Contextuelles et Cued conditionnement de la peur de test en utilisant un système d'analyse de la vidéo chez des souris

Résumé

Cet article présente un protocole pour un test de conditionnement peur contextuelle et indicé l'aide d'un système vidéo d'analyse pour évaluer l'apprentissage peur et la mémoire chez la souris.

Résumé

Le test contextuelle et indicé conditionné peur est l'un des tests de comportement qui évalue la capacité des souris à apprendre et à mémoriser une association entre les signaux environnementaux et les expériences aversives. Dans ce test, les souris sont placées dans une chambre de conditionnement et sont donnés rognures d'un stimulus conditionné (un signal auditif) et un stimulus inconditionnel aversif (un choc électrique électrique). Après un temps de retard, les souris sont exposées à la même chambre de conditionnement et une chambre de forme différente avec la présentation du signal auditif. Le comportement de congélation pendant l'essai est mesurée comme un indice de la mémoire de la peur. Pour analyser le comportement automatique, nous avons développé un système d'analyse vidéo en utilisant le logiciel d'application ImageFZ, qui est disponible en téléchargement gratuit à http://www.mouse-phenotype.org/. Ici, pour afficher les détails de notre protocole, nous démontrons notre procédure d'essai contextuelle et de conditionnement de la peur repérée chez la souris C57BL/6J utilisant le syst ImageFZem. En outre, nous avons validé notre protocole et la performance du système d'analyse vidéo en comparant temps de congélation mesurée par le système de ImageFZ ou un système de mesure informatique basé photobeam-avec celui marqué par un observateur humain. Comme on le voit dans les résultats représentatifs, les données obtenues par ImageFZ étaient similaires à ceux qui sont analysés par un observateur humain, ce qui indique que l'analyse du comportement à l'aide du système de ImageFZ est très fiable. L'article de film fournit des informations détaillées concernant les procédures de test et de promouvoir la compréhension de la situation expérimentale.

Introduction

Le test contextuelle et indicé conditionné peur est le paradigme comportemental utilisé pour évaluer la peur associatif apprentissage et la mémoire chez les rongeurs ^1-3. Ce test a été largement utilisée pour comprendre les mécanismes neurobiologiques de l'apprentissage de la peur et de la mémoire dans transgéniques et des souris knockout ^1,4-16. Le comportement de congélation, qui est définie comme l'immobilité complète à l'exception de la respiration, est une réponse commune à des situations terribles. Dans ce paradigme comportemental, après les animaux sont exposés à un couplage d'un signal auditif avec un choc électrique électrique, ils répondent à la stimulation de la production de la peur en affichant un comportement de congélation, qui est mesurée par un indice de l'apprentissage associatif de la peur et de la mémoire. Ce test nécessite un équipement moins élaboré, moins l'effort physique par l'enquêteur, et beaucoup moins de temps de formation pour les souris que d'autres tâches d'apprentissage et de mémoire, il nécessite généralement d'environ 5-10 min / jour par souris pendant 2 jours. Bien que la procédure de test est SImple et nécessite peu de temps pour effectuer, le chercheur doit observer attentivement et de mesurer le comportement de la souris, par conséquent, plusieurs systèmes de mesure automatisés ont été développés pour effectuer l'analyse comportementale ^17-20. Notre système de vidéo-analyse, que nous avons développé avec le logiciel de ImageFZ, nous permet d'analyser facilement le comportement de congélation et de produire des résultats très fiables. Cet article fournit des informations détaillées sur notre procédure de test et explique comment utiliser le logiciel de ImageFZ.

Protocole

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément aux directives et protocoles établis par les Comités soin et l'utilisation des animaux locaux.

Une. Appareil Cadre

1. L'appareil pour le test de conditionnement et de contexte est une chambre carrée, avec un plancher grillagé électrifiable, une source sonore, et un générateur de choc calibré. Différentes tailles de chambre sont utilisées, avec des dimensions variant de 54 cm x 27 cm x 30 cm ²¹ à 25 cm x 35 cm x 30 cm ^22. Dans ce protocole, l'appareil se compose d'une chambre carrée acrylique (33 cm x 25 cm x 28 cm; transparente dans les parois avant et arrière; blanc dans les parois latérales) avec des grilles métalliques (0,2 cm de diamètre, espacés de 0,5 cm d'intervalle) couverte par un couvercle transparent acrylique (Figure 1A). Il est nécessaire de placer la chambre à un étage acrylique blanc (figure 1B) pour analyser le comportement de souris noir brun, agouti, ou diluer car un système d'analyse d'image avec le jeprogramme mageFZ logiciel (disponible en téléchargement gratuit, voir le tableau des matériaux / réactifs) distingue un sujet sombre d'un fond blanc dans chaque image vidéo capturée. Souris albinos peuvent également être testées en utilisant des grilles métalliques noires et un plancher acrylique noir (figure 1B). Diode électroluminescente (DEL) sont fixés au plafond au-dessus de l'appareil. Le plancher de la grille est éclairée à 100 lux par les lumières LED. Un haut-parleur relié à un générateur de bruit / tonalité du blanc (figure 1C) est monté sur un plafond de 5 cm au-dessus du couvercle de présenter un signal auditif (un bruit blanc, 55 dB) comme un stimulus conditionné (CS). Les grilles sont câblés à un générateur de choc (figure 1C) pour délivrer un choc électrique électrique que le stimulus inconditionnel (États-Unis). La chambre d'essai est placé dans une salle insonorisée (170 cm x 210 cm x 200 cm) (figure 1D) pour minimiser le bruit externe pendant les essais. Cette condition empêche également les souris qui ne sont pas actuellement soumis à unetester d'entendre un signal auditif ou la vocalisation de souris d'essai.
2. Appareil pour l'essai indicé est composé d'une chambre qui présente des propriétés différentes de la chambre de conditionnement, en fournissant un nouveau contexte. Il est impératif de changer les signaux sensoriels autant que possible, de sorte que la souris perçoit le contexte roman comme étant sans rapport avec la chambre de conditionnement. Généralement, une boîte de forme différente ou une chambre triangulaire est utilisé. En outre, l'éclairage et / ou olfactifs différents signaux sont aussi fournis à la souris. Dans ce protocole, l'appareil est une chambre triangulaire acrylique (33 cm x 29 cm x 32 cm; blancs dans chaque paroi latérale) avec un plancher plat blanc pour les souris marron noir, agouti, ou diluer ou un plat, le sol noir pour albinos souris, recouverte d'un couvercle en acrylique transparent (figure 1E). LED sont fixés au plafond au-dessus de l'appareil. Le niveau de l'étage d'éclairage est fixé à 30 lux. Un haut-parleur est monté sur le plafond de 5 cm au-dessus du couvercle de prESENT un signal auditif qui est le même que celui qui est prévu à la souris au moment du conditionnement. La chambre triangulaire est situé dans une autre pièce insonorisée à partir de la pièce dans laquelle le conditionnement et l'essai de contexte sont effectuées.
3. Chaque chambre est équipée d'une charge montée au plafond Coupled Device (CCD) se connecter à un ordinateur Windows via quad répartiteur vidéo et USB dispositif de capture d'image à surveiller le comportement de la souris, et des images de l'appareil et la souris sont capturés et analysés par le logiciel d'application ImageFZ programme (voir protocole n ° 6). Le bruit blanc et footshock générateurs sont contrôlés automatiquement par le logiciel de ImageFZ; l'heure de début et la durée du bruit blanc et choc électrique doivent être écrites dans un fichier texte (voir un fichier texte de l'échantillon «simple-cond montré dans la vidéo pour la de détails sur la façon dont les paramètres sont écrits dans le fichier), qui est lu dans l'application.
4. Avant chaque essai commence, les murs acryliqueset les planchers sont essuyés avec une serviette trempée dans l'eau hypochloreux super (pH 6-7), et les grilles sont nettoyées avec 70% d'éthanol pour éviter un biais sur la base de signaux olfactifs. Les grilles sont essuyés avec de l'éthanol à la place de l'eau ultra hypochloreux faire en sorte que les grilles ne diminuent leur conductivité électrique due à la rouille.

