Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l'isolement et l'évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Résumé

leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d'un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l'impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules.

Résumé

Dysfonctionnement mitochondrial est connue pour jouer un rôle important dans un certain nombre de conditions pathologiques telles que l'athérosclérose, le diabète, le choc septique, et les maladies neurodégénératives, mais l'évaluation des changements dans la fonction bioénergétique chez les patients est un défi. Bien que les maladies telles que le diabète ou l'athérosclérose présente cliniquement atteints d'insuffisance d'organe spécifique, les composantes systémiques de la pathologie, tels que l'hyperglycémie ou l'inflammation, peuvent altérer la fonction bioénergétique dans les leucocytes ou les plaquettes de circulation. Ce concept a été reconnu depuis un certain temps, mais son application généralisée a été entravée par le grand nombre de cellules primaires nécessaires à l'analyse bioénergétique. Cette limitation technique a été résolu par la combinaison de la spécificité des techniques d'isolement de billes magnétiques, des techniques d'adhérence cellulaire, qui permettent aux cellules d'être fixés sans activation de microplaques, et la sensibilité des nouvelles technologies conçue pour un débit élevé micrespirométrie ROPLATE. Un exemple de cet appareil est un analyseur de flux extracellulaire. Cette instrumentation utilise généralement l'oxygène et le pH sondes sensibles pour mesurer les taux de variation de ces paramètres dans les cellules adhérentes, qui peuvent ensuite être liés au métabolisme. Ici, nous détaillons les méthodes d'isolement et de placage de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes, sans activation, à partir de sang humain et de l'analyse de la fonction mitochondriale bioénergétique dans ces cellules. En outre, nous montrons comment la poussée oxydative dans les monocytes et les neutrophiles peut aussi être mesurée dans les mêmes échantillons. Puisque ces méthodes utilisent seulement 8-20 ml de sang humain, ils ont le potentiel pour le suivi réactif génération et la bioénergétique des espèces d'oxygène dans un cadre clinique.

Introduction

Surveillance de la santé métabolique de cellules immunitaires (monocytes, lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes) du sang a été reconnu depuis un certain temps comme un outil de diagnostic potentiellement utile pour évaluer la santé bioénergétique globale d'un individu. Il existe un corps émergeant de la littérature attribuer un certain nombre de maladies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives à un dysfonctionnement mitochondrial ^1,2. Ceci est d'importance clinique depuis un dysfonctionnement mitochondrial peut initier une série d'événements cellulaires qui favorisent les voies de signalisation pro-inflammatoires, ou conduisent à la mort cellulaire. Plusieurs études ont caractérisé la fonction mitochondriale des cellules et les plaquettes sanguines mononucléaires périphériques dans des conditions telles que la fibromyalgie, le diabète, un choc septique, et la maladie d'Alzheimer ^7.3. Par exemple, une étude récente a évalué les bioénergétique des plaquettes comme un marqueur de la fonction mitochondriale et a constaté que les plaquettes de type 2 diabetic patients avaient diminué la consommation d'oxygène des mitochondries ^7,8. A partir de ces conclusions et d'autres, il est clair que les monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes peuvent servir de marqueurs de substitution de l'évolution de la bioénergétique dans des conditions pathologiques puisqu'ils enquête la circulation systémique et peuvent refléter des changements métaboliques locaux et mondiaux. Pour déterminer si cette approche a une valeur pronostique ou diagnostique une méthode à haut débit d'analyse et une méthode cohérente pour la préparation de cellules est nécessaire.

Les méthodes pour mesurer la fonction mitochondriale dans les leucocytes et les plaquettes ont déjà participé isolement des mitochondries ou l'évaluation de bioénergétique cellulaire dans des cellules intactes ^4,9. L'avantage de l'évaluation bioénergétique cellulaire en utilisant un flux extracellulaire (XF) d'analyseur est que la fonction mitochondriale dans les cellules peut être établie avec des substrats endogènes et des paramètres respiratoires tels que fuite de protons et respiratoire maximalecapacité peut être déterminée. Nous et d'autres avons utilisé cette technologie pour montrer que les profils bioénergétiques dans les plaquettes, les monocytes et les lymphocytes isolés à partir de sang humain peuvent être établis et comparés entre les différents types de cellules ^8. En outre, deux des neutrophiles et des monocytes possèdent une capacité oxydative dans laquelle oxydases NADPH sont activés et consomment de l'oxygène pour former la superoxyde. Surtout, cette voie est un élément clé de l'immunité innée et est modulée par l'inflammation systémique. Par exemple, il a été montré que les variations de la capacité oxydante de salve sont associés à diverses maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, l'arthrite, et des infections récurrentes ^10,11. Actuellement, il n'y a pas de tests quantitatifs à haut débit disponibles pour mesurer la poussée oxydative dans des échantillons cliniques. Ceci est important étant donné que la caractérisation de la capacité oxydative des neutrophiles et des monocytes peut également servir d'outil de diagnostic important pour plusieurs pathologies.

