Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

Résumé

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Nous décrivons ici une méthode synthétique qui combine à la fois divisée et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un une bille bibliothèque d'un composé de PTA.

Résumé

Peptidomimetics sont d'excellentes sources de ligands protéiques. La nature oligomères de ces composés nous permet d'accéder à de grandes bibliothèques de synthèse sur phase solide en utilisant la chimie combinatoire. Une des classes les plus étudiés de peptidomimétiques est peptoids. Les peptoïdes sont faciles à synthétiser et ont été montrés pour être résistant à la protéolyse et de la cellule-perméable. Au cours de la dernière décennie, de nombreux ligands de protéines utiles ont été identifiés par criblage de banques de peptoïdes. Cependant, la plupart des ligands identifiés dans les bibliothèques peptoïdes ne s'affichent pas une affinité élevée, à de rares exceptions. Cela peut être dû, en partie, à l'absence de centres chiraux et des contraintes conformationnelles des molécules peptoïdes. Récemment, nous avons décrit une nouvelle voie de synthèse pour accéder peptides amides tertiaires (APE). PTA sont une superfamille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides, des peptoïdes et les peptides N-méthylés. Avec des chaînes latérales sur les deux α-carbone et des atomes d'azote principaux de la chaîne,la conformation de ces molécules sont grandement limitée par encombrement stérique et 1,3 allylique souche. (Figure 1) Notre étude suggère que ces molécules d'ATP sont très structurés en solution et peuvent être utilisés pour identifier des ligands protéiques. Nous croyons que ces molécules peuvent être une source future de ligands protéiques de haute affinité. Ici, nous décrivons la méthode de synthèse combinant la puissance de deux split-et-piscine et stratégies sous-monomères pour synthétiser un échantillon d'un cordon d'un composé (OBOC) bibliothèque de PTA.

Introduction

Sont des composés peptidomimétiques qui imitent la structure des peptides naturels. Ils sont conçus pour conserver l'activité biologique, tout en surmontant certains des problèmes associés aux peptides naturels, y compris la perméabilité cellulaire et la stabilité contre la protéolyse ^1-3. En raison de la nature oligomère de ces composés, de grandes bibliothèques de synthèse peuvent être facilement accessibles par des voies de synthèse de sous-monomères ou monomères ^4-7. Une des classes les plus étudiées de peptidomimétiques est peptoids. Les peptoïdes sont des oligomères de glycines N-alkylés qui peuvent être facilement synthétisés en utilisant une stratégie de sous-monomère ^{8, 9.} Beaucoup de ligands de protéines utiles ont été identifiés avec succès de criblage de grandes banques de peptoïdes synthétique contre des cibles de protéines ^{1, 10-14.} Néanmoins, "hits" identifiés dans les bibliothèques peptoïdes archives rarement très haute affinité vers des cibles protéiques ^1,10-14,22. Une major différence entre les peptoïdes et les peptides naturels est que la plupart des peptoïdes n'ont généralement pas la capacité de former une structure secondaire en raison de l'absence de centres chiraux et des contraintes conformationnelles. Pour résoudre ce problème, plusieurs stratégies ont été développées au cours de la dernière décennie, en grande partie en se concentrant sur ​​la modification des chaînes latérales contenues sur les principaux atomes d'azote de la chaîne ^15-22. Récemment, nous avons développé une nouvelle voie de synthèse d'introduire des chaînes naturelles latérales d'acides aminés sur un squelette peptoïde pour créer peptides amides tertiaires ^23.

