Un Protocole d'intervention en Trompe d'extension pour les enquêtes plasticité comportementale chez les insectes: application à la base, biomédicale et la recherche agricole

Résumé

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Résumé

Insectes modifier leurs réponses à des stimuli par l'expérience d'associer les stimuli avec des événements importants pour la survie (par exemple, la nourriture, les seconds, les menaces). Il existe plusieurs mécanismes comportementaux par lesquels un insecte apprend associations saillants et eux ne se rapporte à ces événements. Il est important de comprendre cette plasticité comportementale des programmes visant vers aider les insectes qui sont bénéfiques pour l'agriculture. Cette conception peut également être utilisé pour découvrir des solutions aux problèmes biomédicales et agricoles créées par des insectes qui agissent comme des vecteurs de maladies et les ravageurs. La réponse Extension Proboscide (PER) protocole de conditionnement a été développé pour les abeilles (Apis mellifera) il ya plus de 50 ans pour étudier la façon dont ils perçoivent et en apprendre davantage sur les odeurs florales, qui signalent les ressources de nectar et de pollen d'une colonie a besoin pour survivre. La procédure PAR fournit un cadre robuste et facile à employer pour étudier plusieurs mecha écologiquement pertinente différentemécanismes de plasticité comportementale. Il est facilement adaptable pour une utilisation avec plusieurs autres espèces d'insectes et d'autres réflexes comportementaux. Ces protocoles peuvent être facilement utilisés en association avec divers moyens pour surveiller l'activité neuronale dans le système nerveux central par l'intermédiaire d'électrophysiologie ou bio-imagerie, ou pour la manipulation de voies de neuromodulateurs ciblées. Il s'agit d'une analyse sensible pour détecter rapidement des effets sub-létaux sur le comportement provoqué par les facteurs de stress environnementaux, des toxines ou des pesticides.

Nous montrons comment le protocole PER est simple à mettre en œuvre au moyen de deux procédures. On est approprié comme un exercice de laboratoire pour les étudiants ou pour les tests rapides de l'effet d'un traitement expérimental. L'autre permet un contrôle approfondi plus de variables, ce qui est important pour les études de conditionnement comportemental. Nous montrons comment plusieurs mesures pour la réponse comportementale allant de binaires oui / non à plus variable continue comme temps de latence et la durée de la prolongation de trompe peut être utilisé pour tester hypotheses. Et, nous discutons quelques pièges que les chercheurs rencontrent souvent quand ils utilisent la procédure pour la première fois.

Introduction

Beaucoup d'insectes apprennent stimuli écologiquement pertinents, et ils changent alors leurs réponses comportementales à ces stimuli afin de s'adapter à de nouvelles relations prédictives dans leur environnement. Différents mécanismes peuvent sous-tendre cette plasticité comportementale (par exemple, non associatif, associatif / pavlovien et opérant / instrumental ^1). Ces types de plasticité diffèrent dans la façon dont les stimuli ou des comportements sont associés à des événements importants, tels que l'apparition de la nourriture, un compagnon, ou un danger. La compréhension de ces formes de plasticité est très important pour la recherche fondamentale dans le fonctionnement du système nerveux change pour encoder de nouveaux souvenirs ^2. Il est également important pour la compréhension des comportements d'adaptation des insectes qui sont d'importants vecteurs de maladies (par exemple, tsé-tsé et les moustiques) et les insectes qui sont l'agriculture importante, que ce soit dans la production des cultures (les abeilles) ou comme des parasites.

Etudier la plasticité comportementale dans tout animal nécessite un niveau de contrôle expérimental sur un certain nombre de variables qui n'est pas réalisable dans le domaine ^1. Il nécessite le développement d'un protocole de conditionnement robuste qui peut être utilisé dans des conditions plus contrôlées, mais qui sont toujours d'actualité pour le comportement en conditions naturelles. L'abeille domestique (Apis mellifera) est un excellent modèle pour la façon de développer un protocole pour la réalisation d'analyses de contrôle comportemental plasticité ^3,4. La réponse Extension Proboscide (PER) dans les abeilles est un réflexe de comportement naturel dans lequel l'abeille s'étend sa trompe en réponse à la stimulation des antennes avec une solution de sucre. Pendant comportement alimentaire normale, PAR se produit lorsque l'abeille trouve nectar dans une fleur. Heureusement, les abeilles seront facilement ce comportement simple et facilement quantifiables en laboratoire. Cela permet d'étudier, dans un environnement contrôlé, les mécanismes qui influent sur ​​ce comportement écologiquement pertinente ^5. PAR can également être utilisés dans un protocole de conditionnement pour étudier la perception du stimulus et de l'apprentissage et de la mémoire dans des conditions différentes de traitement, qui sont conçus pour faire apparaître les mécanismes comportementaux et neuraux sous-jacents à la plasticité ^6.

Depuis les premières études par Kuwabara ^7, PAR conditionné a été largement utilisé pour révéler non associatif, associatif et les mécanismes qui sous-tendent opérant plasticité comportementale chez les abeilles ^8. Ces mécanismes sont identiques à ceux révélés dans les études de volant librement abeilles ^9. Contrairement aux études de volant librement les abeilles, les protocoles de conditionnement PAR peuvent être couplés avec l'électrophysiologie ^10,11 ou des cellules vivantes imagerie de fluorescence ^12-14 du cerveau. En outre, les protocoles PAR permettent la manipulation expérimentale des voies neuronales par des traitements pharmacologiques ou génétiques moléculaires pour tester des hypothèses concernant le rôle des composants spécifiques du réseau, tels que les neuromodulators ^15,16. PAR protocoles ont également fourni un moyen important d'évaluer les effets sublétaux des conditions environnementales ainsi que les toxines sur la santé et efficacité de la récolte des abeilles ^17.

Cette procédure décrit deux méthodes de livraison des odeurs en parallèle. La méthode 1 est une version de l'odeur et le stimulus inconditionnel (saccharose) suivant qui fournit une méthode peu coûteuse et techniquement simple pour la présentation de l'odeur et de récompense du saccharose. Cette méthode est bonne pour la formation de base et l'automatisme n'est pas possible. Il est un excellent moyen d'introduire cette technique à un laboratoire de classe ou d'enseignement. Au cours de conditionnement pour les expériences impliquant des tâches les plus difficiles et les évaluations physiologiques couplés de la perception des odeurs, de l'apprentissage ou de la mémoire, il est très important de régler avec exactitude et précision le début, la livraison de durée calendrier des stimuli. Pour la livraison de relance les plus fiables, utiliser un moyen d'automatiser la livraison de l'odeur d'untrouver une méthode précise de la prestation de récompense. Méthode 2 emploie automatisé livraison de l'odeur et de la prestation de saccharose plus précis. Il est techniquement plus complexe et nécessite plus de la configuration initiale de la méthode 1, mais elle augmente de façon significative la cohérence entre le calendrier et la quantité de stimuli utilisés pour le conditionnement et doit être utilisé chaque fois que possible.

