La stimulation cérébrale profonde avec simultanée IRMf chez les rongeurs

Résumé

Ce protocole décrit un procédé standard pour l'imagerie fonctionnelle simultanée de résonance magnétique et la stimulation cérébrale profonde dans le rongeur. L'utilisation combinée de ces outils expérimentaux permet l'exploration de l'activité aval mondiale en réponse à une stimulation électrique à pratiquement n'importe quelle cible de cerveau.

Résumé

Afin de visualiser les réponses neuronales mondiaux et en aval à la stimulation cérébrale profonde (DBS) à différents objectifs, nous avons mis au point un protocole pour l'utilisation de niveau d'oxygène dans le sang (BOLD) d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) à l'image des rongeurs avec simultanée DBS. DBS IRMf présente un certain nombre de défis techniques, y compris la précision de l'implantation d'électrodes, artefacts MR créés par l'électrode, le choix de l'anesthésie et de paralysie de minimiser les effets neuronaux tout en éliminant les mouvements des animaux, et l'entretien des paramètres physiologiques, déviation à partir de laquelle peuvent confondre l' le signal BOLD. Notre laboratoire a mis au point un ensemble de procédures qui sont capables de surmonter la plupart de ces problèmes éventuels. Pour une stimulation électrique, une maison de tungstène bipolaire microélectrode est utilisé, inséré par stéréotaxie au site de stimulation dans le sujet anesthésié. En préparation de l'imagerie, les rongeurs sont fixés sur une pièce de tête en matière plastique ettransféré à l'alésage de l'aimant. Pour la sédation et la paralysie pendant le balayage, un cocktail de dexmédétomidine et pancuronium est infusé en continu, avec une dose minimale de l'isoflurane, cette préparation minimise l'effet de plafond BOLD d'anesthésiques volatiles. Dans cet exemple, l'expérience, la stimulation du noyau sous-thalamique (STN) produit des réponses GRAS qui sont observées principalement dans les régions corticales ipsilatérales, centrée sur le cortex moteur. Simultanée DBS et l'IRMf permet la modulation sans ambiguïté des circuits neuronaux en fonction du site de stimulation et des paramètres de stimulation, et permet l'observation des modulations neuronales libres de partialité régionale. Cette technique peut être utilisée pour étudier les effets en aval de la modulation de circuits neuronaux à presque n'importe quel région du cerveau, avec des implications pour la clinique et expérimentale DBS.

Introduction

Déterminer les effets globaux en aval de l'activité des circuits neuronaux représente un défi majeur et un objectif pour de nombreux domaines de la neuroscience des systèmes. Un manque d'outils sont actuellement disponibles répondent à ce besoin, et donc il ya une demande pour une plus grande accessibilité des montages expérimentaux appropriés. Une telle méthode pour évaluer la conséquence globale de l'activation des circuits neuronaux repose sur l'application simultanée de la stimulation cérébrale profonde électrique (DBS) et l'IRM fonctionnelle (IRMf). DBS-IRMf permet la détection de réponses en aval de l'activation du circuit à grande échelle spatiale, et peut être appliqué à pratiquement n'importe quelle cible de stimulation. Cet ensemble d'outils est très approprié pour des études précliniques traductionnelles, y compris la caractérisation de réponses à la stimulation à haute fréquence thérapeutique.

En plus de l'accès à un scanner IRM approprié, expériences réussies DBS-IRMf exigent l'examen d'un certain nombre de variables, y compris le type d'électrode, la méthode de la sédation et de la maintenance des paramètres physiologiques. Par exemple, le choix de l'électrode doit être fondée sur des facteurs liés à la stimulation efficacité (par exemple. Taille et la conductance de plomb, mono-vs bipolaire), ainsi que la compatibilité MR et l'électrode taille d'artefact. artefacts d'électrodes varient en fonction du matériau d'électrode, et la taille ainsi que la séquence de balayage utilisée; tests pré-expérimental complet doit être employée pour déterminer le type d'électrode appropriée pour chaque étude. En général, les électrodes de tungstène de microfilaires sont recommandés pour ce protocole. Choix de paralytique et sédatif doit être fait pour immobiliser efficacement l'animal et de réduire les effets de suppression de certains sédatifs sur le niveau de signal-en oxygène du sang (BOLD). Enfin, il est essentiel de maintenir l'animal à des paramètres physiologiques optimales, y compris la température corporelle et la saturation en oxygène.