2. Préparation des animaux

1. En général deux à quatre souris sont logés par cage dans une pièce de maintien à température contrôlée (23 ± 2 ° C) avec un 12 h cycle lumière / obscurité (par exemple lumières sur à 7h00).
2. Dans ce protocole, afin de réduire les influences possibles de transport de la cage sur le comportement et d'adapter les souris à l'environnement expérimental, les cages contenant les souris sont transférés de la salle de détention des animaux dans une salle d'attente insonorisées adjacente à une salle d'essai insonorisée au moins 30 min avant le début de chaque épreuve.
3. Toutes les expériences (figure 2A) doit être effectuée au cours des spériode ame à la lumière ou de la phase sombre chaque jour pour minimiser les variations comportementales produites par l'essai à différents moments ^23,24. Dans ce protocole, toutes les expériences sont menées entre 1 heure après le début de la phase légère et 1 heure avant le début de la phase d'obscurité (8:00 AM à 18:00 dans la phase légère). Si un seul appareil est disponible, les souris de chaque génotype doivent être testées dans un ordre contrebalancé pour réduire les effets potentiels de la durée de l'essai et l'ordonnance de dépistage des sujets sur la performance comportementale. ImageFZ peut contrôler un maximum de 4 appareils. Test 4 souris en utilisant simultanément 4 appareils dans un ordre contrebalancé permet au chercheur de gagner du temps et réduit les effets possibles des paramètres expérimentaux sur le comportement de la souris.

