets, et en même temps en mesure de garder les deux circuits sanguins de la mère et le foetus croissant séparées l'une de l'autre. En outre, il évite le rejet de l'enfant par le système immunitaire de la mère et sécrète des hormones pour maintenir la grossesse. La barrière cellulaire est formée par les cellules du cytotrophoblaste qui fusionnent et forment un véritable syncytium sans membranes cellulaires latérales ^4,5. L'ensemble du placenta est organisé en plusieurs cotylédons, qui contiennent un arbre villosités fœtales et représentent une unité fonctionnelle du placenta.

L'étude de la fonction de barrière placentaire a été intensifiée avec la découverte des malformations induites thalidomide dans les années 1960. Pour des raisons évidentes études de translocation avec les femmes enceintes ne peuvent pas être exécutées. Par conséquent, différents modèles alternatifs ont été développés ^6,7 . Le modèle concerné plus prometteurs et probablement le plus clinique est le modèle ex vivo placenta humain de perfusion développé par Panigel et collègues ^2,3.

Beaucoup de femmes sont exposées à des xénobiotiques tels que les médicaments ou les polluants de l'environnement au cours de leur grossesse ^8. Pour certains médicaments qui ont déjà été administrées régulièrement pendant la grossesse, des études in vivo peut être réalisée par comparaison de la concentration sanguine maternelle avec celle de sang de cordon ombilical. Cependant, il n'y a généralement que des informations limitées sur la pharmacocinétique et-dynamique chez le fœtus et la tératogénicité de ces substances.

Par exemple opiacés comme l'héroïne facilement traverser la barrière placentaire et peut conduire à une restriction de croissance intra-utérine, accouchement prématuré ou un avortement spontané ^9,10. Ainsi, en cas d'abstinence disparus pendant la grossesse un traitement de substitution à la méthadone est recommandée. L'exmodèle de perfusion placentaire humain in vivo a montré que le transfert de la méthadone dans la circulation foetale est négligeable ^11, ce qui correspond bien au-à-maternelle rapport calculé sang de cordon de concentration de sang après l'accouchement ^12.

La nanotechnologie est un domaine en pleine croissance notamment en médecine. Ainsi, sous le naturel fines (<2,5 m de diamètre) et les particules ultrafines (<0,1 m de diamètre) dans les fumées des feux de forêt, les éruptions volcaniques et dans la poussière du désert, l'exposition aux nanomatériaux manufacturés (au moins une dimension <0,1 um ¹³ ) est en augmentation. Cela a soulevé des questions sur le potentiel toxicologique des nanomatériaux manufacturés. Bien qu'aucun risque humain pourrait être encore prouvé, il ya des principales études expérimentales indiquent que les nanoparticules manufacturées peuvent provoquer des réactions biologiques néfastes conduisant à des résultats toxicologiques ^14. Récemment, certaines études ont montré que l'exposition prénatale à l'la pollution de l'air est liée à un besoin respiratoire supérieur et de l'inflammation des voies respiratoires chez les nouveau-nés et d'enfants ^15,16. En outre, les petites nanoparticules pourraient être utilisées comme vecteurs de médicaments pour traiter spécifiquement, soit le fœtus ou la mère. Par conséquent, il devient évident que des études approfondies des xénobiotiques ou des nanomatériaux distinctes et leur capacité à traverser la barrière placentaire sont nécessaires. Un aperçu réel sur les études en cours sur la perméabilité placentaire aux nanomatériaux manufacturés, est résumée dans Menezes et al. 2011 ¹⁷ et Buerki-Thurnherr et al. 2012 ^7.

Le double ex vivo recirculation modèle de perfusion placentaire humaine fournit un système contrôlé et fiable pour étudier le transport placentaire de divers endogènes et exogènes composés ^{3,11,12,18,19} et un large éventail d'autres fonctions du placenta comme mécanismes responsables de l' développement d'états pathologiques comme la pré-éclampsie ^{20-22. Dans ce protocole, nous nous concentrons principalement sur la mise en place, la manipulation et un procédé qui permet l'étude de l'accumulation, les effets et les taux de translocation d'un large éventail de xénobiotiques ou des nanoparticules.}