Les principaux défis techniques ont été peu sensible pour la mesure de la consommation d'oxygène en utilisant des techniques polarographiques classiques et la nécessité d'utiliser des cellules fixées lors de l'utilisation des techniques de microplaque fluorométriques plus sensibles. Dans cette vidéo pratique, nous décrivons la solution à ces problèmes techniques. Nous détaillons les méthodes pour l'isolement, le placage et la mesure de la bioénergétique de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes et la poussée oxydative des monocytes et des neutrophiles du sang humain. Cette méthode est appropriée pour l'évaluation clinique de la bioénergétique et oxydatif pour les enquêteurs qui ont l'accès à une population de patients, et la capacité d'obtenir des échantillons de sang frais.

Protocole

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte de sang, l'isolement et l'analyse ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université d'Alabama à Birmingham.

Une. Isolement cellulaire (modification de Protocole Sigma-Aldrich Histopaque n ° 1119 et Miltenyi Biotec microbille positive et les protocoles de sélection négative)

1. sang total Centrifugeuse (recueillies dans ACD ou tubes EDTA) à 500 g pendant 15 min dans une centrifugeuse avec un rotor oscillant-seau (accélération = 5-6, et pas de frein).
2. Enlever la couche supérieure qui contient le plasma riche en plaquettes (PRP) avec une pipette de transfert jusqu'à 1 cm reste au-dessus de la couche cellulaire (manteau érythrocytes / leucocytaire). Mettez de côté le PRP à la température ambiante pour un traitement ultérieur.
3. Transférer la couche leuco-plaquettaire à un 50 ml tube conique stérile, diluer à 24 ml avec de base RPMI ou au moins 4x le volume de départ de la couche leuco-plaquettaire.
   Remarque: La moitié supérieure de la couche de RBC peuvent have être inclus, bien que cela se traduira par l'augmentation du volume du milieu RPMI proportionnellement.
4. Préparer le gradient de densité en utilisant une faible densité de Ficoll ayant une densité de 1,077 (1,077) pour la couche supérieure et Ficoll à haute densité ayant une densité de 1,119 (1,119) pour la couche inférieure dans trois tubes de 15 ml coniques (3 ml chacune). Pour effectuer cette étape, tout d'abord ajouter 1,077 à chaque tube. L'utilisation d'un 5 ml pipette étroite ajouter 1119 au fond du tube en plaçant la pointe de la pipette sous 1077 et relâchez lentement le réactif sans mélange avec le gradient supérieur. Un total de 6 ml de milieu à gradient de densité doit être présent à ce stade avec une phase visible de la séparation à la marque 3 ml.
5. Utilisation d'une pipette automatique, ajouter 8 ml de sang dilué (de l'étape 1.3) doucement chaque tube gradient en utilisant le réglage de faible puissance pour éviter de perturber les couches de gradient. Le volume total devrait être de 14 ml à cette étape.
6. Tubes à centrifuger à 700 g pendant 30 min à température ambiante (Acceleration 6, pas de frein).
   Note: A ce stade, les trois bandes distinctes de cellules devraient être évidents (Figure 1A). Les bandes supérieures (entre 1077 et plasma) contient des cellules mononucléaires (MNC) et les plaquettes, et la bande du milieu (entre 1007 et 1119) contient des cellules polymorphonucléaires (PMN) et la bande inférieure (ci-dessous 1119) contient des globules rouges.
7. Recueillir le MNC et PMN séparément à l'aide de pipettes en verre stériles sans déranger les autres groupes de cellules. Combiner la population MNC de chaque tube dans un tube conique de 50 ml stérile. Répétez cette opération pour la population PMN ainsi.
8. Ajouter 4 volumes de RPMI à chaque tube contenant les fractions et MNC PMN respectivement pour diluer le gradient de densité.
9. Tubes à centrifuger à 700 g pendant 10 min à température ambiante.