3. Conditionnement

1. Les souris sont placées dans la chambre de conditionnement, et les souris sont habituellement autorisés à explorer librement la chambre pendant 120 secondes. Par la suite, la fillecue ditory, comme un bruit blanc, le ton, et clicker auditif, est présenté comme un CS pendant 30 secondes, et un choc électrique 0,1-0,8 mA est donnée aux souris comme un américain au cours des 2 dernières secondes du son. La présentation de l'éplucher CS-US est répété pour renforcer l'association. Les souris sont laissés dans la chambre pour une longueur de temps après la dernière présentation pour continuer à établir le lien entre le contexte de la chambre et de l'expérience d'aversion. Dans ce protocole, après 120 secondes de l'exploration libre, un signal auditif (bruit blanc, 55 dB) est présenté pendant 30 secondes, et un choc électrique de 0,3 mA est délivré de manière continue au cours des 2 dernières secondes du bruit blanc. Après 90 secondes, le jumelage de la queue auditif avec le choc électrique est donnée aux sujets de nouveau. La présentation de CS-US répète trois fois par session (120, 240, et 360 s après le début du conditionnement) (Figure 2B). Après la footshock finale, les souris sont laissés au repos dans les chambres de 90 sec.
2. Avant le début de la session de conditionnement, exécutez le programme de logiciel d'application ImageFZ, sélectionnez le menu plug-in 'FZ conditionné et FZ ligne (4 chambre) ", et définir les valeurs des paramètres, étape par étape comme suit.
   1. Étape 1: Identification du projet. Spécifiez un dossier où vous souhaitez stocker vos fichiers de données.
   2. Étape 2: Nom de la session. Tapez les mots, par exemple, la date expérimental, dans la case 'Session', et sélectionner un fichier texte de référence dans laquelle l'heure de début et la durée du bruit blanc et footshock sont écrites, dans la case «Référence». Un fichier texte d'exemple est montré dans la vidéo.
   3. Étape 3: Réglage des paramètres. Entrez les valeurs des paramètres dans chaque case comme suit.
      1. Taux (images / seconde): taux d'acquisition d'image de cadre, par exemple, 1 image / sec.
      2. Durée (s): dans le cas de la climatisation, la durée totale est de 480 secondes.
      3. Bin durée (en secondes): par exemple 60 secondes, les données sont analysées dans chaque blocde 60 sec.
      4. La taille du sujet - min (pixels): ImageFZ détecte une souris et le bruit que des particules noires (certaines de masse de pixels) dans un fond blanc dans chaque image. Lorsque la zone de la particule noire (pixels) est inférieure à la 'taille Objet - min (pixels)' valeur (par exemple 100 pixels), les particules sont considérées comme du bruit et sont exclus de l'analyse d'image.
      5. La taille du sujet - max (pixels): lorsque la taille des particules noires sont plus que la taille de la «taille Objet - max (pixels) 'valeur, les particules sont exclus de l'analyse.
      6. Taille de l'image - largeur / hauteur (cm): chambre dimension, soit 33 cm de large et 25 cm de haut.
      7. Critère (pixels) de congélation: par exemple 30 pixels, voir les détails dans le Protocole 6.
      8. Durée de congélation - min (s): par exemple 2 secondes, si aucun mouvement de la souris est détectée pour seulement moins de 2 secondes, son comportement n'est pas considéré comme «gel»;.
      9. taux de choc (images / seconde): voir les détails dans le Protocole 6.
   4. Étape 4: Objet ID. Entrez l'identification de l'objet.
   5. Étape 5: Réglages de l'appareil. Réglez la luminosité et le contraste de l'image capturée.
   6. Étape 6: Paramètres de seuil. Réglez les valeurs de seuil pour détecter une souris noire comme des pixels noirs dans un fond blanc dans chaque image et de juger le comportement de la souris comme «gel» ou «non-gel» (voir les détails dans le protocole no 6). Pour analyser une souris albinos, cliquez sur la case «mode inverti», et d'ajuster les valeurs de seuil appropriée.
   7. Étape 7: Ensemble Cage Field. Spécifiez le domaine de chaque chambre que vous souhaitez capturer. Après avoir cliqué sur le bouton rectangle dans la boîte à outils, dessinez un rectangle autour de la piste de la chambre sur la fenêtre de l'image en direct. Ensuite, sélectionnez le nombre de chambre et cliquez sur le bouton "Set". Enfin, cliquez sur le bouton "Terminer".
3. Après les réglages des paramètres sont définis, un test préparatoire devrait être donnée en utilisant des souris de pratique (souris ne sont pas utilisés en tant que sujets) avant la première épreuve de la journée afin de déterminer si le système d'analyse d'image et blanc générateurs de bruit / choc fonctionnent sans problèmes.
4. Déplacer une cage d'accueil contenant des souris pratiques pour la salle de test insonorisés de la salle d'attente adjacente, et placer chaque souris dans la chambre de conditionnement. Immédiatement après avoir placé la souris dans la chambre, cliquez sur le bouton de démarrage de ImageFZ. Le logiciel d'application présentera signaux auditifs et / ou footshocks électriques pour les souris dans l'ordre que vous spécifiez dans un fichier de référence.
5. Après 480 secondes s'est écoulée, retournez les souris dans leur cage et retourner la cage à l'étagère dans la salle d'attente.
6. Nettoyez soigneusement les chambres. Ensuite, cliquez sur le bouton 'Suivant l'analyse de, et répétez les étapes 3.2.4-3.6 pour souris d'essai.
7. magasins de ImageFZ vivent et oligo-images au format TIFF. Le programme permetnous effectuons une analyse hors-ligne pour réanalyser les images en utilisant les valeurs des paramètres modifiés. Si vous effectuez une analyse hors connexion, sélectionnez le plug-in menu "conditionnement de la peur et FZ Hors ligne" et sélectionnez le dossier de données que vous voulez réanalyser. Par la suite, entrer les valeurs des paramètres de nouveau, et cliquez sur le bouton "Terminer".

4. Contexte test

1. Après la séance de conditionnement a été achevée, les souris sont retournés à la même chambre de conditionnement et marqué pour la congélation comportement pour mesurer la peur contexte conditionné (test de contexte). Un intervalle de temps entre le conditionnement et l'essai de contexte a été généralement fixé à 24 h. Dans ce protocole, afin d'évaluer la mémoire récente et la mémoire à distance (mesurée par le test un jour et plus de 28 jours après le conditionnement, respectivement) ^25, les souris sont soumises à l'épreuve de contexte d'environ 24 heures et 30 jours après la session de conditionnement. Les souris sont placées dans la condchambre itioning et sont autorisés à explorer librement la chambre pour 300 sec sans présentations CS et des États-Unis (figure 2C).
2. Exécutez le logiciel de ImageFZ et définir les valeurs des paramètres du logiciel d'application dans la même manière que dans le conditionnement (voir section 3.2.3), mais modifier le temps de la durée de ce test à 300 secondes et sélectionnez un fichier de texte de référence pour le test de contexte . Après avoir changé le réglage, un test préparatoire devrait être donnée en utilisant des souris de pratique pour vérifier le système de ImageFZ.
3. Placez chaque souris dans la chambre de conditionnement et cliquez sur le bouton de démarrage. Après 300 secondes s'est écoulée, retournez les souris dans leur cage, et de laisser la cage intact jusqu'au début de l'essai indicé.
4. Nettoyer les chambres. Ensuite, cliquez sur le bouton 'Suivant l'analyse de, et répétez les étapes 4.3 à 4.4 chez les souris de test.