Protocole

1. odeur (conditionné stimulation) Configuration cartouche

1. Au début de l'expérience, configurer plusieurs cartouches d'odeurs pour les différentes odeurs nécessaires pour les essais de conditionnement.
   1. Utilisez une hotte pour odeur dilution et la préparation de la cartouche d'odeur. Jamais bouteilles ouvertes d'odeurs à l'extérieur de cette hotte, car les odeurs se répandent rapidement dans le laboratoire et potentiellement pour les abeilles à l'odeur avant le conditionnement. De plus, porter des gants lors de la configuration des cartouches d'odeurs et de bien se laver après pour éviter d'exposer les abeilles aux odeurs lors de leur manipulation.
   2. Assurez-vous que chaque cartouche d'odeur est clairement marqué par un marqueur de l'odeur pour laquelle il est utilisé pour la première couleur. Ne jamais utiliser une cartouche d'odeur (de seringue ou piston) pendant plus d'une odeur, puisqu'il peut y avoir d'odeur résiduelle sur la cartouche.
2. Les odeurs et les odeurs Préparation des mélanges
   1. Diluer les odeurs dans l'hexane ou l'autre ou de l'huile minérale à la dconcentration esired.
      REMARQUE: La modification de la concentration de l'odeur ou présentant des mélanges de deux ou plusieurs substances odorantes peut permettre une étude des aspects supplémentaires de la façon dont les abeilles sentent les odeurs et apprennent l'association conditionné. mélanges d'odeurs peuvent être aussi simple que d'un mélange binaire 50:50 ou aussi complexe que plusieurs odeurs qui imitent stimuli olfactifs naturels. La réduction de la concentration de l'odeur augmente également la difficulté de la tâche.
      1. Les odeurs deviendront appauvri avec une réutilisation de la cartouche (figure 2). Pour éviter les problèmes de l'épuisement font assez cartouches pour être en mesure de passer à une nouvelle cartouche tous les 10-12 utilise.
3. Préparation Odeur cartouches
   1. Méthode 1
      1. Pour cette méthode, en utilisant des seringues de 20 ml en plastique avec un cercle de 15 mm de diamètre de papier filtre piégée à l'extrémité en caoutchouc du piston pour cartouches d'odeurs.
      2. Retirer le piston de la seringue et utiliser une épingle pour attacher le morceau de filter papier à l'extrémité du plongeur.
      3. Utiliser une micropipette à placer 10 ul de l'odeur sur le papier filtre, et réinsérer le piston dans le cylindre de la seringue. Poussez le piston à la marque de 15 ml sur la seringue.
   2. Méthode 2
      1. Pour cette méthode, en utilisant verre de 1 ml ou des seringues à tuberculine en plastique (ou pipettes modifiées de même volume et de la forme) avec une bande de papier filtre à l'intérieur et un limiteur de caoutchouc ou de silicone dans la large extrémité du cylindre de la seringue pour les cartouches d'odeurs.
      2. Retirez le piston d'une seringue à tuberculine de 1 cc baril. Le corps de la seringue sera le corps de la cartouche d'odeur.
      3. Retirez l'embout en caoutchouc noir du piston de la seringue et de couper l'extrémité fermée de l'embout en caoutchouc.
         NOTE: Cet anneau en caoutchouc agira comme un limiteur de réduire aspiration du flux d'air dans l'arène, qui sera prématurément tirer odeur de la cartouche et sur l'abeille sobre. Alternativement, un tube de silicone (4,8 mm outediamètre r) coupé en sections de 5 mm fonctionne comme réducteurs.
   3. Rincer l'intérieur du corps de la seringue et l'élément de restriction en caoutchouc / silicone avec 70% d'éthanol (pour éliminer une grande partie de l'odeur résiduelle d'une utilisation précédente) et les laisser sécher à l'air.
   4. Placer une bande de 0,2 x 4 cm de papier filtre dans la grande ouverture du tube de sorte que le papier s'étend de 1 à 2 cm au-delà de l'ouverture.
   5. Utilisation d'une micro-pipette à placer 3-10 ul de l'odeur sur le papier-filtre sans que l'odeur en contact avec l'extrémité du cylindre de la seringue. La pointe de la pipette peut être réutilisée pour la même odeur, mais assurez-vous d'utiliser une nouvelle pointe de mettre en place l'odeur prochain.
   6. Tourner la large ouverture de la seringue vers le haut de sorte que le papier filtre glisse rapidement dans le tube. Insérez l'étranglement dans la large ouverture de la seringue.
      1. Assurez-vous que chaque cartouche d'odeur est clairement marqué par un marqueur de l'odeur, il est d'abord utilisé pour un code de couleur. Ne jamais utiliser une cartouche d'odeur (corps de la seringue ou restrictor) pendant plus d'une odeur, car il peut y avoir d'odeur résiduelle sur elle.
   7. Ballon sur le bout d'un chiffon non pelucheux, tremper avec 70% d'éthanol, et l'utiliser pour essuyer la surface extérieure de la cartouche pour éliminer toute odeur résiduelle à l'extérieur de la cartouche.

2 Collecte, Retenir, et Nourrir les abeilles

1. Préparation Bee comprimantes Harnais
   1. Assurez-harnais de retenue simples pour les abeilles de pailles en plastique de soda, des tubes de plastique dur, ou un tube de métal usiné (tous sont d'environ 0,9 cm de diamètre intérieur et avoir une épaisseur de paroi 1-2 mm). Utilisez harnais robustes pour les procédures impliquant la chirurgie.
   2. Coupez 3 cm sections de la tubulure. Ensuite, couper partiellement l'écart près de la moitié de la tige 1 cm du harnais pour le rendre plus facile à tenir l'abeille en place pendant la fixation du harnais.
   3. Coupez une bande de 0,2 x 6 cm de ruban adhésif et fixer une extrémité d'un côté de l'abeille harnais, leaVing l'autre extrémité libre.
2. Collecte abeilles travailleurs
   1. Recueillir les travailleurs de l'entrée de la colonie comme ils s'arrêtent avant le départ de la colonie ou qui reviennent de la recherche de nourriture.
      REMARQUE: Placer un morceau de treillis métallique, avec des trous juste assez grands pour les abeilles ouvrières à ramper à travers, à l'entrée ralentit les travailleurs de retour vers le bas et il est plus facile de les capturer avant qu'ils n'entrent dans la colonie.
   2. Placez un flacon à scintillation sur l'abeille jusqu'à ce qu'elle s'envole en elle. Tenez le flacon avec son ouverture horizontale ou vers le bas tandis que le couvercle est fixé de sorte l'abeille ne vole pas sur le flacon. Placez une seule abeille dans chaque flacon. Assurez-vous que le couvercle présente un trou pour permettre l'échange de gaz suffisant.
   3. Recueillir les abeilles rapidement pour minimiser le temps qu'ils passent dans les flacons. Conserver les flacons avec des abeilles dans dans une petite boîte à l'ombre.
   4. Transférer la boîte avec les flacons et les abeilles au laboratoire, et de placer les fioles dans un sl eau glacéeurry jusqu'à ce que les abeilles arrêter de bouger. Une fois une abeille est immobile, retirer la cuvette de la glace immédiatement pour éviter la surexposition au froid, et placer l'abeille dans un harnais de retenue.
      REMARQUE: Nous ne recommandons pas de placer les abeilles dans le réfrigérateur ou le congélateur, car il est difficile de suivre quand les abeilles deviennent immobiles, résultant en une exposition excessive au froid. Lorsque plus de 10 mobilisation abeilles, ne transférer que les quelques abeilles à la suspension glace-eau à la fois.
3. Retenir les abeilles
   1. Placer l'abeille dans le faisceau avec son thorax dorsal faisant face à la partie découpée de la tubulure et sa tête au-dessus de la partie supérieure de la tubulure. Appuyez doucement sur l'abeille près de la tubulure de sorte que ses pièces buccales s'étendent au-delà du bord du tube. Faites glisser la bande de ruban adhésif entre la tête et le thorax sur la face dorsale de l'abeille et fixer solidement l'extrémité libre du côté du harnais.
      1. Assurez-vous que la bande sur le harnais est lisse et tendue. Il ne devrait pas être notilacunes ceable entre l'avant du harnais d'abeille et la bande, et la bande doivent reposer à plat sur le dessus du harnais. S'il ya des lacunes de l'abeille peut ne pas être en mesure d'étendre sa trompe correctement ou il peut échapper. Aussi, assurez-vous que les pattes avant de l'abeille ne sont pas en saillie entre l'avant du harnais et le ruban adhésif.
4. Nourrir les abeilles et l'alimentation de climatisation Intervalle
   1. Environ 30 minutes après mobilisation - après les abeilles ont récupéré de la configuration initiale - nourrir les abeilles 3-4 pi 0,5 M de saccharose (dans l'eau). Ce montant sera suffisant pour un intervalle de 3-4 heures à l'alimentation conditionné.
      1. En général, les nourrir 1 pi 0,5 M de saccharose environ chaque heure de temps d'attente entre l'alimentation et le conditionnement pour s'assurer que les abeilles survivent à l'intervalle encore sont assez faim au début du conditionnement d'être motivés pour apprendre l'association conditionné. Dans un laboratoire maintenue à une température chaude ou si uchanter une concentration différente de saccharose, ajuster la quantité alimentée ou l'intervalle de temps en conséquence.
         NOTE: Avec une alimentation à intervalle de 24 heures de conditionnement, assurez-vous que toutes les abeilles sont nourries à satiété avec 0,5 ou 1 M de saccharose au moins 24 heures avant le conditionnement commence. A température ambiante, les abeilles ont besoin d'environ 24 heures avant qu'ils ne soient assez motivés pour bien répondre à un protocole de conditionnement.
         NOTE: utiliser une plus faible concentration de la solution de saccharose pour l'alimentation des abeilles que la concentration utilisée en tant que récompense pendant le conditionnement pour empêcher les abeilles de moins en moins sensible à la concentration de saccharose utilisés pendant le conditionnement, ce qui peut réduire les performances d'apprentissage ^18.
      2. Nourrir les abeilles dans une zone bien loin de la zone d'entraînement. L'exposition au stimulus inconditionnel (saccharose) dans le contexte de conditionnement avant conditionnement peut influencer le conditionnement ultérieur de l'odeur.
   2. Au cours de l'intervalle entre l'alimentation et la conditioning placer les abeilles sur le comptoir dans un quartier calme de laboratoire pour éviter toute perturbation inutile. Si le laboratoire a une faible humidité ambiante, placer les ruches dans un récipient en plastique avec des serviettes en papier humide pendant l'intervalle de temps. Cela empêche la dessiccation, car les abeilles peuvent mourir s'ils sont exposés à une faible humidité pendant des périodes de temps prolongées.
      NOTE: Ne pas modifier le protocole de captage et de l'alimentation dans une expérience! Utilisez uniquement un intervalle de temps spécifique entre la mise en place et l'alimentation des abeilles et de commencer conditionné pour chaque expérience afin que les abeilles sont tous traités de la même façon.