Peptides amides tertiaires (APE) sont une famille de peptidomimétiques qui incluent, mais ne sont pas limités à des peptides (R ₂ = H), les peptoïdes (R ₁ = H) et les peptides N-méthylés super (R ₁ ≠ H, R ₂ = Me) . (Voir Figure 1) Notre voie de synthèse emploie des acides aminés naturels comme source de chiralité et des chaînes latérales sur le45; carbone, et les amines primaires disponibles dans le commerce pour fournir les N-substitutions. Par conséquent, un espace chimique plus grande que celle des peptides simples, des peptoïdes ou des peptides N-méthylés peuvent être explorées. Spectres de dichroïsme circulaire ont montré que les molécules d'ATP sont très structurés en solution. Caractérisation de l'un des complexes protéiques PTA-montre bien que les contraintes de conformation de PTA sont nécessaires pour la liaison. Récemment, nous avons également découvert que certaines des molécules d'ATP possèdent une meilleure perméabilité cellulaire que leurs homologues de peptoïdes et de peptides. Nous croyons que ces bibliothèques de PTA peuvent être une bonne source de ligands de haute affinité pour les protéines cibles. Dans cet article, nous allons discuter de la synthèse d'un échantillon d'une bille un composé (OBOC) bibliothèque de PTA dans les détails avec quelques meilleures conditions pour le couplage et le clivage de ces composés.

Protocole

1. Bases de Split-et-piscine Synthèse

Afin de générer efficacement un grand nombre de composés sur la phase solide, la synthèse split-and-pool est souvent utilisé comme une stratégie générale. Comme le montre la figure 4, de Tentagel perles sont d'abord séparée en trois parties. Chaque portion est mis à réagir avec un réactif différent, la génération du premier résidu sur des billes. Après la première réaction, les trois parties sont regroupées, mélangés, et ensuite divisés à nouveau en trois portions. Chaque partie sera à nouveau réagir avec un réactif différent, la génération du second résidu sur des billes. Après deux étapes split-et-piscine, neuf composés sont générés.

Dans la synthèse de sous-monomère, les perles sont d'abord divisées en plusieurs parties pour réagir avec différents acides bromo, en présence d'un réactif de couplage. Après lavage avec solvant, toutes les perles seront réunies et mélangées, puis de nouveau divisé en plusieurs parties pour réagir avec différentsdes amines primaires. Après amination, toutes les perles sont regroupées et lavées soigneusement, remplir un monomère complet sur chaque perle. Ce processus peut être répété jusqu'à ce que la diversité souhaitée est atteinte.

2. Préparation de l'acide bromure de Natural acides aminés

Dans la synthèse de sous-monomère, la synthèse de chaque monomère est divisé en deux étapes distinctes: 1. Couplage du bromure et de l'acide 2 amination avec des amines primaires (Figure 2).. Afin de synthétiser un amide tertiaire des peptides, des bromures d'acides chiraux avec des chaînes latérales sur le carbone alpha sont préparés à partir d'acides aminés naturels. Nous décrivons ici le procédé de transformation d'un acide aminé naturel dans le bromure d'acide correspondant avec une fidélité élevée stéréo. Nous utilisons l'alanine, par exemple; d'autres acides aminés, y compris la serine, la thréonine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'asparagine, la glutamine, la glycine, la valine, l'isoleucine, la phénylalanine peuvent également être transformés en acides bromes sous conditio semblablens. A noter que certains des acides aminés avec des groupes fonctionnels tels que le phénol, la guanidine et amine ont besoin d'être protégés avant la transformation. La configuration de la réaction est représentée à la figure 3.

Mesures de sécurité: Pour les réactions suivantes impliquant HBr, _NaNÛ2 et autres produits chimiques corrosifs / toxiques, équipement de sécurité approprié comme des lunettes de protection, blouse de laboratoire et des gants résistant aux produits chimiques sont nécessaires. Toutes les réactions doivent être effectuées dans une hotte par le chimiste expérimenté.