5. Essai indicé

1. Essai indicé est effectuée le jour même de l'épreuve de contexte ou le lendemain.Dans ce test, les souris sont placées dans une autre chambre de test avec des propriétés très différentes, en fournissant un nouveau contexte qui n'est pas lié à la chambre de conditionnement pendant 3 min. A la fin de la première 3 min, le signal auditif qui est présentée au moment de conditionnement est donné à des souris pendant 3 min dans le milieu de contexte roman. Dans ce protocole, essai indicé est effectuée quelques heures après le test de contexte. Les souris sont autorisés à explorer la chambre triangulaire pour 360 sec. Dans la 3 premières minutes, ni CS ni des États-Unis est présenté, et par la suite, un CS (dB de bruit blanc 55) est présenté pour les 3 dernières minutes.
2. Exécutez le logiciel de ImageFZ et définir les valeurs des paramètres de la même manière que dans le conditionnement, à l'exception de modifier le temps de la durée de l'essai à 360 sec et sélectionnez un fichier de texte de référence pour le test indicé. Après le réglage effectué, un test préparatoire devrait être donnée en utilisant des souris de pratique pour vérifier le système de ImageFZ.
3. Placez chaque souris dans la chambre triangulaire et cliquez sur le départbouton. Après 360 secondes s'est écoulée, retournez les souris dans leur cage et retourner la cage sur le plateau de la salle d'attente.
4. Nettoyer les chambres. Ensuite, cliquez sur le bouton 'Suivant l'analyse »et répétez les étapes 5.3 à 5.4 chez les souris de test.
5. Pour tester mémoire supplémentaire à distance, répétez les Protocoles 4-5 environ 30 jours après la session de conditionnement (figure 2A).

6. Analyse de l'image

1. Effectuer l'acquisition et l'analyse des données automatiquement en utilisant ImageFZ. Ce logiciel d'application est basé sur le programme du domaine public ImageJ (développé par Wayne Rasband aux Instituts nationaux de la santé et disponible à http://rsb.info.nih.gov/ij/), modifié par Tsuyoshi Miyakawa (logiciel d'application de ImageFZ , disponible en téléchargement gratuit, voir le tableau des matériaux / réactifs).
2. Pour toutes les expériences, de capturer des images à un taux donné de cadre (par exemple 1 fps) avec ImageFZ aide d'un dispositif de capture vidéo USB, y compris uneune caméra vidéo. Pour mesurer la distance parcourue à partir des images consécutives, ajuster la valeur du programme (par exemple 80 pixels), qui est fixé à segmenter les images en une particule noire (une souris) et un fond blanc les «seuils» min. La distance parcourue est calculée à partir de la distance entre chaque jeu de coordonnées xy pour le centre de gravité de la particule dans les images consécutives.
3. Pour mesurer le comportement de congélation des images consécutives, régler le «seuil min (xor)« valeur du programme (par exemple 160 pixels), qui est fixé à segmenter les images en une particule noir (de la souris) et le fond, et ensuite calculer la quantité de surface (pixels) de régions ne se chevauchent pas entre les particules de chaque paire d'images consécutives. Réglez la valeur à l'aide du curseur de l'outil de seuil jusqu'à ce que la particule noir dans chaque image correspond à la forme de l'ensemble du corps de la souris à l'exclusion de la queue. Si la zone de la nonoverlarégion pping est inférieure à la valeur de «critère de congélation» (par exemple 30 pixels), le comportement est considéré comme «gel» (figure 3), qui est généralement définie comme l'absence totale de tout mouvement, sauf pour la respiration et le rythme cardiaque. Lorsque la zone est supérieure à cette valeur, le comportement est considéré comme «non-gel" (Figure 3). Le jugement devrait être fait sur la base de la définition de la congélation. Souris présentent parfois un mouvement subtil et une immobilité momentanée, qui pourrait ne pas être considéré comme un comportement gel qui reflète la peur. L'immobilité qui dure pendant un temps court (par exemple moins de 2 secondes), ce qui est probablement différente de la manifestation de la peur, peut être exclue de l'analyse en réglant le seuil de temps de congélation. Pour définir le seuil de temps, l'entrée «durée de congélation - min (s) 'valeur (par exemple 2 secondes).
4. Le programme automatique de calcul ImageFZAtes la distance parcourue (cm) et le pourcentage de gel. Les résultats sont enregistrés dans des fichiers texte, et vivent et oligo images sont stockées dans un format TIFF. Pour mesurer la distance parcourue (cm) comme un indice de sensibilité de choc électrique électrique, le programme de ImageFZ acquiert également des images à une cadence élevée (par exemple 4 fps) pendant 6 secondes, mesurée à partir de 2 secondes avant la délivrance d'un choc électrique 2 sec jusqu'à 2 s après choc électrique lors de l'analyse en ligne. Pour définir le taux de trame pour la capture d'image, avant, pendant et choc électrique, saisissez une valeur dans le «taux de choc (images / seconde)" boîte après. Après l'analyse en ligne, effectuer des analyses hors ligne en sélectionnant un plug-in menu 'FZ choc Hors ligne »pour obtenir les données relatives à la distance parcourue.
5. Les valeurs des paramètres du programme de ImageFZ doivent être optimisés pour obtenir des résultats semblables à ceux obtenus par des observateurs humains dans des essais préparatoires. Pour marquer d'emploi, le comportement de congélation est mesurée en continu en utilisant un Stopwatch et un programme cas d'enregistrement ou d'une procédure d'échantillonnage instantané temps chaque 3-10 secondes, lors de l'analyse en utilisant un logiciel de ImageFZ. Deux observateurs effectuent généralement l'observation du comportement. Pour régler les valeurs des paramètres du programme de ImageFZ pour s'assurer que les résultats de l'analyse d'image sont conformes à ceux des observateurs des droits, effectuer une analyse hors ligne du programme de ImageFZ, modifier le «seuil min (xor)» et les valeurs «critère de congélation» . Pour effectuer l'analyse en ligne, sélectionnez le menu plug-in 'FZ Hors ligne "et l'entrée des valeurs de paramètres.