Protocole

1. Préparation du système de perfusion

1. Mettre en place le système de perfusion constitué d'un bain d'eau, une chambre de perfusion, deux colonnes pour l'oxygénation, deux pompes péristaltiques, deux pièges à bulles, deux appareils de chauffage de flux et un capteur de pression (figure 1). Connecter ces composants avec des sections des tubes sont constitués de matières de chlorure de polyvinyle et de silicones selon le schéma de la figure 2. Enfin, il ya deux circuits représentant le circuit du fœtus et de la mère, respectivement.
2. Allumer le bain d'eau, les chauffe-eau instantané et le chauffage de la chambre de perfusion. La température doit être 37 ° C.
3. Chauffer le milieu de perfusion (milieu de culture tissulaire NCTC-135 dilué 1:2 avec du tampon de Earle (6,8 g / chlorure de sodium de L, 0,4 g / l de chlorure de potassium, 0,14 g / L de phosphate monosodique, 0,2 g / l de sulfate de magnésium, 0,2 g / chlorure de calcium de l, 2 g / l de glucose) complété avec du glucose (1 g / L), le dextran 40 (10 g / L), de sérum-albumine bovine (10 g/ L), de l'héparine de sodium (2,500 UI / L), amoxicilline (250 mg / L) et de bicarbonate de sodium (2,2 g / l), pH 7,4) dans le bain d'eau.
4. Consécutivement rincer les systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d'eau distillée, b) de 50 ml d'hydroxyde de sodium à 1%, c) 1% d'acide phosphorique et d) à nouveau 200 ml d'eau distillée (débit: 15 - 20 ml / min).
5. Raccorder la canule foetal (Ø 1,2 mm; aiguille émoussée doit être attachée à un dispositif de perfusion à aiguille à ailettes modifié) au tube artériel foetal.
6. Rincer les systèmes artériels du circuit du fœtus et de la mère avec un milieu de perfusion jusqu'à ce que tous les tubes contiennent un milieu (débit: 15-20 ml / min). Au cours de cette étape de remplir les pièges à bulles et supprimer toutes les bulles en aval du piège. Puis arrêter les pompes. Il est vraiment important que les tubes artériels afférents sont toujours libres de bulles, sinon après cathétérisme surtout les vaisseaux fœtaux fines peuvent se rompre.
7. Allumer le flux de gaz. Le circuit maternelle est oxygéné wie 5% de dioxyde de carbone et de 95% d'air et le circuit de synthèse foetal avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d'azote.
8. Démarrer l'enregistrement du capteur de pression.

2. Cannulating le placenta

1. Obtenir placenta intact de grossesses sans complication terme après césarienne primaire. Le consentement écrit doit être donné (a été obtenue dans le cas de nos études) par les mères avant l'accouchement et l'étude doit être approuvé par le comité Éthique local (ce fut le cas dans nos études). Premier contrôle visuel doit être effectué par des sages-femmes pour assurer un placenta sain et intact.
2. Cannulation du placenta est une étape cruciale! Au cours de la perfusion toutes les petites perturbations dans les tissus peut conduire à une fuite entre la circulation maternelle et fœtale. Le placenta doit être obtenue dans les 30 minutes après l'accouchement.
3. Sélectionner un cotylédons intact dans la zone marginale du placenta sans perturbations visibles du côté maternel. Lors de la plaque chorionique,attacher les deux branches associées de l'artère et de la veine ombilicale en amont sur le côté de canulation tard (vers le cordon ombilical) à l'aide de matériel de suture chirurgicale. Assurez-vous toujours deux noeuds.
4. Cathétériser l'artère fœtale premier. Les artères placentaires fœtales sont toujours plus petits et plus minces que les veines.
5. Faire une suture autour de l'artère du foetus, mais ne pas l'attacher immédiatement. Tenir le récipient avec une pince, couper le navire soigneusement et mettre la petite canule (Ø 1,2 mm) dans l'artère. Puis attacher le fil de suture (deux nœuds).
6. Procéder à la veine du fœtus de la même manière mais utiliser une plus grande canule (Ø 1,5-1,8 mm; aiguille émoussée doit être attaché à un ensemble de perfusion à aiguille à ailettes modifié).
7. Mettez la pompe fœtale (2 ml / min). S'il n'y a pas de fuite visible et le sang émane de la canule dans la veine du fœtus, augmenter lentement le débit jusqu'à 4 ml / min. Observez la pression dans l'artère du fœtus, il ne devrait pas dépasser 70 mmHg. Si du liquide s'échappe au fœtus ou de matérne canule fixer avec un autre suture.
8. Placer le placenta sur le support de tissu avec la partie foetale et tirer la membrane placentaire et le tissu sur les pointes. A la fin du cotylédon perfusé doit être au milieu du trou dans le support de tissu.
9. Stabiliser la partie où seule la membrane détient le placenta avec une membrane de silicone (Ø 1 mm) ou bien deux morceaux de parafilm.
10. Assemblez le support de tissu complet, serrer les vis et couper le tissu en surplomb. Veuillez noter que le veineux et artériel canules ne sont pas coincés mais pondent dans les petits canaux du support de tissu.
11. Tourner le support de tissu à l'envers, la mettre dans la chambre d'irrigation et d'ajouter le couvercle. Maintenant, du côté maternel devrait être au top. Vérifiez toujours si le circuit du fœtus est encore intact et le milieu coule sur le tuyau de la veine du fœtus.
12. Mettez la pompe maternelle (12 ml / min). Présentez les trois émoussé canules (Ø 0,8 mm) à ee extrémité du tube de l'artère maternel dans l'espace intervilleuse en pénétrant dans la plaque déciduale. Pour ramener le liquide de perfusion dans le circuit de la mère mis un tube comme vidange veineuse qui est également connecté à la pompe de la mère à la position la plus basse dans la partie supérieure de la chambre de perfusion.
13. Branchez la canule dans la veine du fœtus au tube de veine fœtale.

