Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë

Résumé

Les récepteurs tyrosine kinases sont exprimés de façon ectopique dans de nombreux cancers et ont été identifiés en tant que cibles thérapeutiques dans la leucémie aiguë. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë.

Résumé

Les récepteurs tyrosine kinases ont été impliquées dans le développement et la progression de nombreux cancers, y compris la leucémie et les tumeurs solides, et sont des cibles thérapeutiques druggable attractifs. Nous décrivons ici une stratégie efficace en quatre étapes pour l'évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) dans le traitement de la leucémie aiguë. Dans un premier temps, l'analyse western blot est utilisé pour confirmer l'inhibition de la cible dans les cellules leucémiques en culture. L'activité fonctionnelle est ensuite évaluée en utilisant des tests clonogéniques dans la méthylcellulose ou cultures agar mou. Composés expérimentaux qui montrent une activité dans des essais de culture de cellules sont évalués in vivo sur des souris NOD-SCID-gamma (NSG) des souris transplantées avec des lignées de cellules leucémiques humaines orthotopique. Vivo études initiales en pharmacodynamiques évaluer l'inhibition de la cible dans les explosions isolées leucémiques de la moelle osseuse. Cette approche est utilisée pour déterminer la dose et le schéma d'administration requis pour blocage cible efficaceion. Des études ultérieures évaluer l'efficacité de l'EGFR in vivo en utilisant des cellules exprimant la luciférase de la leucémie, permettant ainsi une surveillance non invasive de bioluminescence de la charge de la leucémie et de l'évaluation de la réponse thérapeutique à l'aide d'un système d'imagerie in vivo de la bioluminescence dans. Cette stratégie a été efficace pour l'évaluation des inhibiteurs de tyrosine kinase in vitro et in vivo et peut être appliquée pour l'identification d'agents moléculaires ciblés à fort potentiel thérapeutique ou pour une comparaison directe et la priorisation des composés multiples.

Introduction

Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les enfants ^1,2. Le taux de survie globale pour pédiatrique ALL lignée B (B-ALL) est d'environ 85%, mais les sous-types biologiques spécifiques, y compris T-ALL lignée (T-ALL), ont un pronostic plus pauvre encore, même avec les protocoles thérapeutiques actuels. Un traitement supplémentaire de rechute TOUT reste un défi ^3. Bien que la majorité des patients adultes atteints de leucémie aiguë atteindre une rémission avec la chimiothérapie à l'avance, de nombreux patients souffrent encore rechute ^4. Chimiothérapies actuelles dans le traitement de la leucémie aiguë sont connus pour causer des effets secondaires à court et à long terme la toxicité associée. Par conséquent, les traitements moins toxiques qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses avec un effet minimal sur les tissus normaux sont grandement nécessaires. Au cours des dernières années, l'accent a été mis sur le développement de nouveaux agents moléculaires ciblés avec une spécificité pour les cellules cancéreuses, souvent en utilisant la chimie itératifde générer des composés actifs multiples qui doivent ensuite être comparés et priorisés ^5. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation préclinique de TKIs pour le traitement de la leucémie aiguë, qui peut être utilisé pour l'évaluation d'un composé unique ou pour une comparaison directe de composés multiples, afin de faciliter le développement de médicaments.

La méthode présentée ici se compose de quatre étapes. Tout d'abord la substance biochimique (1) et anti-leucémie (2) les activités du composé (s) sont évalués dans une culture cellulaire, puis l'inhibition de la cible est confirmé dans des modèles animaux (3), et l'efficacité finalement thérapeutique du TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique (4). Pour ces études, il est important de choisir des lignées cellulaires compétentes, qui sont des représentants de sous-types biologiques les plus fréquemment utilisés. Les lignées cellulaires doivent être choisis, qui à la fois, exprimer la cible d'intérêt et n'ont pas la cible d'intérêt, afin de déterminer si les effets biologiques sont mediated par inhibition de la cible. Ceci est particulièrement pertinent pour le développement d'inhibiteurs de petites molécules, qui ont des effets hors cible qui peuvent être importantes pour l'activité anti-tumorale. Il est également nécessaire de choisir une lignée cellulaire qui est dépendante de la cible pour les effets fonctionnels tels que la prolifération ou la survie. Études de validation de cibles préliminaires (en dehors de la portée de cet article) en utilisant l'interférence ARN ou d'autres moyens spécifiques pour inhiber la cible peuvent être utilisés pour identifier des lignées de cellules cibles dépendant. Il est également souhaitable de choisir des lignées de cellules qui peuvent former des xénogreffes de souris, de telle sorte que les résultats de la culture de cellules peuvent être plus directement traduits à des expériences in vivo.