7. Dépannage

1. Comment le programme de ImageFZ peut être obtenu et installé?
   Le programme ImageFZ est disponible en téléchargement gratuit sur notre site (voir le tableau des matériaux / réactifs), et fonctionne sur un ordinateur Windows. Télécharger le dossier de fermeture éclair pour ImageFZ et installer le logiciel sur votre ordinateur. Voir l''readme.txt' fichier pour la INSTALLATIONsur les détails et suivez les instructions étape-par-étape.
2. Pourquoi le message d'erreur "périphérique de capture de réglage d'erreur» s'affiche?
   Vérifiez la connexion du câble de la caméra et l'installation du pilote de l'appareil de capture d'image USB. S'il n'ya pas de problème avec les paramètres, le logiciel de ImageFZ pourrait ne pas fonctionner avec votre périphérique de capture d'image. Voir l''readme.txt' dossier concernant le dispositif approprié d'utiliser avec le logiciel de ImageFZ.
3. ImageFZ ne peut pas détecter le corps entier de la souris comme une particule.
   Définissez la valeur de «seuil min» et / ou «seuil min (xor) 'inférieure à la valeur actuelle. Si ImageFZ ne peut pas détecter la souris dans un endroit spécifique, par exemple le coin d'une chambre de test, puis les conditions de test sont insuffisantes, comme un sol éclairé de façon uniforme ou une différence légèrement contrastées entre la souris et l'arrière-plan, peuvent exister. Pour résoudre ce problème, réglez les valeurs de paramètres (par exemple, luminosité et le contraste de l'image et les valeurs seuils en direct) de ImageFZ, contrôler le nombre et la position des lumières, ou utiliser un fond blanc pour une souris noire.
4. Capture d'image à une cadence élevée ralentit l'ordinateur lors de l'analyse en ligne.
   Réglez le taux de trame à une valeur inférieure au taux actuel, et d'effectuer des analyses en ligne. L'analyse de ImageFZ, grâce à l'acquisition d'une image au fps, est suffisant pour mesurer avec précision le gel, comme indiqué dans la section des résultats représentatifs.
5. Les résultats de l'analyse de ImageFZ ne concordent pas avec ceux de la notation humain.
   Examinez l'image stockée et les fichiers de résultats de jugement. Si ImageFZ surestime le gel, régler le «critère gel» à une valeur inférieure à la valeur actuelle, et effectuer des analyses hors ligne. Si ImageFZ sous-estime la congélation, réglez le «critère gel» à une valeur supérieure à la valeur actuelle.
6. Dans optogenetical et in vivo e électrophysiologiqueXperiments, le câble de fibre fixée à la tête de la souris interfère avec l'arrêt de la congélation.
   Enduire les câbles en blanc pour une souris noire, et changer la position et l'angle de la caméra jusqu'à ce que les câbles ne sont pas détectés.
7. Que faut-il pour l'analyse hors-ligne?
   Créez un dossier nommé 'Image_FZ' dans le répertoire racine du programme de ImageFZ. Dans ce dossier, créez des Images »les sous-dossiers et les« Sessions ». Déplacer une image d'échelle de gris de 8 bits pour le dossier "Images, et créer un fichier texte dans lequel le nom du fichier de l'image est écrit dans le dossier 'Sessions. Ensuite, exécutez l'analyse en ligne ImageFZ, et suivez les instructions du programme.

Résultats

Dans le test conditionnement de la peur, les expérimentateurs humains utilisés pour quantifier le comportement de congélation par une main-d'œuvre observation directe ^26-29, mais la mesure de l'ordinateur récemment fondée photobeam (par exemple le système "Gel Monitor ') et d'analyse d'image des systèmes ont été utilisés pour automatiquement mesurer le comportement de congélation ^26,30-32. ImageFZ est un système d'analyse d'image automatisée, qui produit des résultats comparables à ceux obtenus par l'observation humaine, comme décrit ci-dessous. Ici, nous avons comparé les résultats de l'observation humaine avec ceux de l'analyse ImageFZ sous divers paramètres: 'Taux (images / seconde) »et« critère de congélation (pixels). Dans cette expérience, cinq souris C57BL/6J mâles (poids corporel moyen ± SD (g), 31,4 ± 3,55; la taille moyenne du corps ± SD (pixels), 351,6 ± 62,2) ont été utilisés à 15-27 semaines d'âge. L'observation a été faite humaine en utilisant un programme d'enregistrement d'événement (un programme de logiciel Macintosh OS 9), un événement de touche de pressage qui continuentd pendant 2 secondes ou plus lorsque la souris affiché un combat sans mouvement était considéré comme «gel». Le pourcentage de gel a été calculé toutes les 60 secondes dans chaque test et utilisé pour les analyses de corrélation. Le pour cent de congélation marqué par les deux observateurs (fiabilité interobservateur, de conditionnement, r = 0,879; pour le test de contexte, r = 0,957; pour le test indicé, r = 0,866, pour tous les cas, r = 0,888) a été en moyenne de générer un humain marquer. Les corrélations entre les pourcentages de gel mesurées par ImageFZ à chaque frame rate (soit 1, 2, et 4 fps) et ceux obtenus par des observations humaines ont été examinées. Comme l'illustre la figure 4, les pourcentages de gel calculées par ImageFZ (1, 2, et 4 fps) étaient fortement corrélées avec la valeur moyenne obtenue à partir des mesures des deux observateurs. Notamment, la capture d'images à une cadence plus élevée ne produit pas toujours la meilleure corrélation. L'analyse d'image à 1 ips généré des résultats similaires à ceux obtenus par les observateurs des droits de l'etest ach. Les corrélations entre les pourcentages de gel mesurées par des observations humaines et en utilisant ImageFZ dans chaque condition de les «critère de congélation (pixels)» (soit 20, 30, et 40 pixels) ont été examinés. Les pourcentages de gel calculés en utilisant ImageFZ au «critère de congélation (pixels)» de 20, 30, et 40 pixels ont été, dans tous les cas, fortement corrélés avec ceux obtenus par des observations humaines (Figure 5). Comme le montre la figure 5D, lorsque le critère de congélation est réglé sur une valeur faible, le mouvement subtil d'une souris, considéré comme «gel» par des observateurs humains, serait considéré comme «non-gel 'aide ImageFZ. Inversement, si le critère est réglé sur une valeur élevée, le mouvement de la souris, a marqué comme «non-gel» par des observateurs humains, serait considéré comme «gel» en utilisant ImageFZ (figures 5C, 5F, 5I et). Ainsi, pour obtenir les résultats les plus fiables, chacun des paramètres du programme de ImageFZ doit être étalonné nousment les données marqués par des observations humaines dans chaque environnement de test.