3. conditionné

1. Test de saccharose sensibilité
   1. Quelques minutes avant de commencer la climatisation, de tester la motivation des abeilles pour nourrir en touchant leurs antennes avec une petite gouttelette de solution 0,5 M de saccharose (le même concentration utilisée lors de l'alimentation). Ne les laissez pas se nourrir pendant ce test. Si elles répondent par l'extending leur trompe, ils sont probablement suffisamment motivés pour apprendre et peuvent être utilisés pour le protocole.
2. Conception de l'expérience
   NOTE: Ce protocole peut être modifié pour s'adapter à une vaste gamme de protocoles d'apprentissage afin d'enquêter sur de nombreux aspects de l'apprentissage et de la mémoire des capacités des abeilles à miel. Parmi les nombreux paramètres qui peuvent être ajustés sont le: intervalle inter-essai, le nombre d'abeilles formés à un moment donné, l'intervalle inter-stimulus, le type et la concentration et le nombre d'odeurs, le type et la concentration du stimulus inconditionné, le nombre et la séquence d'essais (Figure 1, Tableau 1), ^19-21. Lors de la conception du protocole exact pour chaque essai de conditionnement, il est très important de garder à l'intervalle entre les essais cohérente entre les individus. Un intervalle d'essai inter qui est trop court, trop long ou incompatible nuira à la performance des abeilles. Voir la discussion pour un traitement complet de ce sujet.
   REMARQUE: Bees apprendront la tâche plus rapidement s'ils sont dans un environnement chaleureux. Par conséquent, maintenir la température de l'environnement de formation cohérente et chaud (29-30 ° C si possible).
3. Tenir les odeurs (conditionné stimulation)
   1. Méthode 1
      1. Configuration du système Odeur de livraison
         1. Montez le 20 ml en plastique seringue contenant le papier du filtre odeur traité de sorte qu'il est stable et la petite extrémité est confronté directement à des antennes de l'abeille. Réglez le piston à la marque de 15 ml et placer la seringue de sorte que le piston est facilement accessible.
      2. Présenter les odeurs de stimulation
         1. Au début de chaque essai, placer l'abeille dans le harnais sur la cheville dans le domaine de la climatisation avec ses antennes directement pointée vers la cartouche d'odeur. Que l'abeille s'acclimater à l'arène pour 15-25 secondes avant le début de la stimulation de l'odeur de réduire les perturbations causées par le changement brusque dans ses environs visuels lors de la relance de l'odeur.
            1. Si l'abeille commence à répondre à la cartouche d'odeur immédiatement après qu'il a été placé dans le domaine de la climatisation, il peut y avoir d'odeur sur la pointe de la cartouche. Enlever l'odeur contamination par lavage de la cartouche avec un tissu non pelucheux trempé dans 70% d'éthanol. Si cela ne résout pas le problème, remplacez la cartouche.
         2. Appuyez sur le piston de la seringue à un rythme régulier de sorte que le piston est complètement enfoncé dans les 4 sec. Surveiller la réponse de l'abeille à l'odeur avant de présenter le stimulus inconditionnel.
         3. Après chaque essai, permet à l'abeille de se reposer dans le domaine de la climatisation pour un autre 15-25 sec. Déplacement de l'abeille trop tôt après le procès permettra de réduire considérablement l'efficacité de chaque essai de conditionnement.
   2. Méthode 2
      1. Configuration du système Odeur de livraison
         1. Débit d'air Source et débit
            1. Comme le flux d'air de la source pour la livraison des odeursutiliser une pompe à aérateur d'aquarium ou une alimentation en air sous pression laboratoire de banc, si le laboratoire est équipé avec elle.
               REMARQUE: Une pompe typique aquarium d'aérateur aura un débit d'air près de 400 ml / min (7 ml / sec); au cours de la 4 sec odeur stimulus, 28 ml d'air s'écouleront à travers une cartouche de 1 ml.
            2. Utilisation d'un débitmètre en ligne avec le tube de l'appareil de distribution d'air pour réguler le débit d'écoulement pour l'alimentation en air. Régler le compteur de débit jusqu'à ce que la vitesse d'écoulement est de 400 ml / min. Vérifier la vitesse d'écoulement à l'ouverture de la cartouche d'odeur distincte d'un débitmètre.
            3. Connecter le flux d'air à la cartouche d'odeurs à travers un système de tuyaux et des vannes en plastique.
               REMARQUE: Le dispositif de synchronisation décrit ci-dessous ouvre les vannes au moment opportun dans le procès. Connecteurs en plastique fixent le système de circulation de l'air à la cartouche d'odeur par une fixation de type Luer de la seringue le canon de la cartouche.
            4. Indépendamment de la source d'air, vérifier périodiquement le débit de make vous que la ligne est intact et le débit est maintenu à la vitesse désirée.
      2. Automatisé Odeur livraison
         1. Utilisation d'un contrôleur logique programmable (PLC) pour automatiser la livraison de l'odeur.
            NOTE: L'automate est programmé pour ouvrir les vannes à la livraison des odeurs flux d'air 6 secondes après le début du programme (lancé en appuyant sur un bouton), garder les vannes ouvertes, pour 4 secondes, et déclencher un signal d'alimentation sonore, via un petit haut-parleur, 3 secondes après le début du stimulus odeur de signaler à l'expérimentateur de livrer saccharose.
         2. Utilisez une petite LED pour indiquer le moment de la relance des odeurs lors de chaque essai. Si possible utiliser une LED rouge, puisque les photorécepteurs des abeilles sont déplacés loin de plus [rouges] longueurs d'onde plus courtes et vers [uv] longueurs d'onde de sorte qu'ils ne peuvent pas le voir ainsi. Placez la LED derrière et en dessous de l'abeille, en dehors de leur champ visuel, de sorte que la lumière ne deviendra pas une inadvertance conditionné stimulus.
            NOTE: La light permet également de vérifier que l'automate fonctionne correctement et est utile dans l'analyse des enregistrements vidéo des réponses des abeilles au cours des essais de test.
      3. Le système d'échappement
         1. Mettre en place un système d'échappement derrière l'abeille pour aider à tirer l'air passé l'abeille et d'évacuer l'air des odeurs chargé de l'arène de conditionnement de maintenir un délai discret pour chaque présentation de l'odeur.
            REMARQUE: si il s'agit d'un système à vide dans le laboratoire, modifier le port d'aspiration et de fixer un conduit de tubage de séchage pour fournir le débit d'air nécessaire pour évacuer le domaine de la climatisation. S'il n'y a pas de système de vide, un petit ventilateur électrique situé dans la ligne avec le tube de séchage conduit à une hotte d'aspiration ou à travers une fenêtre suffira.
      4. Au début de chaque journée, vérifier les connexions électriques et d'air du système de distribution de l'odeur et le système d'échappement. Appuyez sur le bouton de démarrage sur le système de distribution de l'odeur et de suivre le temps entre la pression sur lebouton et lorsque les vannes ouvertes (un clic calme et la lumière LED s'allume) et quand la queue pour présenter le stimulus inconditionnel (un signal sonore) retentit. Vérifier le débit d'air en plaçant un doigt humide en avant du connecteur qui sera fixée à la cartouche d'odeur. Il devrait y avoir un courant d'air fort que lorsque les vannes sont ouvertes. Vérifiez le système d'échappement en maintenant un tissu non pelucheux jusqu'à l'ouverture du système d'échappement pour s'assurer que le débit d'air est assez fort pour évacuer correctement l'air de l'arène de conditionnement.
   3. Montage de la cartouche Odeur
      1. Placez la pâte à modeler soit sur le comptoir ou sur une petite plexiglas se positionner l'abeille et l'odeur cartouche directement en face de la ligne d'échappement. Placez la seringue de l'odeur de verre dans l'argile et de l'ajuster si l'ouverture à l'extrémité large est pointé sur la tête de l'abeille. La fin de la seringue doit être 1-2 cm de l'abeille. Choisissez une distance au sein de cette gamme et être constant.