Pour l'évaluation de l'activité biochimique médiée par EGFR dans les cellules de la leucémie, une diminution de la phosphorylation du récepteur peut être utilisé comme un indicateur de l'inhibition de la cible. Analyse par Western blot ou ELISA dosages peuvent être employés, en fonction de la disponibilité et de la spécificité des anticorps.Si des anticorps ayant une spécificité suffisante pour que la cible sont disponibles, des tests ELISA sont préférables car ils sont plus efficaces et quantitative. Dans les cas où des anticorps ayant une spécificité suffisante pour le test ELISA ne sont pas disponibles, l'analyse western blot peut être nécessaire. Dans ce cas, l'immunoprécipitation d'une grande quantité de lysat peut être utile pour la détection des cibles qui sont en faible abondance. Cette approche est particulièrement pertinente pour la mesure de phospho-protéines, qui peuvent avoir une demi-vie courte pour permettre des changements rapides dans la signalisation en réponse à des stimuli environnementaux. Certaines protéines phosphorylées sont extrêmement labile, très probablement en raison de la formation de complexes avec des phosphatases. Pour la détection fiable et cohérente de ces protéines phosphorylées, il peut également être possible de traiter les cellules avec pervanadate, un inhibiteur de protéine tyrosine phosphatase irréversible ^6, pour stabiliser la protéine phospho-avant pour la préparation de lysats de cellules entières.

Àdéterminer si l'activité biochimique se traduit par des effets anti-tumoraux, des processus biologiques dépendant de cibles peuvent être contrôlés dans les expériences à base de cellules. Pour les lignées cellulaires de leucémie, activité anti-leucémie induite par TKI peut être évaluée en utilisant des dosages de formation de colonies en méthylcellulose effectuées sur gélose molle ou ^7. L'agar mou peut être préféré car il s'agit d'un milieu solide qui se prête mieux à une manipulation répétée si le traitement avec un TKI est nécessaire. Alors que de nombreux leucémie myloid (AML) lignées cellulaires aigus seront former des colonies en agar mou, la plupart des toutes les lignées cellulaires seront seulement forment des colonies dans de la méthylcellulose, qui est un milieu semi-solide. Bien qu'il soit possible de rafraîchir moyen et / ou EGFR dans des cultures de méthylcellulose, seuls de petits volumes peuvent être utilisés et avec une fréquence limitée. De même, il est plus difficile pour colorer les colonies sans les perturber dans la méthylcellulose. Des études préliminaires doivent définir la capacité des lignées cellulaires appropriées pour former des colonies dans de la méthylcellulose et / ou de l'agar mou et til densité optimale des cellules en culture de telle sorte que les colonies ne se chevauchent pas et en nombre suffisant pour obtenir des données statistiquement pertinentes (généralement 50-200 colonies par 35 mm plaque).

Bien que des essais in vitro sont robustes et rentables, et ont des implications éthiques de moins que les expérimentations animales entières, l'avancement de composés thérapeutiques nécessite une preuve de l'efficacité et de la sécurité dans des modèles animaux. Pour les études in vivo, les lignées cellulaires de la leucémie aiguë humains peuvent être transplantées dans orthotopiquement NOD.Cg-PRKDC ^scid je l2rg ^tm1Wjl / SZJ des souris (NSG) et ITK peuvent être facilement administrés par injection ou par gavage oral. Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter l'exposition de souris NSG à une faible dose de ligne cellulaire dépendante de rayonnement afin de xénogreffes d'établir, et dans ce cas les souris ne peuvent pas tolérer gavage oral sans une période de récupération de 5-10 jours post-irradiation. Ce manuscrit décrit la génération de B-ALL et T-ALL xénogreffes aidedes lignées cellulaires spécifiques (697) et Jurkat comme exemples, mais peut être créé, des xénogreffes chez des souris NSG utilisant une grande variété de lignées cellulaires. Dans le cas où d'autres lignées cellulaires sont plus applicables, l'obligation pour l'irradiation, le nombre optimal de cellules de greffe, et le moment d'apparition et de progression de la maladie doit être déterminée expérimentalement. Idéalement, ces modèles auront pénétrance complète (tous les animaux transplantés développe une leucémie), la cinétique cohérentes (leucémie progresse de manière similaire chez tous les animaux), et une fenêtre de traitement raisonnable (idéalement 20 à 30 jours entre le début du traitement et le retrait de l'étude en raison d'une maladie) . Le nombre de cellules transplantées peut être augmentée afin d'améliorer la cohérence et la pénétrance cinétique ou réduite afin d'améliorer la fenêtre de traitement si nécessaire.