De plus, nous avons comparé les résultats obtenus par un observateur humain, en utilisant un système basé sur la mesure de la photobeam-ordinateur (système Gel Monitor), à ceux obtenus en utilisant ImageFZ (voir figure 6). L'observateur humain a été aveuglé au groupe de traitement et les résultats de ImageFZ ballon. Pour les réglages des paramètres du système Gel Monitor, nous avons utilisé trois mesures de la part de congélation d'un système validé précédemment ^30. En bref, le nombre d'intervalles de 10 sec dans lequel les animaux a nécessité plus de 1 ou 2 secondes pour traverser le premier nouveau faisceau de l'intervalle (1 s 10 s et 2 s 10 s, respectivement) et le temps de latence entre le début de chaque intervalle de 5 secondes, et la troisième nouvelle interruption de faisceau à l'intérieur de cet intervalle (Latency3) ont été mesurés. Les pourcentages des intervalles pendant lequel la souris a été le gel ou le pourcentage de la quantité totale de temps rbligatoire de briser la troisième photobeam ont été calculés.

Les pourcentages de gel mesurés dans chaque système sont illustrées à la Figure 6. Les groupes ont été comparés en utilisant deux voies de mesures répétées ANOVA suivie de tests t (voir le tableau 1). Les pourcentages de gel mesurée à l'aide ImageFZ (figure 6B) étaient plus semblables à ceux marqué par l'observation humaine (figure 6A) que les données obtenues en utilisant un système basé photobeam (figures 6C-E). Les pourcentages de gel mesurées en utilisant le programme de ImageFZ à chaque essai ont été fortement corrélés avec ceux marqué par l'observation humaine (conditionnement, r = 0,947; test de contexte, r = 0,970; indicé test, r = 0,934), alors que les corrélations entre les pourcentages de gel mesurée en utilisant le système de mesure informatique basé photobeam (1sec 10sec, 10sec 2sec, ou Latency3) et l'observateur humain étaient plus faibles (conditionnement, r = 0,503, 0,593, 0,761 et; contexte test, r = 0,772, 0,819, 0,912 et) par rapport aux corrélations entre les pourcentages de gel mesurée à l'aide ImageFZ et l'observation humaine (figures 7A et 7B). En outre, la figure 7 montre que les différences entre les pourcentages de gel obtenues par l'observation humaine et en utilisant ImageFZ dans chaque souris ont été les écarts les plus faibles. Ces résultats montrent que les pourcentages de gel mesurées en utilisant ImageFZ étaient similaires à celles obtenues par l'observation humaine et que ImageFZ est très précis lors de la mesure de la quantité de gel.

Figure 1. Les appareils pour l'contextuelle et défileront essai de conditionnement de la peur. (A) Une chambre carrée acrylique pour le test de conditionnement et le contexte, ( B) des grilles métalliques sur un plancher en plastique blanc pour le noir, agouti, ou diluer souris brunes (en haut) et électrifiables grilles métalliques noir sur un sol en plastique noir pour la souris blanche (en bas); des images agrandies des grilles sont présentés dans le droit panneau, (C) un générateur bruit / ton blanc et un générateur de chocs, (D) une salle insonorisée, et (E) un chambre triangulaire acrylique avec un plancher plat pour le test indicé. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. Représentation schématique du protocole. (A) Vue d'ensemble du contexte et repérée essai de conditionnement de la peur, (B) le conditionnement, (C) contexte essai, et (D) repérée test. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3. analyse de l'image par le logiciel de ImageFZ. Pour chaque paire d'images successives, la quantité de surface (pixels) à travers laquelle la souris est déplacée calculée par ImageFZ. Lorsque cette zone est inférieur à un certain seuil (par exemple 30 pixels), le comportement est jugé être «gel». Lorsque la superficie est égale ou dépasse le seuil, le comportement est considéré comme «non-gel». Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4. La comparaison des pourcentages de gel calculées à partir des images à différentes fréquences d'images en utilisant ImageFZ avec ceux mesurés par l'observation humaine. Les tests de conditionnement de la peur ont été menées en utilisant des souris mâles C57BL/6J (n = 5). Pendant les essais, deux observateurs ont noté le comportement de congélation. En même temps, les images en direct ont été capturés à 4 fps en utilisant le programme de ImageFZ. Les fichiers capturés à 4 fps réduction des dimensions après l'extraction des cadres pour correspondre aux images capturées à 1 ou 2 fps fps. Les valeurs des paramètres de «taux (images / seconde)" ont été mis à 1, 2 ou 4 images par seconde, et les pourcentages de gel dans chaque 60 sec bin ont été calculées à partir des fichiers d'image en utilisant une analyse hors-ligne ImageFZ. Chaque point représente un pourcentage de congélation de chaque bac de 60 sec. Les coefficients de corrélation de Pearson entre les données obtenues à partir de l'observation et de l'analyse ImageFZ humain ont été calculés.Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5. Les pourcentages de gel calculées à partir des images à différentes valeurs de critère de congélation utilisant ImageFZ et celles mesurées par des observations humaines ont été comparés. Les tests de conditionnement de la peur ont été menées en utilisant des souris mâles C57BL/6J (n = 5). Pendant les essais, deux observateurs ont enregistré le comportement de congélation, et les images en direct ont été capturées à l'aide du programme de ImageFZ. Les pourcentages de gel dans chaque 60 sec bin ont été calculées à partir des images (1 image / s) grâce à une analyse hors-ligne ImageFZ, fixer les valeurs des paramètres de «critère de congélation (pixels)» à 20, 30 ou 40 pixels. Chaque point représente un pourcentage de congélation de chaque bac de 60 sec. Corrélation de Pearson cocoefficients entre les données obtenues à partir de l'observation humaine et l'analyse de ImageFZ ont été calculées pour chaque test. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 6. Les pourcentages de gel ont été mesurés à l'aide de systèmes automatisés et de l'observation humaine dans les groupes non conditionnés et conditionnés de souris C57BL/6J mâles (n = 5, chaque groupe). (A) l'observation humaine, (B) ImageFZ, (C) Geler système de moniteur 1 (1sec 10sec), (D) Geler système de Monitor 2 (2sec 10sec), et (E) Geler système de Monitor 3 (Latency3). comparaisons de groupe ont été réalisées en utilisant deux voies mesures répétées ANOVA suivie par des tests t (Uncovs conditionné groupe nditioned de groupe, *, P <0,05; † p <0,01). Les données obtenues en utilisant ImageFZ étaient similaires à ceux marqué par l'observation humaine. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 7. Corrélation et la distribution de fréquence des différences entre les pourcentages de gel, mesurée à l'aide de systèmes automatisés et de l'observation humaine. (AB) Les diagrammes de dispersion et les coefficients de corrélation de Pearson entre les pourcentages de gel marqués par des systèmes automatisés et l'observation humaine sont présentés. Les pourcentages de gel, calculées à l'aide ImageFZ, étaient fortement corrélés avec ceux obtenus par l'observation humaine. (FC) Événements de moins d'un DIF de 10%rence entre les pourcentages de gel obtenues à partir de systèmes automatisés vs observation humaine était plus élevée lorsque les données analysées en utilisant ImageFZ ont été comparés à ceux analysés par l'observation humaine. Cliquez ici pour agrandir l'image.