1. Ajouter 370 ml d'eau dans 630 ml de solution de HBr à 48% pour préparer 1 L d'une solution de HBr à 30%. Ajouter 500 ml d'éthylène glycol dans un récipient de bain de 1 L; ajouter de la neige carbonique pour maintenir la température à -10 ° C. Attention: solution de HBr 48% est fortement acide et corrosif, à manipuler avec précaution. Lire la fiche signalétique avant l'utilisation.
2. Ajouter D-alanine (8,9 g, 0,1 mol) et du KBr (11,9 g, 0,1 mol) à un ml à trois cols de flacon à fond rond 250 avec un barreau d'agitation magnétique. Ajouter 100 ml, et le HBr à 30% préparée dans le til étape précédente. Placer le ballon dans le bain de glycol d'éthylène préparé à l'étape 2.1 et de maintenir la température à -10 ° C. Bulle d'argon à travers une aiguille longue à partir du fond de la fiole pendant 10 minutes comme le montre la figure 3. Agiter la solution avec la barre d'agitation magnétique à 300 tours par minute.
3. Dissoudre _NaNÛ2 (8,28 g, 0,12 mole) dans un bécher de 100 ml avec 20 ml d'eau. Ajouter la solution dans l'ampoule à brome à égalisation de pression et de sceller l'ampoule de coulée avec un septum. Tourner lentement la vanne de l'ampoule de coulée et de laisser la solution de NaNO ₂ goutte dans le ballon. Commander la vanne pour régler le taux d'égouttage à environ 2 gouttes par seconde. Maintenir l'agitation à 300 tours par minute et garder le bullage d'argon à partir du fond de la fiole. Le ballon doit être conservé dans de l'éthylène glycol au bain de -10 ° C jusqu'à ce que tout NaNO ₂ est ajouté. Attention: Cette étape génère de la chaleur et de gaz lors de l'ajout de _NaNÛ2 solution. Taux d'égouttement doit être soigneusement concontrôlé et l'ensemble du système doit être ouvert par la sortie de l'argon.
4. Gardez en remuant pendant 3 h plus et laissez la température se réchauffer de -10 ° C à la température ambiante. La solution obtenue doit être limpide à jaune clair; si la couleur est trop sombre, appliquer le vide pour éliminer les oxydes d'azote en excès et possible Br ₂ généré lors de la réaction.
5. Extraire le produit à partir de la solution avec 3 x 35 ml d'éther diéthylique à l'aide d'un entonnoir d'extraction. Mélanger la phase organique et laver avec de la saumure saturée. La phase organique peut également être lavé avec une petite quantité de _NaHCO3 avant de laver avec de la saumure pour éliminer la couleur si elle est sombre. Sécher la phase organique sur Na ₂ SO ₄ pendant 6 heures.
6. Filtrer le Na ₂ SO ₄ et évaporer le solvant sous vide, le produit brut devrait être obtenue aussi clair à huile jaune pâle. Le produit brut peut encore être purifié par distillation à 115 ° C, 3 mm Hg, ou parcolonne de silice avec un mélange 03:01 d'hexane: acétate d'éthyle.
7. Le produit pur est obtenu sous forme d'huile claire, 6,6 g (rendement 74%), la densité = 1,69 g / ml, [α] D20 = 24 ° (méthanol), RMN ¹ H (400 MHz, _CDCl3) δ 4.41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). Dans le cas de (S)-2-bromopropanoic acide-d ₄ (préparé à partir d _{4-L-alanine),} produit pur est obtenu sous forme d'huile claire, rendement 78%, densité = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (méthanol). RMN ¹ H, aucun signal significatif de H est observée. ESI-MS ^- [M-1] ^- = 155,1 (devraient 154,97). Pour (S)-4-méthylpentanoïque acide 2-bromo (préparé à partir de L-leucine en utilisant la même procédure) produit pur est obtenu sous forme d'huile limpide, rendement 89%, [α] D20 = +37 ° (methanol), ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3) δ 4.30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). Dans le cas de (S)-2-bromo-3-phenylpropanoic acide (préparée à partir de la L-phénylalanine en utilisant la même procédure) produit pur est obtenu sous forme d'huile jaune pâle, rendement 72%, [α] D20 = +17 ° (methanol), RMN ¹ H (400 MHz, _CDCl3) δ 7,38 - 7.19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H).