Pour déterminer si l'inhibition de EGFR médiation cible in vivo, les échantillons sont collectés à partir de souris atteintes de leucémie xénogreffes après traitement par TKI ou le véhicule seul. Idéalement, la dose d'und schéma d'administration pour ces expériences sont guidés par des études pharmacocinétiques, qui peuvent souvent être réalisées par des laboratoires commerciaux et sont en dehors du champ d'application de cet article. Si les données pharmacocinétiques sont disponibles, la concentration du composé nécessaire pour une inhibition efficace de la cible dans une culture de cellules et la concentration sérique maximale après une dose unique de TKI peut être utilisé pour définir une dose de départ pour des études sur les animaux. Les études pharmacocinétiques peuvent également informer le calendrier de la collecte de l'échantillon de post-traitement pour les études pharmacodynamiques et la voie d'administration. L'inhibition de la cible peut être évaluée dans n'importe quel organe affecté, mais les tissus qui sont le plus facilement collectées et traitées sont préférables. Des lignées cellulaires de leucémie plus aigus établir dans le foie, la moelle osseuse, de la rate, du sang périphérique et du système nerveux central, bien que les organes spécifiques touchés et la mesure de la prise de greffe dans ces organes varient selon les modèles. Le protocole présenté ici évalue phosphinhibition o-protéine dans la moelle osseuse en utilisant une analyse Western blot, mais les organes solides peuvent être plus faciles à récolter constamment et nécessitent peu ou pas de traitement avant la congélation, ce qui permet moins de possibilités pour la dégradation de phospho-protéines pendant la collecte et le traitement des échantillons. L'immunohistochimie peut être utilisée pour évaluer des tumeurs ou des organes affectés par la leucémie solides.

Enfin, l'efficacité thérapeutique de la TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique. Pour ces études, le moment de l'initiation du traitement peut varier, de sorte que la maladie est plus ou moins établi. Le traitement peut commencer immédiatement après la transplantation pour les études initiales et ensuite être retardé dans des études ultérieures jusqu'à ce que la charge de morbidité importante est détectée de rapprocher plus étroitement un modèle de traitement de diagnostic. Idéalement, ces modèles animaux ont également la capacité pour la mesure non invasive de la charge de la maladie. Nous avons optimisé les méthodes pour l'introduction de la lucifer luciolease gène dans des lignées cellulaires de leucémie à l'aide de particules de type virus, ce qui permet, à l'analyse non-invasive longitudinal de l'apparition et de la progression et de l'évaluation de la charge de la maladie de la moelle osseuse et les organes solides maladie. Cruciale de cette approche est l'utilisation de lignées de cellules de luciférase monoclonaux marqués pour éviter la variabilité dans le développement de la leucémie exprimant la luciférase lié à l'utilisation de lignées cellulaires polyclonales et est sans rapport avec le traitement par un ITK ^8.

Prises ensemble, ces mesures peuvent être utilisées pour l'évaluation d'un seul TKI ou pour une comparaison directe et le classement de plusieurs ITK. Bien que les protocoles présentés ici se concentrent sur le développement de ITK, ces méthodes peuvent être adaptées à d'autres objectifs et considérations pour le développement de tests sont décrits. Ainsi, cette stratégie peut être plus largement applicable à l'évaluation pré-clinique d'agents moléculaires ciblées pour le traitement de la leucémie aiguë.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont suivi les normes réglementaires approuvées par l'Université de comité de protection et d'utilisation des animaux Colorado. Le protocole a été approuvé par démontré l'Université de comité de protection et d'utilisation des animaux Colorado.