Le protocole que nous avons développé pour DBSIRMf surmonte nombre de ces obstacles potentiels, et dans nos mains, fournit des résultats fiables et cohérents. De plus, ces procédures expérimentales peuvent être aisément adoptées pour la combinaison de l'IRMf avec les méthodes de stimulation de substitution, y compris une stimulation optogenetic.

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Protocole

Déclaration éthique: Cette procédure est en conformité avec les Instituts nationaux de la santé Lignes directrices pour la recherche animale (Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire) et est approuvé par l'Université de comité de protection et d'utilisation des animaux en Caroline du Nord.

Une. Electrode Implantation

La première étape est l'implantation d'électrodes. Dans cette étape, une électrode est implantée de manière unilatérale dans le noyau sous-thalamique (STN), un petit noyau de signification de translation pour le traitement de la maladie de Parkinson selon les méthodes suivantes:

1. Stériliser tous les équipements chirurgicale en utilisant un autoclave, ou une solution antiseptique où l'autoclave n'est pas possible (par exemple pour électrode stérilité). Remarque: il s'agit d'une chirurgie de la survie à court terme, et donc une technique aseptique est essentiel. Après la chirurgie, les animaux peuvent être imagés après une brève période de récupération (48 h) ou à plusieurs semaines plus tard.
2. Anesthésier le rat (rats Sprague-Dawley adultes 250-400 g) en utilisant 2,5% d'isoflurane administré par intubation endotrachéale et un petit ventilateur animal. Fixer le rat à un cadre stéréotaxique chirurgicale et préparer le site chirurgical utilisant des techniques aseptiques.
3. Préparer et faire en sorte que l'électrode est stérile. A 2 canaux électrode de tungstène microfils maison est utilisé pour cette procédure, bien que de nombreux types d'électrodes IRM-compatible travailleront. Le type d'électrode utilisé peut influer sur la zone de tissu endommagée mécaniquement par la procédure, la zone de tissu stimulé, et la précision de l'implantation, ce qui affecte le résultat expérimental global. Si le type d'électrode ne peut pas être stérilisé à l'autoclave, en utilisant la polyvidone iodée antiseptique pour stériliser l'électrode dans la mesure du possible.
4. À l'aide de ciseaux supprimer le cuir chevelu au-dessus de l'emplacement d'implantation avec un diamètre d'environ 1,5 cm, pour découvrir bregma et lambda sur le crâne. Retirer le muscle et l'aponévrose recouvrant le crâneet arrêter tout saignement bistouri électrique.
5. Grattez la surface du crâne dans de multiples directions avec un scalpel pour améliorer l'adhérence de ciment dentaire (étape 1.8). Niveau bregma et lambda dans la direction horizontale.
6. . Pour cibler STN, à 3,6 mm en arrière Bregma et 2,5 mm latéral de la ligne médiane, utiliser une perceuse électrique petite pointe pour créer un trou de trépan mesurant environ 1,5 mm de diamètre Remarque: L'emplacement exact de la STN en référence à stéréotaxique coordonnées peut varier selon la souche de rat, le poids et le sexe. Des rats adultes du même genre doivent être utilisées pour réduire au minimum toute variation de l'emplacement. Si possible, les analyses anatomiques pré-opérationnelles ou des enregistrements électriques peropératoires doivent être utilisés pour identifier l'emplacement de STN sur un sujet de façon individuelle. En outre, les sites de terminaison d'électrodes doivent être vérifiées histologiquement pour assurer l'exactitude de cible.
   1. Faites une nouvelle incision dans la durée, et utiliser de petits forceps émoussé pour déplacer la durée aux côtés de etrou e. Arrêter le saignement en utilisant du coton stérile imbibé de sérum physiologique. Créer des trous pour une ou plusieurs vis MR-compatibles) et les insérer doucement dans le crâne jusqu'à ce qu'ils soient stables. Vis peuvent être placés dans n'importe quel endroit où ils ne seront pas perturber la mise en place du connecteur externe pour l'électrode DBS (par ex. Pas directement derrière le STN ipsilatéral à l'électrode). Nous recommandons des emplacements sur les bords latéraux du crâne, de préférence directement postérieur à la suture lambda. À ce stade, le crâne est relativement épaisse, réduisant la probabilité que les vis d'endommager le cortex ". Remarque: les vis en laiton coupés à 4-5 mm de longueur sont utilisés dans ce protocole, mais vis en plastique sont également appropriés.
7. Placer l'électrode sur le bras stéréotaxique, s'assurer qu'il est bien droit et vertical. Touchez l'électrode à Bregma, puis déplacer l'électrode exactement 3,6 mm en arrière Bregma et 2,5 mm latéral de la ligne médiane et toucher la surface corticaleavec l'électrode. De la surface corticale, insérer l'électrode de 7,8 mm sur le ventre. Ces coordonnées sont déterminées par référence à un atlas neuroanatomiques ^1.
8. Placez une couche de ciment dentaire sur le crâne, y compris les vis du crâne et le point d'insertion de l'électrode. Attendez que le ciment est complètement durci avant de retirer l'électrode du cadre stéréotaxique. Bend l'électrode arrière et utiliser du ciment supplémentaire pour couvrir le reste de l'appareil d'électrodes et d'un connecteur pour une durabilité.