3. Marquage isotopique de l'alanine transaminase Utilisation

Dans la synthèse de la banque combinatoire, en particulier dans la synthèse split-and-pool d'une bille un composé (OBOC), les bibliothèques, la quantité de composé qui peut être obtenu à partir de chaque bourrelet est relativement faible. (Typiquement une pmol à 10 nmol). De plus, la spectrométrie de masse est largement utilisé pour l'identification et la caractérisation du composé final en raison de sa grande sensibilité. Pour utiliser la spectrométrie de masse pour déterminer la stéréochimie absolue aux centres chiraux des produits finaux de PTA, les énantiomères de l'acide bromo doivent être isotoPically étiquetés avant utilisation. Nous décrivons ici la méthode d'utilisation de transaminase et D ₂ O à étiquette L-alanine.

1. Dissoudre la L-alanine (300 mg, 3,36 mmol) avec 10 ml de D ₂ O dans un tube de 50 ml en polyethylene. Ajouter α-cétoglutarate (10 mg, 0,068 mmol) en tant que co-substrat. Chauffer le tube à 37 ° C et ajuster le pD de 8.5 à 8.7 en utilisant une soution 1 M NaOD. Remarque: pD est déterminée par des bandelettes de test de pH. Traditionnel compteur électro pH équipée avec électrode de verre sélectif pour H ⁺ peut donner incorrect lire D ^+.
2. Ajouter alanine transaminase (0,1 mg, CE 2.6.1.2 de coeur de porc, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) à la DP 08.05 à 08.07, 37 ° C la solution préparée à partir de l'étape précédente. Mettre le tube dans un incubateur à 37 ° et incuber toute la nuit avec une agitation douce, de 10 à 30 tours par minute est préféré.
3. Après une nuit d'incubation, prendre 0,5 ml de la solution S D ₂ et de vérifier la progression de la réaction par RMN ^1H. Tous les signaux des protons d'unLanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), RMN ¹ H 400 MHz, devrait être grandement supprimées en raison de deutération. Plus de 98% du proton doit être échangé pour le deutérium, comme décrit précédemment ^23. Remarque: D ₂ O peut être partiellement récupéré par distillation, si la réaction est effectuée à grande échelle (> 200 ml de D ₂ O). Normalement, de 60% ​​à 80% de D ₂ O peut être distillé à partir de la solution.
4. Congeler la solution ci-dessus avec de l'azote liquide et lyophiliser l'aide d'un lyophilisateur pour obtenir blanc deutéré L-alanine poudre.

4. Synthèse des peptoïdes Linker Région

La région de liaison n'est pas nécessaire pour la synthèse de la bibliothèque de PTA. Toutefois, afin d'éviter le bruit de fond élevé dans la plage de poids moléculaire plus faible (100 à 600) de la spectroscopie de masse MALDI et d'améliorer l'ionisation des composés, un groupe de liaison peptoïde avec plusieurs résidus polaires est souvent utilisé. Cette peptoïdique linker peut être synthétisé par la procédure de synthèse peptoïdique standard. Ici, nous allons synthétiser un pentamère de N-méthoxy-éthyl glycine dans le segment de liaison (comme le montre la figure 5).

1. Gonfler 90 um avec des perles de Tentagel RAM lieur (1 g, 0,27 mmol / g) dans 10 ml de DMF pendant 3 h dans un réacteur à seringue de 12 ml avec une agitation douce.
2. Égoutter le DMF du réacteur et ajouter la solution de pipéridine dans le DMF 10 ml de 20% de déprotéger le groupe fmoc de l'amide linker Rink. Agiter les billes avec une solution de pipéridine à 20% pendant 30 min. Laver avec du DMF 5x pour enlever toute la pipéridine.
3. Prenez quelques perles à partir de la seringue et le tester avec le test de chloranile. Perles devraient virer au brun foncé (test de chloranile positif pour amine primaire) si fmoc est déprotégé avec succès.
4. Préparer les solutions suivantes: 1. 20 ml, 2 M solution acide bromoacétique / DMF; 2 20 ml, de solution 2 M DIC / DMF.; 3. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / solution de DMF.
5. Ajouter 5 ml de solution M d'acide / DMF 2 bromoacétique àles perles, secouez doucement. Ajouter ensuite 5 ml de solution 2 M DIC / DMF pour les perles; sceller la seringue avec le piston et le mettre sur le shaker. Agiter pendant 10 min.
6. Laver les billes avec du DMF à fond. Ajouter 2 ml de solution 1 M méthoxyéthylamine / DMF préparés à partir de l'étape 4.4 pour les billes. Sceller la seringue avec le piston et le secouer sur l'agitateur pendant 30 minutes.
7. Laver les billes avec du DMF 5x. Vérifiez quelques perles avec le test de chloranile, si positifs (perles deviennent bleus), puis passez à l'étape suivante. Sinon, répétez l'étape 4.6.
8. Répétez les étapes 4.5 à 4.7, 4x pour compléter le pentamère.