      2. Placer solidement le raccord reliant la cartouche au tube d'air et le système de valve au-dessus de l'extrémité de verre dépoli étroite de la seringue.
   4. Présenter les odeurs de stimulation
      1. Au début de chaque essai, placer l'abeille attelé sur la cheville dans le domaine de la climatisation avec ses antennes directement pointée vers la cartouche d'odeur. Que l'abeille reste dans l'arène pour 15-25 secondes avant le début de la stimulation de l'odeur pour lui permettre de s'habituer à son nouvel environnement.
         REMARQUE: Si l'abeille commence à répondre à la cartouche d'odeur immédiatement après avoir été placé dans le domaine de la climatisation, il peut y avoir d'odeur sur la pointe de la cartouche. Enlever l'odeur contamination par lavage de la cartouche avec un tissu non pelucheux trempé dans 70% d'éthanol. Si cela ne résout pas le problème, remplacez la cartouche.
      2. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer le mécanisme de synchronisation pour la livraison de l'odeur. Surveiller la réponse de l'abeille à l'odeur après stimulationdébut et avant la présentation du stimulus inconditionnel.
      3. Après chaque essai, permet à l'abeille de se reposer dans le domaine de la climatisation pour un autre 15-25 sec pour permettre la formation de la mémoire initiale. Déplacement de l'abeille trop tôt après le procès permettra de réduire considérablement l'efficacité de chaque essai de conditionnement.
4. Offrir le saccharose (inconditionné de stimulation)
   1. Méthode 1
      1. Pour cette méthode, utiliser un cure-dent pour livrer le saccharose.
         NOTE: Il est préférable d'utiliser un cure-dent en plastique depuis les cure-dents en bois peuvent avoir une odeur qui va influencer les réponses des abeilles au stimulus conditionné.
      2. Trempez la pointe de la cure-dent dans la solution de saccharose, et, quand il est temps de présenter le stimulus inconditionnel, maintenez le cure-dent en face de l'abeille et de permettre à l'abeille de lécher le saccharose de la cure-dent pendant environ 1 sec.
      3. Remplacer le cure-dent régulièrement pour éviter l'accumulation de suCrose.
   2. Méthode 2
      1. Système de livraison de saccharose
         REMARQUE: Une façon plus précise de livrer le stimulus inconditionnel est par l'utilisation de seringues micrométriques, qui peut précisément fournir de petites quantités (dixièmes d'un microlitre) de la récompense saccharose.
         1. Enroulez le micromètre de la seringue en arrière aussi loin que possible. Chargez le baril micromètre de seringue avec la solution de saccharose. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans la partie en verre et d'assembler la seringue. Remplir le moyeu de l'aiguille avec la solution de saccharose avant de le placer sur l'extrémité étroite du corps de la seringue. Pour s'assurer que le fluide dans l'aiguille est en fait le saccharose et pas l'eau de lavage de l'aiguille, enrouler le micromètre avant 1-2 pi avant de commencer l'expérience.
   3. Présentation saccharose
      1. Maintenez la pointe de l'aiguille d'environ 2 cm de l'abeille tandis que l'odeur est présenté. Utilisez le bord de l'arène de formation à la préventionsecouant la seringue que le mouvement peut distraire l'abeille. Ne soyez pas trop près de l'aiguille dans l'attente du signal d'alimentation, puisque ce sera également passer prématurément l'attention de l'abeille de l'odeur de la saccharose.
      2. Dès que le signal d'alimentation des sons, toucher légèrement l'antenne jusqu'à ce que l'abeille s'étend sa trompe, puis nourrir l'abeille. Cela devrait nécessiter qu'un très léger contact ou deux pour les antennes.
         1. Utilisez une quantité de récompense entre 0,2 et 0,8 ul. L'abeille devrait facilement consommer l'ensemble de gouttelettes dans le délai imparti pour le stimulus inconditionnel (~ 1-2 sec). Ne pas utiliser "ad libitum" alimentation à partir d'une grosse gouttelette, qui se nourrit de l'abeille pendant plusieurs secondes, mais ne peut pas consommer entièrement.
         2. Surveillez saccharose s'accumuler sur l'antenne, ce qui réduira la réponse de l'abeille à des présentations ultérieures de la récompense. Modifier la procédure d'alimentation si cela se produit.
         3. Pour assurer la liaison précise de l'odeurcue et la récompense de saccharose, assurez-vous de présenter la gouttelette de solution de saccharose à l'abeille dès que possible après la tonalité.
            REMARQUE: Intervalle entre le début de la CS (odeur) et des États-Unis (saccharose) est essentiel. Idéalement, la présentation de l'odeur et de la présentation de saccharose doivent brièvement se chevaucher. Si plus de quelques secondes se sont écoulées entre la fin de la CS et la livraison des Etats-Unis, les performances de conditionnement va diminuer.

4 Test

1. Après utilisation de conditionnement de tests, non renforcés à évaluer dans quelle mesure les abeilles ont appris et / ou de se rappeler l'association conditionné.
   REMARQUE: Voir la discussion pour une explication détaillée de l'importance d'analyser les réponses des à la suite de tests non renforcées en plus des abeilles des abeilles de la performance dans les essais de conditionnement et une explication de l'objet de plusieurs essais de test et les odeurs de test.
2. Consolidation Temps
   1. Suivantconditionné, soit administrer un essai de test immédiat ou permettent aux abeilles de se reposer dans une période de consolidation.
      NOTE: La longueur de la période de consolidation, l'intervalle de temps entre conditionnement et d'essai, dépendra de l'objectif de l'expérience. Si le but est d'étudier les différences d'apprentissage ou de la mémoire à court terme, la performance des abeilles sur les essais de test peut être évalué immédiatement après ou quelques heures après conditionnement. Si l'expérience consiste à enquêter sur la mémoire à long terme, les essais de test doit être administré au moins 24 heures après la fin du conditionnement.
   2. Si les essais de test sont plus de 24 heures suivant la climatisation, nourrir les abeilles à satiété avec 0,5 M de saccharose suivante conditionné et au moins une fois par jour jusqu'à ce que après 12-24 heures avant les essais de test.
      1. Pour s'assurer que les abeilles ont atteint la satiété, nourrir chacun d'entre eux à plusieurs reprises différents jusqu'à ce qu'ils ne s'étendent plus leur trompe en réponse à toucher leur antennee avec du saccharose. Ils peuvent consommer jusqu'à 40 pi pour atteindre la satiété.
   3. Garder les abeilles dans un conteneur humidifié pour éviter leur dessiccation et la mort au cours de la période de consolidation.
3. ESSAIS
   1. Utilisez les cartouches d'odeurs que nouvellement préparés pour les épreuves.
      REMARQUE: Les cartouches utilisées pour l'acquisition peut être différemment épuisée, de sorte que le stimulus de test ne sera pas uniforme dans les essais, les odeurs et les abeilles individuelles et, par conséquent, pourrait affecter de manière significative la cohérence et la robustesse des résultats.
   2. Au cours des essais, de maintenir le même intervalle inter-essai et d'autres paramètres utilisés lors de la phase de conditionnement de l'expérience.
   3. Ne pas présenter le stimulus inconditionnel au cours des essais de test, car la présence d'une récompense va modifier la réponse des abeilles au stimulus conditionné, masquer potentiellement des effets plus subtils du protocole de conditionnement ou un traitement.
   4. Enregistrer des vidéos de tous les of les essais de test pour pouvoir mesurer plus tard multiples aspects des réponses des abeilles à l'odeur (s).