	Des analyses de variance
	Condition	Temps	Condition x Temps
Jour 1 (conditionnement)
Humain	F (1,8) = 28,53, p = 0,0007	F (7,56) = 20,79, p <0,0001	F (7,56) = 16,58, p <0,0001
ImageFZ	F (1,8) = 13,97, p = 0,0057	F (7,56) = 21,40, p <0,0001	F (7,56) = 11,69, p <0,0001
Gel Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 5.16, p = 0,0528	F (7,56) = 2.39, p = 0,0329	F (7,56) = 0,72, p = 0,6572
Gel Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 4.07, p = 0,0782	F (7,56) = 3.44, p = 0,0039	F (7,56) = 1,52, p = 0,1803
Gel Monitor (Latency3)	F (1,8) = 4.44, p = 0,0682	F (7,56) = 9,94, p <0,0001	F (7,56) = 4.33, p = 0,0007
Jour 2 (contexte)
Humain	F (1,8) = 42,94, p = 0,0002	F (4,32) = 1.91, p = 0,1336	F (4,32) = 1,48, p = 0,2302
ImageFZ	F (1,8) = 49,61, p = 0,0001	F (4,32) = 2.06, p = 0,1087	F (4,32) = 0,83, p = 0,5174
Gel Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 20,28, p = 0,002	F (4,32) = 1,63, p = 0,1918	F (4,32) = 0,55, p = 0,6997
Gel Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 40,20, p = 0,0002	F (4,32) = 2.66, p = 0,0504	F (4,32) = 1.20, p = 0,3306
Gel Monitor (Latency3)	F (1,8) = 35,30, p = 0,0003	F (4,32) = 2.49, p = 0,0626	F (4,32) = 1,09, p = 0,3793

Tableau 1. Les comparaisons des statistiques.

Discussion

Le test contextuelle et indicé conditionné peur est un des paradigmes les plus largement utilisés pour évaluer l'apprentissage et la mémoire. Ce test est une forme de conditionnement pavlovien, dont une association est faite entre un contexte et / ou un stimulus conditionné (signal auditif) et un stimulus aversif (de choc électrique électrique). Après un seul appariement du contexte / signal auditif et choc électrique, les souris présentent gel de longue durée face à soit le contexte ou la queue. Dans ce test, le comportement de congélation est utilisé comme un indice de la mémoire de la peur. Les études pharmacologiques et les lésions ont révélé que la formation de la mémoire, la consolidation, et la récupération sont régulées par plusieurs régions du cerveau, telles que l'amygdale, l'hippocampe, le cortex préfrontal et ^3,33-35. En outre, les études génétiques moléculaires ont démontré le rôle des gènes et des molécules impliquées dans l'apprentissage et la mémoire dans ces régions du cerveau en utilisant des souris génétiquement ³⁶ spécifiques. Par conséquent, ce test est simple et utile pour explorer les bases neurobiologiques sous-jacent l'apprentissage de la peur et de la mémoire. Dans cet article de film, nous avons présenté notre protocole de fournir des informations détaillées expérimentateurs à comprendre et facile à effectuer le test.

Le comportement de congélation a été quantifiée par l'observation directe par les expérimentateurs humains. Un expérimentateur bien formé devrait produire des résultats stables fiables à travers des observations. Cependant, cette méthode pose des problèmes potentiels, tels que les différences dans la méthode d'observation, les préjugés des observateurs, et les erreurs de quantification simples, ce qui rend difficile de comparer directement les résultats de expérimentateurs indépendants et différents laboratoires. Un système de mesure de l'ordinateur sur la base photobeam-automatique a également été utilisé ^26,30-32. Cependant, ce système présente également des problèmes potentiels de mesure des comportements de congélation. En raison de l'agencement de capteurs, ce système peut être incapable de détecter de petits mouvements de la tête qui Typically être marqué comme «actif» par l'observation humaine. En outre, tremblant pendant la congélation peut être considéré comme nonfreezing parce que quand un gel des animaux, des interruptions intermittentes du photobeam sont observés à la suite de tremblements. Comme méthode alternative, automatisés image et vidéo-analyse des systèmes ont été développés ^17-20,37,38. Anagnostaras et al. ³⁷ décrit quelques systèmes avec des logiciels d'analyse d'image qui ont une bonne validité et obtiennent le gel bien ^17,20,37-38. Cependant, la plupart de ces systèmes et programmes d'analyse doivent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux et sont généralement coûteux. Nous avons développé le logiciel de ImageFZ pour l'analyse du comportement de congélation, et ce programme est distribué en tant que logiciel libre. ImageFZ détecte la souris comme un corps de pixels (une particule) et une discrimination subtile mouvement de la souris comme «gel» ou «non-gel» en fonction de la quantité deaire de régions ne se chevauchent pas entre les particules de chaque paire d'images consécutives. Comme le montrent les résultats représentatifs, des mesures en utilisant le programme de ImageFZ sont conformes à ou plus précis que ceux obtenus en utilisant d'autres méthodes. Ainsi, le programme de ImageFZ mesure automatiquement le comportement que les observateurs jugent que les droits de congélation, en utilisant des critères définis. En outre, le programme de ImageFZ calcule la distance parcourue (cm) avant, pendant et après l'exposition au choc électrique, ce qui facilite l'évaluation de la sensibilité au choc et à l'analyse du comportement de congélation.