2. IRMf Préparation

La deuxième étape est la configuration de l'IRMf, y compris le positionnement de la bobine et la configuration de l'équipement de surveillance physiologique.

1. Fixez la tête de l'animal pour empêcher le mouvement pendant le balayage. Remarque: Un système de bar-auriculaire en plastique personnalisé est utilisé ici pour la tête de fixation. Placer les barres dans les canaux de l'oreille et fixez-le au casque de sorte que la tête tourne librement dans ee direction verticale sans rotation horizontale. Fixer la position de la tête par la fixation des dents supérieures de l'appareil.
2. Anesthésier le rat complètement et suivre fin CO ₂ marée pour assurer la stabilité dans toutes les analyses. Pour maintenir l'anesthésie, la ventilation et le contrôle fin CO marée ₂ niveaux au cours de l'analyse, un petit système de ventilation animale compatible IRM combinée avec un vaporisateur isoflurane est utilisé ici, mais une variété d'agents anesthésiques et sédatifs peut être utilisé d'une manière similaire. Régler le ventilateur à 45 respirations / min avec un volume modéré, environ 500 ml / min d'air en tant que volume de départ. Réglez l'isoflurane à 2% et de transférer le rat dans la chambre de balayage. Fixez la sortie du ventilateur de la sonde endotrachéale du rat et appuyez fermement pour le fixer. Capnométrie doivent être acquises au moyen d'un tube relié à au plus près du connecteur de tube endotrachéal que possible. Régler le volume de ventilation pour produire un CO en fin d'expiration ₂ de 2,6% à 3,3%.
3. Utiliser un petit animal porteur compatible IRM pour insérer le rat dans le scanner avec un bain de circulation d'eau chaude pour la régulation de température. Collez le pavé de la salle de bain sur le support et couvrir avec du papier absorbant propre. Placez le rat sur le lit d'eau chaude.
4. La surveillance des niveaux de température et de dioxyde de carbone sont essentiels à IRMf BOLD, tandis que la saturation artérielle en oxygène et la fréquence cardiaque sont aussi des paramètres physiologiques utiles. Insérez une sonde de température rectale MR-compatible et bande à la base de la queue, puis ajuster la température du bain d'eau pour maintenir la température normale du corps à 37 ° C. Surveillance de la saturation artérielle en oxygène et la fréquence cardiaque à l'aide d'un petit système d'oxymétrie de pouls pour animaux, en les maintenant à 95 à 98% et de 250 à 350 battements par minute, respectivement, qui peut varier en fonction du type d'anesthésiques utilisés. La saturation en oxygène et la fréquence cardiaque sont toutes deux influencées par la profondeur de l'anesthésie, le volume de ventilation et la vitesse de ventilation. le volume d'air et la vitesse peuvent avoir besoinêtre soigneusement équilibrée pour maintenir en fin d'expiration _de CO ₂ des niveaux adéquats et la saturation en oxygène suffisante.
5. Une bobine de surface est nécessaire pour l'acquisition IRMf BOLD. Placer la bobine de surface au plus près de la surface de la tête que possible. Une fois fixée, mettre la pâte dentifrice sur la surface de la tête sur le bouchon de ciment afin de réduire les artefacts de susceptibilité à proximité de la surface du cerveau. Note: On utilise une bobine de surface d'émetteur-récepteur fait maison avec un diamètre intérieur d'environ 1,6 cm, bien que de plus grandes bobines de surface peuvent être utilisé pour optimiser la réponse BOLD dans les régions sous-corticales profondes.
6. Connectez l'électrode de stimulation à un système de stimulation électrique programmable Note:. Nous utilisons un TTL programmable sur mesure système relié à un stimulateur bipolaire pour délivrer des impulsions électriques synchronisées aux excitations RF des scans IRM de déclenchement.
7. Pour la sédation et la paralysie lors de l'acquisition de données IRMf, utiliser un cocktail de dexmédétomidine (0,1mg / kg / h, ip) et le pancuronium (1 mg / kg / h, ip), combinée à une faible dose de l'isoflurane à 0,5% pour éviter l'activité épileptique ^2. Pour la perfusion du médicament, une pompe à seringue compatible IRM doit être utilisée lorsque la pompe doit être placée dans l'environnement magnétique. Alternativement, une pompe non compatible peut être placé à l'extérieur de l'environnement magnétique à condition que les tubes de cathéter étendu est utilisé.