5 Enregistrement les réponses des Abeilles

1. Binaire (présence / absence) Notation des PER
   1. Utilisez un système de notation binaire du PER au cours des essais de conditionnement et d'essai au cours des essais. Note réponses que soit positive ou négative; ceci est satisfaisant pour de nombreux types d'analyses avec une taille de 20 à 40 abeilles par groupe de traitement de l'échantillon. La topologie précise des réponses peut être complexe ^22. Il est important de mettre en place un outil facile à voir et à marquer critère pour une réponse positive.
      1. Note de la réponse d'une abeille comme positif (+) lorsque l'abeille étend ses trompe-delà de la ligne fait en reliant les extrémités des mandibules ouvertes. Seulement marquer une réponse positive lorsque l'abeille étend sa trompe après odeur début mais avant compensation odeur.
      2. Note de la réponse d'une abeille comme négatif (-) lorsqu'il n'y a pas extension de la trompe pendant le procès ou si la trompe est prolongé après le décalage de la substance odorante.
      3. Évitez d'essayer de marquer des réponses partielles. Pour faire des distinctions plus fines dans le comportement des abeilles, utilisez la technique d'analyse vidéo décrit ci-dessous.
2. Analyse de la vidéo de mesures de PAR supplémentaires (Film 1)
   1. Recueillir des informations supplémentaires à partir de tests de comportement en analysant les vidéos des réactions d'une abeille à une odeur.
      NOTE: Ces mesures peuvent aussi fournir une résolution temporelle plus élevée pour l'examen des réponses des abeilles aux odeurs, surtout quand il n'y a pas une différence dans le score présence / absence de PER entre les groupes de traitement.
   2. Enregistrement des vidéos
      1. Toujours utiliser essai ou extinction des essais non renforcés pour les enregistrements vidéo. La présence de la récompense va modifier la réponse des abeilles à l'odeur, la modification de la durée de la prolongation de la trompe.
      2. Définir une caméra vidéo sur un trépied au-dessus du domaine de la formation et de mise au point sur l'avant de la tête de l'abeille, si les antennes et la trompe sont au point.
      3. Placez la petite lumière LED, qui indique odeur présentation du stimulus, dans une zone située derrière l'abeille qui est visible dans la vidéo afin de l'utiliser pour identifier l'odeur et l'apparition de décalage lors de l'analyse.
      4. Commencer l'enregistrement de 20 secondes avant le début odeur et continuer à enregistrer pendant au moins 20 secondes après l'odeur compensé avant de déranger l'abeille.
   3. Analyse de la vidéo
      1. Téléchargez les vidéos dans le logiciel de montage vidéo, comme iMovie ou Final Cut Pro, avec la possibilité de mesurer des intervalles de temps entre les trames spécifiques dans la vidéo.
      2. Analyse de la réponse des abeilles à l'odeur pour une période de temps discret à partir de l'apparition du stimulus olfactif (par exemple, 10 ou 20 secondes).
      3. Utilisez les mesures communes suivantes pour évaluer PAR:
         1. Mesurer l'durée de la prolongation de la trompe, qui est le temps total que la trompe s'étend au-delà de la ligne de la mandibule à la mandibule (décrite ci-dessus).
            REMARQUE: Une abeille peut s'étendre et se rétracter sa trompe à plusieurs reprises au cours de la fenêtre de temps de 10-20 secondes. Mesurez chaque extension trompe individuellement, et calcul de la durée totale. L'analyse du nombre et de la durée de chaque extension de trompe personne peut également fournir des informations précieuses.
         2. Mesurer le temps de latence de l'extension de la trompe, qui est le temps entre l'odeur début, quand la lumière de LED s'allume, et la première extension de la trompe.
         3. Compter et extensions temps glosse relatives à l'apparition de la substance odorante, la première extension, ou d'autres paramètres de synchronisation.
         4. Suivre les mouvements antennaires ^23, qui montrent également des changements axés sur les odeurs caractéristiques.
            NOTE: Dans le film 1, les mouvements des antennes ont été suivis avec un logiciel de suivi de vidéo pour illustrer le changement dans les mouvements des antennes in réponse à un stimulus olfactif.

Résultats

Nous présentons deux exemples d'utilisation des protocoles PAR décrites ci-dessus. Le premier exemple d'utilisation fait de la méthode 2 pour étudier comment les abeilles perçoivent des odeurs différentes en fonction de la similitude moléculaire à l'odeur utilisé comme CS ^5,24,25. Le second est un exemple de l'utilisation de la méthode 1 et quelques-unes des précautions qui doivent être prises lorsque l'on commence à utiliser PAR expériences de conditionnement dans le laboratoire de recherche.

Des études comme celle-ci ont été utilisés pour décrire le «espace perceptif» olfactif des abeilles et des papillons en collaboration avec BioImaging ¹³ ou électrophysiologique analyses ^26. Les abeilles (n = 20) ont été conditionnés à associer l'odorant décanale avec le renfort de plus de 12 saccharose avant le jumelage des essais de conditionnement (figure 3A). Environ 10% des abeilles ont répondu «spontanément» sur le premier essai, ce qui est normal. Après que le pourcentage que RespondeD augmenter au cours des prochaines essais jusqu'à ce que 100% des abeilles a répondu sur le cinquième essai et tous les procès ultérieur. Plusieurs études ont montré que cette augmentation de la réponse est spécifique à l'état de couplage vers l'avant (figure 1) par rapport à plusieurs procédures de contrôle importants ^3. Après la phase d'acquisition, chaque abeille a été soumis à une série d'essais de test non armée (figure 3B), qui implique l'exposition de l'odeur CS et à plusieurs autres substances odorantes qui diffèrent systématiquement de la PR dans les structures moléculaires. Les abeilles ont répondu le plus fortement à la CS. Leurs réponses aux autres substances odorantes la baisse en fonction des changements systématiques dans la structure, avec les réponses les plus bas aux odorants moins comme le CS.