3. L'exécution de la phase de pré-et expérimentale de perfusion

1. Pour permettre au tissu de se remettre de la période ischémique après l'accouchement et à débusquer le sang dans l'espace intervillous, une pré-phase ouverte de 20 min est nécessaire. Cela signifie que la veine maternelle et fœtale ne sont pas menant vers le réservoir artériel contenant le milieu de perfusion. Recueillir le drainage veineux du fœtus et de la mère dans une bouteille et la jeter après la pré-phase.
2. Pour évaluer l'intégrité de la perfusion effectuer un autre pré-phase de 20 min, mais dans un circuit fermé. Utilisez deux réservoirs séparés avec le milieu de perfusionpour le circuit du fœtus et de la mère et de fermer les circuits en menant le drainage veineux du fœtus retour dans le réservoir du fœtus et l'arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle.
3. Pour l'expérience de perfusion principale préparer deux flacons de 120 ml de milieu de perfusion (une pour la mère et l'autre pour le réservoir foetal). Ajouter le radiolabeled ¹⁴ C-antipyrine (4 nCi / ml; sert de contrôle positif; ATTENTION: substance radioactive) et le xénobiotiques ou nanoparticules marqué par fluorescence que l'on veut analyser le réservoir maternelle. Mélanger la perfusion maternelle bien.
4. Commencez l'expérience en échangeant le milieu de perfusion pur avec les deux flacons préparés (réservoirs du fœtus et de la mère). Fermez les circuits en menant le fœtus dos de drainage veineux dans le réservoir du fœtus et l'arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle.
5. Poursuivre la perfusion de 6 heures et de prendre régulièrement des échantillons. Remettre en suspension toujours le moyen de la maternelle et fœtaleréservoir avant le retrait.
6. Contrôler la pression dans l'artère fœtale (ne doit pas dépasser 70 mm Hg), le pH dans les deux circuits (qui devrait être dans une fourchette physiologique 7,2-7,4) et le volume de deux réservoirs (perte de volume du fœtus ne doit pas dépasser 4 ml / h) pendant la perfusion . Si nécessaire, ajuster le pH à l'aide soit de l'acide chlorhydrique ou de l'hydroxyde de sodium.
7. Si la perte de volume dans le réservoir du foetus est supérieure à 4 ml / h il ya une fuite dans le tissu et on doit arrêter la perfusion. Le taux de succès d'une perfusion pendant 6 heures sans fuite est d'environ 15-20%.
8. Arrêter la perfusion après 6 heures. Démouler les pompes, bain d'eau, chauffe-débit et des flux de gaz.
9. Retirer le placenta de son support de tissu, coupez le cotylédon perfusé (plus lumineux que le tissu unperfused) et peser.
10. Prélever des échantillons de unperfused (partie du placenta qui a été coupé au début, pourrait être déjà pris au cours de la phase de pré-) tissus et perfusé (chacun d'environ 1 g) et de les stocker à -20 ° Cjusqu'à ce que l'homogénéisation ou dans l'azote liquide pour analyse ultérieure. Fixer un autre échantillon de tissu à 4% de formol pour l'évaluation histopathologique. Les échantillons doivent inclure toutes les couches du placenta.
11. Nettoyer les tubes après la perfusion d'un rinçage successif des systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d'eau distillée, b) de 50 ml d'hydroxyde de sodium à 1%, c) ml 1% d'acide 50 phosphorique et d) à nouveau 200 ml d'eau distillée (débit: 15-20 ml / min).