. 5 Split-et-piscine Synthèse de PTA Bibliothèque avec (R) - et (S)-2-bromopropionique acides

Nous décrivons ici la synthèse d'une petite bibliothèque de PTA avec une diversité théorique de 9261 composés en utilisant la 1 g de perles de l'étape 4.8. Notez qu'un TentaGel perle 90 um contient environ 2,9 millions de perles par gramme; donc la redondance desla bibliothèque sera de 2,9 x 10 ^6/9261 = 312 copies. Nous allons utiliser l'acide bromoacétique, (R)-2-bromopropanoic et isotopique marqué (S)-2-bromopropanoic acide-d ₄ comme les acides, et 7 amines différentes (A1 ~ A7, voir Figure 5 pour les détails) pour l'amination. réacteurs de seringue et un collecteur de vide sont utilisés pour effectuer la synthèse.

1. Ajouter 10 ml de DCM 01:01: DMF à la seringue de l'étape 4.8; utiliser une pipette de 1000 pi avec une pointe de pipette tronquée de diviser toutes les perles 1 g uniformément dans trois réacteurs 5 ml de la seringue. Étiqueter comme B (acide bromo-acétique), R ((R)-2-bromopropanoic) et S ((S)-2-bromopropanoic acide _4-d). Lavez tous les 3 seringues avec du DCM 3x, et laver les seringues étiquetées avec R et S avec THF anhydre 3x, laver la seringue marqué avec B avec du DMF 3x.
2. Seringue R et S. Couplage BTC d'acide bromopropanoic.
   1. Préparer une solution fraîche BTC / THF. Ajouter unnviron 200 mg de la CTB dans le flacon dans une hotte, sceller avec le bouchon. Peser la quantité de CTB dans le flacon. Calculer la quantité de solvant nécessaire et ajouter THF anhydre dans le flacon pour faire un / ml solution BTC / THF 20 mg.
   2. Préparer le acides bromo / mélange BTC. Ajouter (R)-2-bromopropanoic acide (89 ul, 0,95 mmol) et de (S)-2-bromopropanoic acide _d-4 (89 ul, 0,95 mmol) dans deux petits flacons séparément. Pour chaque flacon, ajouter 5 ml de la solution à 20 mg / ml de CTB / THF ci-dessus. Sceller les deux flacons et les mettre dans le congélateur à -20 ° C pendant 20 min.
   3. Ajouter 1125 pi, 02h01 THF / DIPEA (750 pi THF, 375 pi DIPEA, 2,2 mmol) à la seringue R et S séparément. Mélanger les billes avec la pointe de pipette. Laissez-les reposer pendant 5 min.
   4. Prenez les deux refroidi acides bromo / mélanges BTC de l'étape 5.2.2, ajouter le 2,4,6-triméthylpyridine (356 pi, 2,7 mmol) à chacun des flacons. Un précipité blanc se forme immédiatement. Appliquer la suspension correspondant directementles perles rendu basique (seringue de R et S à l'étape 5.2.3) dès que possible et puis les mettre sur un agitateur à secouer moins de 120 tours par minute pendant 2 heures.
      Remarque: La solution dans les réacteurs de la seringue doit être une suspension jaunâtre pâle pendant tout le cours de la réaction. Une couleur plus foncée est une indication d'une chaleur excessive dégagée lors de l'addition initiale de la solution de chlorure d'acide. Ceci peut être résolu par un refroidissement plus bas ou le diluer les acides bromo / mélange BTC.
3. Seringue B. Couplage de l'acide bromacétique à la DIC
   1. Préparer un frais de 20 ml, solution acide bromo-2 M / DMF. Préparer un 20 ml, solution à 2 M DIC / DMF.
   2. Ajouter 2 ml de solution M d'acide bromoacétique / DMF 2 à seringue B, secouer doucement. Ajouter 2 ml d'une solution 2 M DIC / DMF à la seringue B, secouer doucement.
   3. Mettez seringue B sur le même shaker comme seringue R et S , L'agiter pendant 2 h. A noter que la réaction de couplage de l'acide bromacétique / DIC est effectuée dans les 30 minutes; durée de réaction prolongée est pour la commodité de la synthèse split-and-piscine.
4. Après 2 heures, prendre la seringue R, S et B de l'agitateur. Lavez les trois seringues à fond avec DCM 5x. Ensuite laver avec du DMF 5x. A noter que la seringue R et S ne peuvent pas être lavés avec du DMF, avant d'être lavée avec du DCM ou du THF en premier.