Dans la figure 4, les résultats d'un récent atelier dans lequel les élèves ont appris, pour la première fois, comment conditionner les abeilles à l'aide de la méthode 1 sont illustrés. Étudiants sapins t conditionnée abeilles par l'avant appariement methycyclohexanone (SMI) ou octanol (PTOM) à renfort de saccharose (figure 4A). Pourcentage de réponses ont été plus faibles sur le premier essai et ont augmenté sur les essais ultérieurs, ce qui indique que les abeilles ont appris l'association des odeurs et de saccharose. Il y avait des différences dans le degré que les abeilles ont appris l'association conditionné dans les différents groupes d'étudiants. Dans notre expérience, ce genre de différences pourraient être dues à l'odeur qui a été utilisé comme le CS, les éléments imprécis de la méthode (méthode 1), ou au niveau des expérimentateurs de formation. Dans le troisième cas, la performance devient vite plus conforme à l'expérience accrue des expérimentateurs. Après conditionnement, chaque abeille a été testé deux fois avec chaque odeur. Dans les groupes des abeilles mellifères qui avaient été conditionnées avec couplage avant de l'OCT ou MCH, la réponse a été, comme prévu, la plus forte à l'odeur conditionné (figure 4B).

ent "> Le deuxième groupe des abeilles qui ont connu avant appariement à octobre a été conditionné en parallèle à un autre groupe dans lequel l'odeur PTO a été en arrière couplé avec du saccharose. jumelage arrière est l'un des plusieurs types de procédures de contrôle afin de démontrer que l'augmentation de la réponse est spécifique à transmettre appariement et non à un autre processus, tels que l'excitation non-spécifique de sensibilisation. Pour jumelage arrière, les États-Unis saccharose et l'odeur CS sont présentés dans l'ordre inverse de ce qui est montré à la figure 1. acquisition de données de jumelage arrière sommes ne s'affiche pas parce que la CR ne peut pas être marqué compte tenu de la présentation de l'odeur CS après la présentation de saccharose. Comme on pouvait s'y prévu pour le conditionnement associatif, les niveaux à OCT réponse étaient plus élevés dans les énoncés prospectifs jumelé groupe par rapport au groupe arrière (figure 4C).

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Figure 1: Diagrammes de modèle expérimental pour le conditionnement à l'aide avant l'appariement. Voir le tableau 1 pour les définitions des termes utilisés dans ce chiffre. (A) Le CS (odeur) précède et chevauche les États-Unis (solution / eau saccharose). La relation entre le CS et des États-Unis montre est optimale pour les abeilles à miel conditionné et les mites. Mais l'ISI optimal peut dépendre du protocole de conditionnement et des espèces animales ^1. (B) Répartition et chronologie relative de CS, CR, États-Unis, et UR. Le CR qui survient avant la présentation des États-Unis ou pendant les essais non renforcés "test" est la mesure dépend des protocoles expérimentaux.

Figure 2: Odeur épuisement à la réutilisation des cartouches. Pour ces données, cartouches d'odeurs étaientmis en place avec l'hexanol comme décrit dans le texte. Hexanol est couramment utilisé comme un CS dans les études PAR; cependant, le taux réel d'épuisement dépendra de l'odeur et du solvant. Cartouches ont ensuite été utilisés qu'une seule fois pendant 4 secondes chaque minute plus de 8 essais (en supposant que 5 abeilles / essai dans une expérience standard qui serait égale à 40 utilisations). Les dilutions dans le solvant indiqué, qui étaient relativement standard pour les expériences PAR, ont été de 2,0 M (A) et 0,2 M (B). (A, B) L'odeur a été prélevé après le premier et le huitième essais par adsorption sur une phase solide microextraction (SPME) de fibres qui a été ensuite désorbé sur un chromatographe en phase gazeuse. Les aires relatives sous les pics étaient plus élevés après le premier procès relatif à la huitième pour les solvants et pour les deux concentrations (Wilcoxon appariées signé test de rang p <0,05 [*] ou plus), ce qui montre que moins d'odeur a été délivré de la cartouche après que la cartouche a été utilisée à plusieurs reprises. (C, D) Les mêmes données montrent que la huitième tr IAL avec l'axe des y élargi. Il montre que l'épuisement est légèrement supérieure à l'hexane par rapport à l'huile minérale, mais uniquement à la concentration plus faible.

Figure 3 Acquisition et test à l'aide décanale que le CS et la méthode 2 pour le conditionnement. (A) de première instance par procès réponse (CR) de plus de 12 essais de couplage avant (figure 1). Les données sont tirées des abeilles n = 20 de miel conditionné en quatre groupes de cinq abeilles chacune. L'ISI était de 3 secondes et l'ITI est de 6 min. (B) à l'aide de tests non armé odeurs qui diffèrent de décanal en longueur et / ou la position de l'atome de carbone du carbonyle chaîne carbonée. Les odeurs ont été présentées dans une série randomisée dans les quatre groupes et ont été entrecoupées par des essais renforcés par des décans égyptiens (aux deux ou trois essais) afin d'éviter l'extinction de la CR.

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Figure 4: Les données d'un atelier au cours duquel diplômé étudiants ont été formés à conditionner les abeilles en utilisant PAR méthode 1. données (A) Acquisition de trois groupes d'abeilles à miel conditionné à l'octanol (n = 23 et 15 pour Gps 1 et 2, respectivement) et méthylcyclohexanone (n = 10) (B) CR lors des essais non renforcés avec deux odeurs. quatre essais présentés en série aléatoire entre les groupes. (C) Tests non armé avec deux odeurs dans deux groupes d'abeilles de miel, une à l'avant associé (Gp 1, n = 23) et un arrière jumelées (n = 25).

Terme (abréviation)	Définition	Exemple pertinent
Stimulus conditionné (CS)	Astimulus qui provoque peu ou pas de réponse du premier et des États-Unis signale	ODEUR
Réponse conditionné (CR) un	La réponse à la CS après association avec les États-Unis	Trompe EXTENSION
Stimulus inconditionnel (États-Unis)	Un stimulus biologiquement significatives qui suscite une réponse	SUCROSE / SOLUTION EAU
Réponse inconditionnée (UR) une	La réponse aux États-Unis	Trompe EXTENSION
Inter-stimulation Intervalle (ISI)	Le temps entre le début de la CS et l'apparition des États-Unis	ODEUR à intervalle SUCROSE
Inter-première instance Interval (ITI)	Le temps entre les appariements successifs CS-américaines pour un seul animal	ODEUR (essai n) à l'odeur (essai n + 1) intervalle

Tableau 1 Importante terminologie. Reportez-vous à la figure 1 pour une illustration de ces termes. ^un PER Pour le conditionnement de la CR et UR sont les mêmes, bien que pour d'autres types d'associations et les réflexes de la CR et UR peuvent différer.

Film 1. Une vidéo d'une abeille effectuer PAR après avoir été conditionné pour répondre à une odeur. Notez la réponse PER de l'abeille environ 1,5 sec suivante odeur apparition. Logiciel de suivi cartographié les mouvements des antennes en réponse à la présentation de l'odeur. Les lignes tracées dans le coin supérieur droit de la vidéo illustrent les mouvements des antennes réelles. Les deux graphiques en bas de l'écran indiquent les mouvements des antennes sur le X (à gauche) et Y (à droite) coordonne. Les lignes verticales dans le graphique figurant dans la vidéo indiquent, de gauche à droite, la lumière ON, PER, s'éteignent et trompe rétractation.

Discussion

Ce protocole a présenté deux méthodes fiables pour le conditionnement en utilisant la procédure PER. Ce sont deux des nombreuses méthodes qui ont été employées avec succès ^{27, 21.} Nous employons la méthode 2 pour toutes les études expérimentales utilisant PAR car il est toujours fiable, même dans les différents expérimentateurs.

La même procédure de base a été adapté à de nombreux types d'études avec les abeilles, y compris l'utilisation de différents stimuli de conditionnement et des réflexes différents de comportement. Il a également été liée à des enquêtes de la base génétique des différences dans l'apprentissage de ^28,29, les corrélats physiologiques de la perception olfactive et la mémoire dans le cerveau ^13,14,30, et les bases génétiques et moléculaires modulateurs de comportement ^15,16,31 . En raison de la connaissance approfondie de la pertinence écologique de l'apprentissage olfactif pour les abeilles, qui a commencé avec les premières études de Karl von Frisch il ya plus de 100 ans ^{31, les résultats de PER peut être facilement liée aux besoins de survie d'une colonie. Plus récemment, il a été adapté pour une étude agricole pour étudier les effets comportementaux sublétales de pesticides et les toxines environnementales 17.}

La procédure de base est puissante en ce qu'elle peut être utilisée pour étudier des problèmes dans d'autres espèces. Deux espèces de papillons nocturnes, Manduca sexta et Spodoptera littoralis, ont été utilisés dans les études PAR pour enquêter sur les bases neurales de l'identification des odeurs et olfactives capacités d'apprentissage de chaque espèce ^32,33. PAR expériences avec les mouches des fruits ont fourni de nombreuses indications sur les cascades de signalisation moléculaires impliqués dans chemosensation et apprentissage ^34. Et PER a récemment été utilisée pour étudier l'accoutumance à la puce (Rhodnius prolixus) ^35, un vecteur de maladie importante.