Une. Phospho-protéine Western Blot

1. Préparation des lysats
   1. des lignées cellulaires de culture exprimant le récepteur tyrosine kinase d'intérêt. Récupération des cellules et la plaque 3-5 x 10 ⁶ cellules / échantillon dans 400 pi de milieu de croissance dans une boîte de culture tissulaire à 48 puits. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant 2-3 heures.
   2. Ajouter 100 ul de solution 5x TKI dans un milieu de croissance et laisser incuber pendant 60 min.
   3. Préparer le tampon de lyse avec de l'HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glycerol, 1% (v / v) de Triton X-100, et les inhibiteurs de protéase. Si les cultures ne seront pas traités avec pervanadate avant la récolte, ajouter des inhibiteurs de phosphatase (de orthova 1 mM de sodiumnadate et 0,1 mM de molybdate de sodium) à un tampon de lyse.
   4. Préparer pervanadate (PV) solution de l'inhibiteur de la phosphatase, immédiatement avant utilisation. Préparer une solution à 0,3% de peroxyde d'hydrogène (ATTENTION) dans une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube sombre sur la glace (1:100 dilution d'une solution mère à 30%). Faire bouillir une aliquote de 0,2 M orthovanadate de sodium (OV, ATTENTION) solution mère pendant 5 min. Diluer à 1:10 dans du PBS pour obtenir une solution 20 mM de OV à la température ambiante (RT). Mélanger 0,3% de peroxyde d'hydrogène et de 20 mM OV 01:01 et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 min.
   5. Diluer PV en milieu complet (60 pi PV + 940 moyen pi). Ajouter 100 pi de PV dilué / bien. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant 3 minutes, puis placez la plaque sur la glace.
   6. Récolter les cellules dans des tubes de microcentrifugation à froid à 2500 rpm pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 120 ul de tampon de lyse. Incuber sur de la glace pendant 15 min. Clarifier le lysat dans une micro-froid à 6000 rpm pendant 3 min. Transfert supernatant dans un nouveau tube froid. Conserver à -80 ° C.
2. Immunoprécipitation
   1. Centrifuger les billes de protéine G sépharose à centrifuger à 1000 rpm pendant 1 min. Retirer le surnageant et laver perles 2x avec 1 ml de PBS froid. Ajouter un volume égal de PBS pour faire une bouillie de 50%. Ajouter l'anticorps primaire et 20 ul de 50% des perles de protéine G pour chaque échantillon. Incuber pendant 2 heures - O / N à 4 ° C sur un agitateur.
   2. Pulse bas perles dans une micro-froid à 9000 tours par minute. Retirer le surnageant et laver perles 2x avec 150 pi de tampon de lyse froid. Spin dans centrifuger à froid à 1000 rpm pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 20 ul d'échantillon 2X SDS tampon avec le 2-mercaptoéthanol (ATTENTION). Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.
   3. Échantillons de faire bouillir pendant 5 min et course sur un gel de tris-glycine SDS-PAGE. Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose et de détecter les phospho-protéine par transfert de Western.
   4. Rincer blot à l'eau puis incuber à 2% de SDS, Tris 62,5 mM (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoéthanol (ATTENTION) pendant 30 min à 50 ° C. Rincer avec de l'eau 2x, puis laver à 60-90 min à 5-6 changements de TBS-T pour éliminer la solution de décapage.
   5. Détecter la protéine totale par western blot.