5. Piscine toutes les perles de seringues R, S et B dans un réacteur de 12 ml seringue. Lavez toutes les perles avec du DMF 5x.
6. Ajouter 10 ml de DCM 01:01: DMF à la seringue; utiliser une pipette de 1000 pi avec une pointe de pipette tronquée de diviser toutes les perles uniformément dans 7 différents seringues de 2 ml, étiqueter comme A1-A7.
7. Amination. Préparer 10 ml, 2 solutions amine / DMF primaires M pour chacun des sept amines énumérées dans la Figure 5. Ajouter 5 ml d'EACsolution d'amine h à la seringue A1-A7 correspondant. Incuber les 7 seringues dans un incubateur à 60 ° C sous agitation pendant une nuit.
8. Après incubation, laver toutes les perles soigneusement avec du DMF. Prenez un peu de billes de chaque seringue et vérifier avec le test de chloranile. Si les perles tournent au vert (positif) à moins de 3 minutes, passez à l'étape suivante. S'il est négatif, répétez l'étape 5.7 pour les seringues négatifs.
9. Répétez les étapes 5.1 et 5.8 2x pour compléter le trimère. Étape facultative: Après chaque cycle, nous vous recommandons de vérifier la qualité de la synthèse par spectroscopie de masse comme décrit ci-dessous. Tous les 9261 composés sont synthétisés maintenant sur des billes de Tentagel que bibliothèque OBOC.
10. Mass confirmation spectroscopique des APE.
    APE sont des oligomères fortement structurés et possèdent de nombreuses caractéristiques communes des peptides N-méthylés. L'un des problèmes communs de synthèse en phase solide de peptides N-méthylés est la dégradation de l'acide au cours de TFA clivage. Pour supprimer la dégradation de l'acide, le clivage de molécules comme la cyclosporine desupport solide est souvent réalisée à basse température. Nous avons comparé différentes conditions clivage pour cliver des molécules d'ATP à partir du support solide. Nous avons constaté que, en général, à basse température et la concentration de TFA réduite pourrait effectivement supprimer la dégradation de l'acide et de fournir des composés purs.
    1. Préparer 10 ml de solution 01:01 TFA / DCM dans un tube de 15 ml. Scellez le tube et le mettre dans un congélateur à -20 ° C pendant 20 min.
    2. Laver les billes qui doivent être clivées avec du DCM 5x. Agiter les billes dans du DCM pendant 15 minutes et laver les billes de nouveau avec du DCM 5x.
    3. Égoutter le DCM de la seringue. Utiliser un microscope optique et une pipette à pointe tronquée pour transférer chaque bille individuelle dans une plaque de 96 puits, une bille par puits.
    4. Recouvrir la plaque de 96 puits avec une lamelle. Mettre la plaque dans un congélateur à -20 ° C pendant 15 min.
    5. Prendre la solution 01:01 TFA / DCM refroidi provenant de l'étape 5.10.1 et ajouter 20 ul à chaque puits qui contient une bille. Mettez le couvre-retour et d'unité centralet la plaque à 96 puits sur un agitateur à 20 ° C le réfrigérateur.
    6. Agiter pendant 20 min. Prenez la plaque de 96 puits et de décoller sur la lamelle. Séchez le TFA / DCM de chaque puits par de l'air ou de l'argon au-dessus de soufflage. Si plus de 10 perles sont clivés, un speedvac peut être utilisé pour sécher le mélange TFA / DCM à partir de l'ensemble de la plaque. Notez que, à ce stade, pas tous les composés sont clivé les perles, mais les composés clivés devrait être plus que suffisant pour effectuer l'analyse de spectrométrie de masse.
    7. Ajouter 20 ul 06:04 ACN: H ₂ O solution pour dissoudre les composés clivés de chaque puits. Repérer les 0,6 ul de chaque solution de composé avec 0,6 ul CHCA MALDI matrice sur la plaque MALDI.
    8. Utiliser la spectrométrie de masse MALDI pour déterminer le poids moléculaire et séquence (MS / MS) de chaque composé.