3. IRMf Acquisition de données

La troisième étape est l'acquisition IRMf, y compris le positionnement, calage, analyses anatomiques, fonctionnelles et analyses. Un système 9.4 Tesla avec une bobine de surface maison est utilisé ici, bien que cette technique peut être adaptée à d'autres systèmes à haut champ et le commerce fait bobines IRM.

1. Insérez le rat dans le scanner et la position dans le centre de l'aimant. Utilisez une image de boy-scout de trois avions de centrer précisément le rat dans l'aimant par rapport aux régions du cerveau d'intérêt, et FastMap calage à homoniser le champ magnétique au niveau des régions d'intérêt.
2. Utilisez un T2 séquence RARE sagittale (FOV, 2,56 x 2,56 cm ^2, la taille de la matrice, 256 x 256, épaisseur de coupe, 1,5 mm; TR / TE, de 1500 à 1511 ms; Facteur RARE, 8; flip Angle, 180 °) pour trouver l'emplacement de la commissure antérieure, et aligner les images ultérieures à cet endroit. Alignez huit tranches scans seule balle GE-EPI (FOV, 2,56 x 2,56 cm ^2; la taille de la matrice, 96 x 96, reconstruit à 128 x 128, l'épaisseur de la tranche, 1mm; TR / TE, de 1000 à 1014 ms) à ce point avec orientation coronale.
3. Pour les analyses fonctionnelles, utiliser 70 balayages consécutifs PEV avec 1 seconde résolution temporelle synchronisée à la sortie de stimulation, mis à 20 secondes de repos, 10 stimulation de sec, puis 40 secondes de repos. Prévoir un minimum de 90 secondes entre les scans pour permettre la récupération neurovasculaire. Acquérir plusieurs balayages répétés à chaque paramètre de stimulation pour améliorer le rapport signal-sur-bruit en faisant la moyenne. Utilisez une série de scans factices (généralement 4-8) Immédiatement avant le balayage de la réduction du bruit. Confirmez la réponse BOLD au moment de l'acquisition d'image pour assurer le succès de l'expérience en utilisant la méthode décrite dans l'article 4, que la moyenne, coregistration et crâne-froid peuvent être ignorés dans ce cadre.
4. Après la numérisation fonctionnelle est terminée, utilisez une séquence pondérée en T2 RARE écho de spin (FOV, 2,56 x 2,56 cm ^2, la taille de la matrice, 256 x 256, épaisseur de coupe, 1 mm; TR / TE, 2500/33 ms; moyennes, 8 ) pour mesurer la position anatomique de l'électrode in vivo. Acquérir des coupes coronales et sagittales multiples pour mesurer la pointe de l'artefact de l'électrode le long antérieure / postérieure, axes ventrales médianes / latérales et dorsales / et confirmer le placement des électrodes. Microscopie à haute résolution par résonance magnétique (FOV, 1,8 x 1,28 cm, la taille de la matrice, 360 x 256, l'épaisseur de la tranche, 0,5 mm; TR / TE, 2500/12.6 ms; facteur RARE, 8; moyennes, 280) peuvent être utilisés pour examiner la emplacement précis de l'appareil de l'électrode après avoir retiré ce qui concerneaux structures neuroanatomiques proximité et de confirmer l'exactitude de positionnement des électrodes ^3.