2. Méthylcellulose Assay

1. Aliquote de 4 ml de milieu de base humaine méthylcellulose dans 50 ml tubes coniques à l'aide d'une aiguille émoussée grand alésage final stérile. (Remarque:. Méthylcellulose peut être aliquote et stocké à -20 ° C. Décongeler à RT O / N avant de l'utiliser)
2. Ajouter 500 pl de 10x TKI ou un véhicule dans un milieu de croissance à 4 ml de la méthylcellulose et de mélange au vortex pendant 10 s.
3. La récolte des cellules et de comptage. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de croissance à une concentration qui est 10 fois supérieure à la concentration cellulaire finale. Ajouter 500 pi de suspension cellulaire à mélange de méthylcellulose. Vortex pendant 10 secondes et laisser reposer pendant 10 min pour éliminer les bulles.
4. Dresser 4 ml de mélange de méthylcellulose en utilisant une seringue de 5 ml et stérile large portait aiguille extrémité émoussée. Éviter de tirer des bulles. Distribuer 1 ml du mélange de méthylcellulose dans le centre de trois 35 mm des plaques de culture de tissus. Agiter les plats jusqu'à ce que le fond est entièrement recouvert de méthylcellulose.
5. Pour chaque plaque de la méthylcellulose, de préparer une plaque de culture tissulaire stériles de 10 cm avec deux 35 mm des plaques de culture de tissus supplémentaires remplis avec de l'eau stérile afin d'assurer un environnement humide. Placer les cultures dans l'incubateur à chemise d'eau à 37 ° C dans 5% _de CO2 pendant 10 à 14 jours.
6. Compter les colonies après 1-2 semaines. Colonies devraient être plus de 20 cellules et ne se chevauchent pas. Les colonies peuvent être comptées en utilisant un microscope inversé équipé d'une platine de microscope avec une grille ou à l'aide d'un compteur de colonies automatisé. Changements dans la taille de la colonie ou la morphologie de réponse au traitement par TKI doivent également être évalués. Pour améliorer la détection de compteur de colonies, les colonies de coloration en ajoutant de 60 à 100 ul de (3 - (4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium bromure solution (MTT, 5 mg / ml en H ₂ O, conserver à -20 ° C, protéger de la lumière, ATTENTION) goutte à goutte sur la surface de chaque plaque et incuber pendant 8 heures à 37 ° C dans 5% de CO _2.

3. Agar mou Assay

1. Préparer agar noble de 1% pour la couche inférieure, noble agar 0,7% pour la couche supérieure et 2x milieu de croissance. Équilibrer un milieu de croissance 2x dans un bain d'eau à 42 °. Chauffer 1% et noble 0,7% de gélose dans un micro-ondes (environ 1 min/100 ml) et s'équilibrer dans un bain d'eau à 42 ° C. Mélanger des parties égales de 1% d'agar et 2x moyen et séparément 0,7% d'agar et 2x moyen dans 50 ml Coniques. Régime de 10 ml de mélange / plaque de six puits agar mou pour chaque couche.
2. Étiquette à 6 puits des plaques de culture tissulaire. Remplir chaque puits avec 1,5 ml de 1% mélange agar mou. Éviter les bulles pendant le placage. Plaques sèches avec des couvercles hors de hotte stérile pendant 30 min.
3. Compter les cellules. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de croissance à une concentration, qui est 500x plus élevée que la concentrati cellulaire finalesur. Ajouter la suspension de cellules au mélange de l'agar à 0,7%, bien mélanger et distribuer 1,5 ml du mélange de cellules sur de la gélose au sommet de la couche d'agar à 1%. Laissez la couche supérieure solidifier pendant 30 min.
4. Préparer un milieu de croissance contenant 1x TKI ou de contrôle du véhicule. Ajouter 2 ml de milieu avec la concentration désirée de TKI sur le dessus de la couche supérieure de gélose.
5. Incuber les cultures pendant 10 jours à 37 ° C dans 5% de CO _2. Retirer et remplacer le milieu recouvrant tous les 3 jours.
6. Lorsque les colonies sont visibles à l'œil nu, moyen d'aspiration recouvrant et ajouter une solution de bleu nitro-tétrazolium 200 pi (1 mg / ml de NBT en H ₂ O, conserver à 4 ° C, protéger de la lumière, ATTENTION). Retour à l'incubateur pendant 24-48 h. Déplacer à 4 ° C pendant au moins 2 heures avant le comptage. Souillé plaques peuvent être stockées à 4 ° C pendant un mois. Compter les colonies à l'aide d'un microscope ou un compteur de colonies automatisé.