En général, le procédé est robuste aux changements de mode; l'utilisation de dméthodes de ifférents produiront probablement la même différence relative entre les groupes de traitement. En dépit de la procédure relativement simple, plusieurs problèmes peuvent parfois empêcher les abeilles à partir de l'apprentissage de l'association d'odeur saccharose. Les thèmes suivants sont les éventuelles adaptations du protocole et quelques-uns des problèmes les plus courants qui peuvent survenir lors PAR conditionné.

Considérations sur nombre et le type des essais dans le protocole de conditionnement

Tout protocole d'apprentissage, il faudra l'exposition des abeilles à un certain nombre d'essais dans la phase d'acquisition. Ce nombre dépend largement de la difficulté de la tâche. Les abeilles peuvent apprendre une tâche simple, après un seul essai, mais ils ont besoin au moins de trois essais pour induire la formation de la mémoire à long terme. Comme prévu, les abeilles auront besoin de beaucoup plus d'essais pour apprendre correctement une tâche difficile. En général, il existe un nombre maximum d'essais au-delà de laquelle les abeilles ne améliorent considérablement l'performances ir. Ce maximum est fonction de la tâche spécifique, les types et les concentrations d'odeurs, et la concentration de saccharose.

Lorsque vous utilisez plus d'un type de procès avec des odeurs différentes, présenter les différents types d'essai dans une séquence pseudo-aléatoire de garder les abeilles de mémoriser une séquence simple de présentations d'odeurs au lieu d'apprendre les différences entre les odeurs ^36. Dans ces séquences pseudo-aléatoires, il doit y avoir un nombre égal d'essais pour chacun des types d'odeur. En outre, la probabilité d'un essai d'un type d'odeur étant précédée et suivie par par la même odeur, ou l'un des autres odeurs, doit être égal pour toutes les odeurs. Pour deux odeurs - A et B - utiliser la séquence suivante: ABBABAAB. Plus de huit essais chaque odeur est présenté quatre fois. Concaténer des séquences identiques à atteindre le nombre désiré d'essais pour chaque odeur.

Indépendamment de la conception expérimentale, il ya quelques paramètres qui doivent resterconstante afin d'optimiser l'apprentissage. Le chevauchement entre le CS et les États-Unis est critique pour le conditionnement efficace. L'intervalle entre les essais (figure 1, tableau 1) doit être constant et être optimisé car irrégularité ou un intervalle entre les essais trop court ou trop long peuvent influencer de manière significative l'efficacité du protocole de conditionnement ^1.

Considérations sur l'importance et la conception des essais de tests comportementaux

Réponses enregistrées au cours de la «phase d'acquisition" d'une expérience, lorsque le CS et des États-Unis sont présentés ensemble, peuvent être utiles. Toutefois, méfiez-vous que les conditions de présentation des odeurs peuvent différer d'un type de jugement à une autre. Au cours des essais armé, le saccharose suivie d'odeur est présentée en association avec un stimulus visuel (mouvement du dispositif de distribution de la gouttelette de saccharose) qui peut affecter la réponse de l'abeille. Et les abeilles ont seulement trois secondess pour montrer une réponse (quatre secondes stimulation des odeurs moins le chevauchement d'une seconde à la présentation de saccharose; Figure 1). Si l'expérience implique que les abeilles apprennent à différencier deux odeurs (par exemple, armé et non armé), l'odeur non armé présenté sur les essais de remplacement se produit sans le stimulus visuel de la présentation de la récompense et les abeilles ont les pleins quatre secondes pour répondre. Par conséquent, les réponses aux deux odeurs ne sont pas entièrement comparables lors de l'acquisition. Avec un protocole de conditionnement, ne comptez pas uniquement sur ​​les courbes d'acquisition ^1. Pour mieux cerner ce que les abeilles ont appris, introduire une série d'essais de test non armé, au cours de laquelle ni l'odeur est renforcée, ce qui assure que les tests de tous les stimuli se déroule dans des conditions identiques.

Selon l'objectif spécifique de l'expérience, les tests peuvent consister en des essais de tests individuels, de l'odeur conditionné ou une série d'essais avec l'od conditionnéou une combinaison ou des odeurs conditionnés et nouveaux. Un essai de test unique de l'odeur conditionné fournit un test simple de savoir si les abeilles "se souviennent de l'odeur conditionné. Cependant, la réponse à la première épreuve de test peut refléter le niveau de motivation des abeilles ainsi que leur rappel de l'odeur conditionné. Une série d'essais de test, soit une série d'essais d'extinction de l'odeur ou la climatisation d'une série de tests simples de l'conditionné et un ou plusieurs nouveaux odeurs, peut également être utilisée pour évaluer la mémoire. La série d'essais d'extinction peut évaluer à quel point les abeilles "se souviennent de l'association conditionné. Le plus fort le rappel le plus grand nombre d'essais nécessaires pour éteindre la réponse conditionnée. Une série de tests simples d'odeurs conditionnés et nouveaux peut également évaluer la spécificité de la mémoire de l'odeur conditionné des abeilles.

Il est également impératif de conditionner et tester à la fois témoin et les groupes traités aux mêmes points de temps. Comparle rendement d'abeilles bientôt après conditionnement pour les abeilles détenus pour des périodes de temps plus longues est problématique en raison de l'exposition aux États-Unis saccharose par l'alimentation des abeilles à satiété. Par exemple, une baisse des performances après de longs intervalles pourrait être dû à la mémoire pourriture ou il pourrait être dû à des changements dans l'état et / ou de motivation d'apprentissage induits par une exposition non renforcé aux États-Unis, ce qui rend les résultats ambigus. Par conséquent, les performances d'un groupe de traitement doit toujours être évaluée par rapport à un groupe témoin conditionné et testé dans les mêmes points de temps.

Odeur de concentration et l'intégrité

Il existe plusieurs moyens par lesquels la concentration et de l'intégrité de l'odeur (CS) peut être compromise. Le problème le plus répandu avec la livraison des odeurs est l'épuisement des cartouches d'odeurs de la surexploitation (Figure 2). Remplacez les cartouches 10-12 usages (tous les 2 ou 3 essais avec des groupes de 5 abeilles) pour éviter cet écueil. Il est également essentiel d'utilisercartouches frais pour les essais de test, car les cartouches usagées peuvent être différemment épuisés et présentent donc des stimuli d'odeur inégales. Un autre problème commun est cartouche contamination de l'odeur due à l'utilisation de la cartouche pour plus d'une odeur tout à fait sans le nettoyer. Un flux d'air sale ou contaminée peut aussi involontairement introduire de relance supplémentaires olfactif (filtres à charbon actif peuvent empêcher la contamination de fond). Cela est particulièrement problématique lors de l'accouplement PAR conditionné avec des mesures des réponses physiologiques à l'odeur. Cartouches d'odeurs qui fuient présentent un problème car les abeilles sont exposés à l'odeur avant le début du procès, ce qui réduit la saillance du stimulus d'odeur. Ample sur l'alimentation en air pour la livraison des odeurs peut entraîner peu ou pas de livraison d'odeur lorsque la soupape s'ouvre, réduisant artificiellement la réponse des abeilles à l'odeur prévu.