4. IRMf Traitement et analyse des données

La quatrième étape est le traitement et l'analyse des données d'IRMf, y compris la production des cartes de réponse et de calcul pour cent BOLD changement de signal. Les programmes personnalisés s'exécutant dans un environnement informatique (par exemple MATLAB) ou des outils logiciels IRMf commerciales (p. ex. SPM, FSL, ou AFNI) peuvent être utilisés.

1. Commencez avec l'image recalage et la moyenne des données de première intra-sujet par fréquence, suivie par toute-sujet. Remarque: Nous accomplissons cela en utilisant des codes de SPM.
2. Effectuer crâne de décapage pour enlever le tissu nonbrain utilisant région définie manuellement d'intérêt (ROI) avec le signal seuil. Algorithmes crâne décapage automatiques peuvent être utilisés.
3. Dresser des cartes de réponse en calculant le coefficient de corrélation de la relation entre res BOLDponse au fil du temps et le paradigme de stimulation pour chaque voxel. Retarder le paradigme plusieurs secondes pour tenir compte des retards dans la réponse hémodynamique peut être nécessaire. Réglez le niveau significatif à P <0,05 après correction de Bonferroni. D'autres méthodes statistiques peuvent être utilisées. Correction pour les comparaisons multiples en utilisant la théorie des champs aléatoires ou correction au niveau du groupe sur la base de Gauss champ aléatoire peut être effectué à la place de la correction de Bonferroni pour une analyse plus sensible ^4. Remarque: Le délai hémodynamique peut varier en fonction des zones cérébrales ciblées, des agents pharmacologiques utilisés, et des paramètres physiologiques. Il est essentiel de contrôler ces paramètres afin d'éviter la variabilité intra-sujet et inter-sujets.
4. Quantifier la réponse BOLD en définissant un retour sur investissement pour extraire des données temps-cours. La moyenne de la variation du signal de pour cent pour tous les voxels à l'intérieur de la même structure anatomique. Analyse voxel-sage à l'aide du modèle linéaire général peut également être utilisé ⁵.

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Résultats

Des données fonctionnelles représentatives ont été acquis selon le protocole ci-dessus dans un seul rat avec une électrode de stimulation implantée sur le noyau sous-thalamique sur le côté droit. Une illustration de la configuration essentielle pour l'acquisition d'images IRMf DBS est fournie à la figure 1. La stimulation a été appliqué en accord avec le protocole ci-dessus, avec une amplitude de 0,3 mA, la fréquence de 130 Hz et la durée d'impulsion de 0,09 ms. Activation robu...

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Discussion

Simultanée DBS et IRMf représente une boîte à outils expérimental prometteur pour l'identification et la caractérisation des réponses globales en aval à la stimulation des circuits neuronaux, in vivo. L'avantage majeur de cette technique par rapport aux autres outils disponibles, tels que les enregistrements électrophysiologiques, réside dans le caractère relativement impartiale de l'IRMf, où une zone vaste et diversifié du tissu cérébral peut être examiné pour la réactivité de DB...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)