4. Evaluation de Phospho-protéine Inhibition in vivo

1. Recueillir caunes de plus en plus en phase de journal par centrifugation dans une centrifugeuse de dessus de table à 1500 rpm pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS stérile et remettre en suspension dans du PBS à une concentration appropriée (typiquement 1 à 5 x 10 ⁷ cellules / ml). cellules de la transplantation dans un volume de 100 ul dans 6-12 semaines vieilles souris NSG par injection intraveineuse dans la veine de la queue en utilisant un 28 G seringue à insuline. Placez l'animal dans un dispositif de retenue, faire chauffer la queue dans un bécher d'eau chaude pour dilater les veines, et nettoyer la queue avec un tampon de chlorhexidine avant l'injection. Après l'injection, appliquer une pression au site d'injection à l'aide de gaze stérile jusqu'à ce que le saignement cesse. Transplantés au moins 3 animaux / groupe. Maintenir la souris sur l'eau contenant 1 mg / ml de sulfate de gentamycine.
2. Quatorze jours après la transplantation, traiter les animaux avec TKI ou véhicule seulement et des échantillons de récolte pour l'analyse de l'inhibition de la cible. Peser les animaux et traiter avec une dose appropriée (mg / kg de poids corporel) de TKI ou véhicule. Administrer un traitement dans un volume de 5 ml / kg de poids corporel par voie intrapéritonéale (ip) ou par injection de 10 ml / kg de poids corporel par gavage oral. Pour injection ip, retenir la souris manuellement et injecter dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen avec une aiguille 29 G. Pour gavage oral, retenir la souris à la main et tenir l'animal debout. Placer le tube de gavage dans la bouche sur la langue et à l'arrière de la bouche. Appliquez une légère pression pour passer le tube dans l'œsophage et dans l'estomac. Appuyez sur le piston de la seringue pour administrer un traitement. Si le plongeur ne déprime pas facilement l'aiguille de gavage doit être enlevé et repositionné. Préparer des formulations TKI immédiatement avant utilisation.
3. Si le traitement pervanadate est souhaitée, préparer une solution de PV 20 min avant la récolte, comme décrit ci-dessus (étape 1.1.4) et diluer dans un milieu avec 1 uM ^MgCl2 et 100 U / ml de DNase (120 pi PV + 880 pl de milieu). Remarque: PV est stable pendant au moins 1 heure après dilution.
4. Sacrifier des animaux en CO ₂ narcose à l'aptemps (s) de propriées de post-traitement. Disséquer fémurs en enlevant la fourrure, la peau et les muscles de la jambe entière de sorte que les os sont complètement exposés. Retirez les fémurs par clipsage de dissection ciseaux juste en dessous de l'articulation de la hanche et de nouveau au-dessus de l'articulation du genou. Transfert à une boîte de Pétri et rincer la moelle osseuse avec 1 ml de PBS froid ou solution PV dilué aide d'une seringue et d'une aiguille 27 G. Si le traitement avec PV, incuber à la température ambiante dans l'obscurité pendant 10 min.
5. Préparer lysats et analyser les niveaux de phospho-protéine et protéine totale, comme indiqué ci-dessus (étapes 1.1.6-1.2.5).
6. Quantifier phospho-protéine relative et les niveaux de protéine totale pour chaque échantillon en utilisant la densitométrie. Calculer phospho-protein/total-protein par rapport à la valeur moyenne de phospho-protein/total-protein pour les animaux traités avec le véhicule.