Solution de saccharose et de stimulus inconditionnel (récompense)

L'unmontage, la concentration et l'intégrité de la solution de saccharose utilisé comme les Etats-Unis sont essentiels à la réussite de l'expérience. Le conditionnement est une fonction de la quantité et la concentration de la solution de saccharose dans l'eau utilisé comme aux Etats-Unis ^37. Les seringues micrométriques utilisés dans la méthode 2 permettent de très précis (jusqu'à 0,2 pi) le contrôle de la livraison des États-Unis, et nous vous recommandons de les utiliser pour les deux méthodes décrites. Utiliser des cure-dents (méthode 1) est suffisante pour les cas où les seringues coûteux ne peuvent être utilisés, tels que, dans la formation de grands groupes d'étudiants, le travail sur le terrain, ou avec des budgets plus modestes. Mise en œuvre rigoureuse de la méthode 1 est très bien tant que le calendrier est maintenu avec le remplacement régulier des cure-dents pour éviter l'accumulation de saccharose (et la concentration de livraison). Cependant, à l'aide de cure-dents, il est plus difficile de contrôler avec précision et estimer la quantité et la grandeur des Etats-Unis délivré, ce qui est important pour des études de conditionnement ^1. La concentration de saccharose nécessaire pouroffrir une récompense suffisante pour maintenir les abeilles motivés pour apprendre l'association conditionné peut dépendre de la difficulté de la tâche et l'état interne des abeilles ou période de l'année. Les tâches les plus difficiles exigent une solution de saccharose plus élevé pour les abeilles »d'apprendre à bien la tâche. Moule peut s'accumuler dans les solutions de saccharose, même à 5 ° C, ce qui risque de compromettre l'intégrité de la solution, ce qui affecte la santé et de la perception de la récompense des abeilles pendant l'expérience. Il est préférable de remplacer la solution au bout de quelques jours.

Précision, timing, et la cohérence de SC et de livraison

La question la plus critique à propos de la bonne exécution d'une procédure PER, ou d'ailleurs n'importe quel procédure de conditionnement, implique précision, timing et la cohérence des CS et la livraison US (figure 1). Les enquêteurs qui sont nouveaux dans la procédure sont souvent imprécis sur la livraison d'un ou de deux stimuli. ISI dans l'qui ne parviennent pas à permettre le chevauchement CS et des États-Unis se traduisent par des performances de conditionnement pauvres. Le PLC automatise un signal sonore pour l'expérimentateur de livrer saccharose 3 secondes après le début de la prestation de l'odeur. Les enquêteurs devraient tenir le saccharose / goutte d'eau à proximité de l'abeille pour la livraison rapide après le signal. Ces procédures permettent entraîner un ISI cohérente. Mise en place d'un chronomètre par le domaine de la climatisation permet de placer de temps pratique du procès ainsi que le suivi du temps des abeilles dans l'arène à la fois avant et après l'accouchement de stimuli. De cette façon, les ITI peut être relativement cohérente et toute la procédure peut être exécuté à un rythme contrôlé. ITI qui sont trop courts, par exemple moins de 1 min, ou trop long peut conduire à des performances de conditionnement pauvres ^1.

Effets des fluctuations saisonnières, environnementaux et contextuels sur Honey Bee Performance

La performance abeilles peut être grandement influencée par son environnementà la fois avant et pendant le conditionnement. Souvent, les fluctuations de la disponibilité de la température et de la nourriture qui viennent avec les saisons vont modifier la motivation des abeilles à apprendre. Lorsque les fleurs sont en fleur, la motivation des abeilles pour apprendre l'association conditionné dans le laboratoire diminue ^38. Lorsque la colonie est souligné - des températures extrêmes, des pénuries alimentaires ou le stress lié à la maladie - les abeilles »affichera une réduction de leurs performances d'apprentissage à l'intérieur. Les abeilles y sont maintenus dans une chambre de vol peut bien apprendre pendant un certain temps, mais aussi, le stress de la maladie et le vieillissement se dégradent leur performance d'apprentissage au fil du temps. Le contexte au cours du conditionnement peut également diminuer la performance des abeilles. Odeurs anormales, le mouvement, et d'autres stimuli peuvent distraire l'abeille à partir des stimuli expérimentaux. Pour éviter ce problème, maintenir un contexte visuel raisonnablement uniforme, simplifiée.

Génotype et que l'expérience touche PAR Performance

travailleurs de miel d'abeille peuvent différer considérablement des performances sur une procédure de conditionnement en raison de la spécialisation des tâches, le génotype, ou d'autres facteurs environnementaux ^20. Par conséquent, il est important de standardiser le plus possible, les types d'animaux utilisés dans une expérience dans le but de réduire la variation inter-individuelle. Dans une colonie dirigée par une reine ouvert accouplés, ce qui signifie qu'elle couplé avec de nombreux drones différents, les travailleurs diffèrent dans génotype paternel. Fond génétique peut conduire à des différences spectaculaires dans la réactivité sensorielle ³⁹ et ²⁹ performances d'apprentissage. Utilisation de colonies dirigées par des reines inséminées instrumentalement par le sperme de drones simples ²⁸ réduit cette variation inter-individuelle.

Les protocoles décrits ci-dessus, comprend un procédé pour recueillir les travailleurs d'abeilles à partir de l'entrée du nid. Cependant, ces abeilles domestiques diffèrent l'une de l'autre en ce qui concerne l'âge ou de la tâche comportementale. Ils peuvent être jeunes (inexperienced) ou plus âgés () butineuses plus expérimentés. Ils peuvent être jeunes abeilles qui font leurs premiers vols d'orientation. Ou ils peuvent être abeilles gardiennes. Pour réduire la variabilité, marquer les abeilles avec une peinture émail à séchage rapide ou des balises de marquage soit qu'ils deviennent adultes (pour contrôler l'âge) et / ou comme ils commencent la recherche de nourriture (pour contrôler l'expérience). Puis, quelques jours plus tard, collecter les abeilles marquées pour le conditionnement. Les travailleurs qui sont engagés dans des comportements de soins infirmiers peuvent être collectées à partir des trames au sein de la ruche. Les infirmières peuvent être identifiés avec certitude quand ils insèrent leurs têtes dans une cellule de couvain à nourrir et soigner la larve à l'intérieur.

Utilisation Vierge Queens ou drones pour PAR conditionné

En plus abeilles ouvrières, reines vierges d'abeilles et bourdons peuvent être facilement conditionnés dans une procédure PAR pour les études visant à développer les lignées génétiques des abeilles mellifères qui diffèrent des performances ²⁸ d'apprentissage. Reines vierges devraient être recueillis peu après eey émergent de la nymphose et placés directement dans les harnais de retenue sans anesthésie. Les jeunes, les drones immatures prélevés dans le couvain intérieur de la colonie ne sont généralement pas motivés à apprendre. Après ils ont commencé à s'accoupler vols, drones apprennent facilement les tâches PAR ^28. Ils doivent être collectés à leur retour d'un vol nuptial et maintenues pendant la nuit dans une petite cage dans une colonie utilisées pour l'élevage des reines. N'essayez pas de les exploiter le jour avant le conditionnement; ils ne survivent pas bien dans les harnais nuit. Quelques heures avant le conditionnement des drones peuvent être collectées à partir des cages et placées dans les harnais de retenue sans anesthésie.

Conclusions

Cette procédure PER, de la manière de méthodes, s'élève à un point de départ pour la conception d'expériences PAR. La plupart des protocoles de PAR, il faudra que la procédure décrite être changé en quelque sorte de mettre en œuvre les objectifs spécifiques de l'expérience et accommodate groupes de traitement multiples. Il est facile à mettre en oeuvre. Cependant, la mise en œuvre adéquate exige de la minutie et de la pratique. Une fois maîtrisé, il peut être une procédure efficace pour ajouter un outil de recherche de plusieurs programmes de recherche fondamentale et appliquée avec différentes espèces d'insectes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
1-hexanol	Sigma-Aldrich	471402-100ML	For additional examples
2-octanone	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	of odorants, see any of
heptanol	Sigma-Aldrich	51778-5ML	the papers on olfactory
gerianol	Sigma-Aldrich	163333-25G	processing from the
nonanal	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Smith lab.
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-1L
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760-1L	Make sure it’s odorless.
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836-1L
Scintillation vials	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness			Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
Wash bottles	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes	Cole-Parmer	WU-07945-18
15 mm filter paper circles	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles	Fisher Scientific	14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass)	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA OR Z192090-200EA	Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors	Cole-Parmer	EW-95702-02	Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
[header]
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter	Cole-Parmer	EW-03216-08	Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump	Aquacave	AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E"	The Lee Company	LFAA1200118H	Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer	RadioShack	273-074