6. Chloranile test

1. Préparer les réactifs suivants frais pour chaque test. Solution A: 2% chloranile (CAS: 118-75-2) dans le DMF. SolutionB: 2% acétaldéhyde (CAS: 75-07-0) dans le DMF.
2. Mélanger 100 ul de solution A avec 100 ul de solution B avant le test dans un tube de 1,5 ml; déposer les perles dans et agiter doucement. Si les perles deviennent bleus dans les 5 min, il indique la présence d'une amine secondaire sur la surface des billes. Les amines primaires donnent une couleur brun foncé au lieu de virer au bleu.

Résultats

Ici, nous montrons trois spectres MALDI représentatifs d'un trimère de PTA de liaison. Comme le montre la figure 6A, lorsqu'il est clivé à température ambiante en utilisant 50% de solution de TFA / DCM, une dégradation significative est observée. Sur la figure 6A, un sommet 593 et 484 correspondent au segment de liaison et le trimère de PTA, respectivement, montrent que la molécule entière a été synthétisé avec succès le bourrelet mais dégradée lors du clivage. ...

Discussion

Peptides amides tertiaires (APE) sont une superfamille d'oligomères peptidomimétiques. Outre les peptides bien étudiés, peptoids et les peptides N-méthylés, une grande partie des composés de cette famille reste peu étudié, majorly raison d'un manque de méthode de synthèse pour accéder générales peptides N-alkylés. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour synthétiser PTA avec des blocs de construction chiraux dérivés d'acides aminés. Auparavant, nous avons signalé à utiliser un nou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6 trimethylpyridine	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
48% HBr water solution	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
Acetaldehyde	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
Acetonitrile	Fisher	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
Benzylamine	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC)	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
Chloranil	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-Alanine	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM)	Fisher	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF)	Fisher	BJ-076-4	CAS:68-12-2
Ethylene glycol	Oakwood	44710	CAS:107-21-1
Isopentylamine	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-Alanine	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone	Sigma-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC)	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
Piperidine	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
Piperonylamine	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
Propylamine	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
α-Ketoglutarate	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker	Rapp-Polymere	S30023
Alanine transaminase	Roche	10105589001	AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator	New Brunswick Scientific	Innova44
NMR	Bruker	400 MHz
MALDI mass spectrometer	Applied Biosystems	4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer	SP Scientific	VirTis benchtop K
Syringe reactor	INTAVIS	Reaction Column	3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold	Promega	A7231	Vac-Man