5. Evaluation de l'activité anti-leucémique de TKI dans tous les modèles de xénogreffes

1. Si nécessaire, exposer des souris à 200 cGy de rayonnement dans un irradiateur de RS-2000 prio un jourr à la transplantation. Transplant souris avec des lignées cellulaires de leucémie, comme décrit ci-dessus (étape 4.1). Greffe au moins 6 souris par groupe. Identifiez-souris à l'oreille poinçon. Alternativement, un marqueur noir peut être utilisé pour identifier des souris avec des hachures sur leurs queues. Ajouter enrichissement de cages pour réduire le risque d'agression cage de compagnon au cours de l'étude.
2. Traiter les souris avec un TKI ou véhicule uniquement comme décrit ci-dessus (étape 4.2). Surveillance de l'état de santé de souris quotidiennement par examen physique et la détermination du poids. Symptômes prévus de leucémie (diminution du niveau d'activité, la perte de poids, paralysie des membres postérieurs, et les infections oculaires). La perte de poids de plus de 10% à 15% est généralement associée à la mort de la souris dans les deux jours et est généralement un critère de substitution en cas de décès, conformément aux exigences du IACUC standard.
3. Surveillance de la prise de greffe et le développement de la leucémie par une bioluminescence in vivo système d'imagerie jusqu'à 2x par semaine. Préparer une solution stock de D-luciférine 200x (30 mg / ml) dans sterile l'eau. Mélanger doucement par retournement jusqu'à ce que D-luciférine est complètement dissous. Utiliser immédiatement ou aliquote et le gel à -20 ° C. Avant l'imagerie in vivo en utilisant un système d'imagerie par bioluminescence dans, refroidir les parties aliquotes de D-luciférine à la température ambiante et diluée à 1:2 dans du PBS à une concentration finale de 15 mg / ml et stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 um.
4. Anesthésier la souris avant l'imagerie avec 1,5% d'isoflurane dans de l'oxygène inhalé. Surveillance de l'anesthésie suffisante, caractérisé par la relaxation musculaire, perte de mouvement, et la perte de la réponse à la stimulation orteil-pincement.
5. Immédiatement avant l'imagerie, l'administration de 150 mg / kg de poids corporel D-luciférine par injection intrapéritonéale (10 ul de 15 mg / ml de luciférine / g de poids corporel).
6. Utilisez un système d'imagerie par bioluminescence in vivo pour capturer 2 série d'images séquentielles avec 30, 60 et 90 expositions sec et une image finale avec une exposition de 120 secondes. Après l'exposition, le retour des souris dans des cages et surveiller pour la récupération de l'anesthésie. En fonction de l'intensité de bioluminescence, des temps d'exposition peuvent varier. Temps d'exposition optimales doivent être prédéterminés pour un modèle donné et maintenir la cohérence de telle sorte que les intensités de signal pour les points de temps individuelles sont comparables dans l'ensemble de l'étude.
7. Déterminer l'intensité de la bioluminescence pour chaque souris en utilisant l'image vivante de 3,2 acquisition et d'analyse des logiciels. Déterminer le total des valeurs de flux mesurées en photons / seconde en dessinant des régions d'intérêt (ROI) de taille identique sur chaque souris.
8. Sacrifier les souris par le CO ₂ et l'exposition dislocation cervicale si moribond, présentant une paralysie, dans le cas de plus de 15% de perte de poids, ou à la fin de l'étude. Disséquer les souris et les observations d'enregistrement (par exemple l'élargissement de noeuds rate, le foie, ou lymphatiques; pâle moelle osseuse). Disséquer fémurs et rincer la moelle osseuse avec du PBS froid à l'aide d'une aiguille 27 G.
9. Recueillir les cellules dans une microcentrifugeuse à 2500 rpm pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans du PBS contenant 2% de FBS et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.Recueillir les cellules et tache avec 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole, 1:1000) et conjugué à du FITC α-hCD45 (1:100) ou IgG de souris de contrôle ₁ isotype (1:100) . Évaluer la leucémie greffe par cytométrie de flux. Porte sur la population viable (DAPI négatif) et déterminer le pourcentage de CD45 + cellules blastes (% de la moelle osseuse).

Résultats

Les analyses présentées ici d'évaluer les effets biochimiques et fonctionnelles à médiation par EGFR et peuvent être utilisées pour classer les nouveaux composés basés sur le degré d'inhibition de la cible in vitro et in vivo, la réduction de la formation de colonies, et le retard dans leucémogénèse chez la souris NSG transplantées avec la luciférase- marqué les cellules leucémiques.

analyse par immunotransfert a été utilisée pour déterminer l'inhib...

Discussion

Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation de nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinase dans le traitement de la leucémie aiguë. En utilisant cette approche, les activités biochimiques et anti-leucémie sont évaluées en premier dans les tests cellulaires in vitro et dans des modèles de xénogreffe in vivo. analyse par immunotransfert a été utilisée avec succès pour démontrer l'inhibition de la tyrosine kinase cible dans des cellules de leucémie après traitement a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00