L'ensemble de la procédure de travail de l'expérience de perfusion placenta est représenté sur la figure 3.

4. L'analyse des échantillons

1. Centrifuger les échantillons perfusât pendant 10 min à 800 xg avant analyse pour éliminer des érythrocytes résiduels. Prenez le surnageant pour l'analyse plus loin. Les échantillons peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Pour l'analyse de la production de leptine et l'hCG des échantillons peuvent être conservés à -20 ° C.
2. Pour évaluer la perméabilité de laplacenta analyser le ^C-14 antipyrine par scintillation liquide. Mélanger 300 pi des échantillons fœtaux et maternels avec 3 ml cocktail de scintillation et mesure pendant 5 minutes dans un compteur bêta.
3. Pour évaluer le transfert des nanoparticules fluorescentes ou des xénobiotiques d'intérêt lecture de la fluorescence à 485 nm d'excitation et 528 nm en émission d'un lecteur de microplaques (longueurs d'onde indiquées sont pour l'analyse de l'étiquette jaune vert que nous avons utilisé pour les nanoparticules).
4. Pour déterminer la viabilité du tissu placentaire pendant la mesure de la perfusion de la consommation du glucose et de la production de lactate dans le circuit foetal et maternel avec un système de gaz de sang automatisé. En outre, évaluer la production des hormones placentaires choriongonadotropin humaine (hCG) et la leptine dans les échantillons de tissus homogénéisés et les perfusats par dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Résultats

La figure 4A montre les profils de perfusion de petites particules de polystyrène (80 nm) qui ont été transportés à travers le placenta par rapport aux particules de polystyrène plus grand (500 nm) qui n'ont pas été transférés au compartiment fœtal. Chaque point de données représente la concentration moyenne des particules à l'instant donné d'au moins trois expériences indépendantes. Pour polystyrène nanoparticules le transfert placentaire est dépendant de la taille ^1...

Discussion

Sous la perfusion double recirculation montré ici, il ya plusieurs autres configurations expérimentales possibles en fonction de la question à laquelle il faut répondre. Perfusions placentaires particulièrement ouverts sont couramment utilisés pour évaluer la clairance du médicament à concentration stationnaire ^3. La perfusion de recirculation set-up peut être également appliqué à confirmer transport actif de substances endogènes ou exogènes. Par cette approche, la même concentration de xénob...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCTC-135 medium	ICN Biomedicals, Inc.	10-911-22C	could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich, Fluka	71381
Potassium chloride (KCl)	Hospital pharmacy		also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)	Merck	106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)	Sigma-Aldrich, Fluka	63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)	Merck	102388
D(+) Glucose (anhydrous)	Sigma-Aldrich, Fluka	49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	31389
Bovine serum albumin (BSA)	Applichem	A1391
Amoxicilline (Clamoxyl)	GlaxoSmithKline AG	2021101A
Sodium heparin	B. Braun Medical AG	3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets	Merck	106498	CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)	Merck	100573	CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2	PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2	PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)	American Radiolabeled Chemicals, Inc.	ARC 0108-50 μCi	CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)	Zinsser Analytic GmbH	1003100
Polystyrene particles 80 nm	Polyscience, Inc.	17150
Polystyrene particles 500 nm	Polyscience, Inc.	17152
EQUIPMENT
Water bath	VWR	462-7001
Thermostat	IKA-Werke GmbH Co. KG	3164000
Peristaltic pumps	Ismatec	ISM 833
Bubble traps (glass)	UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater	UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses	MSR Electronics GmbH	145B5
Notebook	Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator	Living Systems Instrumentation	LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)	Ismatec	MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)	Ismatec	SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)	Polymed Medical Center	03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)	Polymed Medical Center	03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)	Polymed Medical Center	03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)	Polymed Medical Center	03.952.82
Parafilm	VWR	291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)	Internal technical department		Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)	B. Braun Medical AG	C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)	Hospira, Inc.	ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)	B. Braun Medical AG	16494C
Surgical scissors	B. Braun Medical AG	BC304R
Dissecting scissors	B. Braun Medical AG	BC162R
Needle holder	B. Braun Medical AG	BM200R
Dissecting forceps	B. Braun Medical AG	BD215R
Automated blood gas system	Radiometer Medical ApS	ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader	BioTek	Synergy HT
Liquid scintillation analyzer	GMI, Inc.	Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml	Zinsser Analytic GmbH	3020001
Tissue Homogenizer	OMNI, Inc.	TH-220
pH meter + electrode	VWR	662-2779