Les différences méthodologiques existent entre les laboratoires. Ces différences peuvent entraîner des difficultés dans la comparaison des données entre les laboratoires et à reproduire les résultats dans différents laboratoires. Pour obtenir des données plus stables et comparables, il est nécessaire de normaliser le protocole d'essai autant que possible. Le système d'analyse avec ImageFZ conduit à l'automatisation des procédures de test, ce qui peut contribuer àla standardisation des protocoles utilisés dans les laboratoires.

Plusieurs réponses comportementales doivent être considérés lors de l'analyse des comportements congélation. Tout d'abord, lorsque les animaux sont confrontés à une situation effrayante, ils peuvent fuir au lieu du gel ^39. Fuite est l'une des réponses de peur, et sa présence va conduire à sous-estimer la mémoire de la peur. En second lieu, le gel peut dépendre d'un niveau d'activité générale et le niveau d'activité chez les souris expérimentales et de contrôle qui doit être examiné. Par exemple, bien que les souris dépourvues du récepteur de l'acétylcholine muscariniques M1 ont montré des niveaux réduits de gel par rapport à des souris de type sauvage, différents tests comportementaux ont indiqué que les résultats peuvent être attribués à leur phénotype de l'hyperactivité à la place de leur trouble de la mémoire ^18. ImageFZ calcule la distance (cm) parcourue par les sujets. Les données sont disponibles pour examiner si oui ou non il existe des différences dans les niveaux d'activité entre les sujets généraux. S'il existe une différence entre les groupes dansla distance parcourue, une approche possible pour le problème est de considérer la distance parcourue pendant les 2 premières minutes de la formation que l'activité de base et d'utiliser un rapport de suppression (rapport de suppression = (activité au cours des essais) / (activité au cours de base + activité pendant test)) comme un index secondaire de crainte ^17,40. Enfin, une différence de sensibilité à la douleur, induisant des changements dans la réactivité à un choc électrique électrique, le cas échéant, peut entraîner des variations dans le comportement de congélation. ImageFZ calcule également la distance parcourue (cm) dans le détail de deux secondes avant une exposition d'un choc électrique de 2 secondes à 2 secondes après son exposition (pendant 6 s), qui peut être utilisé comme un indice de sensibilité de choc électrique.

Systèmes de vidéo-analyse ont été développés pour mesurer le comportement gel des albinos, noir, agouti, et diluer souris brunes. ImageFZ utilise un plateau de sol noir et grilles noires d'examiner souris blanches (voir la figure 1B). Les grilles noires sont faites de spécification allié traités avec des métaux revêtus de peinture noire et d'avoir une conductivité électrique comparable à celle des grilles métalliques non enrobés, qui sont généralement utilisés pour des souris noires. ImageFZ analyse également le comportement de congélation chez les rats et d'autres rongeurs par des ajustements des paramètres du programme. Dans la version actuelle du ImageFZ, le comportement de l'objet est enregistré en utilisant une caméra vidéo à partir de la paroi supérieure pour analyser le gel. ImageFZ pourrait également être utilisé dans une mise en place où les images sont capturées à partir du côté de la chambre. En outre, le contrôle ImageFZ un maximum de quatre appareils. Cette fonction permet au chercheur d'examiner simultanément 4 souris, de gagner du temps et de réduire les influences potentielles de différences dans le temps d'exécution de chaque sujet et l'ordre de test sur le comportement. Ainsi, ImageFZ simplifie la procédure et l'analyse du comportement de congélation tests, et ce programme facilite le test avec moins de travail et sans aucune formation pour les expériences comportementales.

e_content "> Dans le laboratoire Miyakawa, nous avons évalué plus de 110 souches de souris transgéniques et des souris de contrôle de type sauvage dans le test contextuelle et indicé conditionné peur en utilisant le système vidéo d'analyse pour élucider les effets d'un gène donné sur l'apprentissage et la mémoire ^41-42 Nous avons obtenu un grand nombre de données brutes pour plus de 5000 souris Les données brutes qui a été utilisé pour les articles de recherche publiés ^4-16 sont inclus dans la «base de données de souris phénotype« comme une base de données publique (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). L'article de film fournit des informations détaillées en ce qui concerne les détails de notre procédure expérimentale et favorise la compréhension de la situation de test.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageFZ program	Developed by Tsuyoshi Miyakawa		This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.
Conditioning chamber	O’Hara & Co., Japan	CL-3002L	For mouse.
Cued test chamber	O’Hara & Co., Japan	CLT-3002L	For mouse.
Interface	O’Hara & Co., Japan	CL-1040	The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator	O’Hara & Co., Japan	SGA-2040	The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter)	O’Hara & Co., Japan	SG-T
USB video capture device	XLR8	USB2IVOSX
Quad image splitter	Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan	400AS
Soundproof room	O’Hara & Co., Japan	CL-4210
Freeze Monitor	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)