10. Remettre en suspension MNC culot cellulaire et PMN culot cellulaire dans 1 ml de RPMI contenant 0,5% ultra-pure gras sans acide BSA (RPMI-BSA) et de les transférer à stériles tubes de 1,5 ml. Pellet les cellules en utilisant un picofuge de paillasse pour 30sec.
11. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA.
12. Ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD14 dans le tube contenant la fraction MNC pour une sélection positive des monocytes. Pour le tube contenant la fraction de cellules PMN, ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD15 pour la sélection positive de cellules neutrophiles. Incuber chaque suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C.
13. Laver chaque suspension de cellules avec 1 ml de milieu RPMI-BSA et un culot comme précédemment et remettre en suspension chaque culot dans 500 ul de RPMI-BSA.
14. Les cellules marquées sont séparées dans le champ magnétique de la cellule activée tri magnétique (MACS) séparateur. Préparer les colonnes MACS LS (une pour chaque suspension de cellules) en plaçant la colonne de séparation MACS et lavage avec 3 ml de RPMI-BSA avant l'ajout de la suspension de cellules.
15. Après l'application de suspensions cellulaires, laver chaque colonne 3x avec 3 ml de RPMI-BSA médias (assurez-vous de laisser le drai des médiasn complètement entre les lavages). Recueillir la suspension cellulaire accréditive et lavages de colonne dans un tube stérile.
16. Pour isoler les monocytes et les neutrophiles, retirer la colonne du champ magnétique après le lavage final et éluer les cellules sélectionnées positivement dans un tube stérile avec 5 ml de RPMI-BSA en utilisant le piston de la colonne.
17. Pour isoler les lymphocytes granulés la fraction accréditives lavage des multinationales de l'étape 1.15 à 300 g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA. Ajouter 20 ul d'anticorps CD61 et CD235a et incuber la suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C. Répétez la séparation MACS comme avant et collecter le flux mais contenant les lymphocytes.
18. Pour sédimenter les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes fractions, centrifugeuse avant (étape 1.9) et jeter les surnageants. Les culots cellulaires devraient être remises en suspension dans 1 ml extracellulaires flux médias (XF-DMEM) pour le comptage.
    Note: 8 ml de sang entier doivent aboutir à 1-5 x 10 ⁶ monocytes / ml et 5-20 x 10 ⁶ lymphocytes et des neutrophiles / ml.
19. Pour isoler les plaquettes, centrifugeuse PRP (étape 1.2) pour les 8-10 min à 1500 xg à température ambiante. Retirez le plasma et laver culot cellulaire une fois avec 5 ml stériles PBS additionné de 1 pg / ml PGI _2, repellet et suspendre culot final dans 1 ml de tampon PBS-PGI _2.
20. Déterminer la numération plaquettaire par turbidimétrie une fois que les plaquettes sont mises en suspension dans du tampon PBS-PGI ₂ par spectrophotomètre tel que décrit par Walkowiak et al en utilisant l'équation suivante: [6,23 / (2,016 - Abs _800)] - 3,09 x facteur de dilution = # x 10 ^8. plaquettes / ml ^12.

2. Placage des cellules

1. Préparation de Cell-Tak (adhésif de cellule): Ajouter adhésif de cellule de 90 pi à 180 pi diH ₂ 0, 540 ul de 0,1 N bi de sodiumcarbonate (pH 8,0), et ajuster le pH à 7.2 à 7.8 à l'aide de NaOH 1 N. Préparer plaques XF (24 puits, V7 microplaques) en revêtant chaque puits avec 30 pi de colle cellulaire préparé.
   Remarque: L'adhésif de cellule doit être préparé pour chaque utilisation.
2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 20-30 minutes, puis colle cellule d'aspiration et laver les puits avec du PBS deux fois (1 ml / puits).
3. Effectuer un comptage de cellules sur les monocytes isolés, des lymphocytes, des neutrophiles et des plaquettes et amener au volume approprié à l'aide XF-DMEM à permettre à une densité de semis de 250 k cellules / puits pour les monocytes, les lymphocytes et les neutrophiles, et 25 x 10 ⁶ / puits pour les plaquettes. Sinon, pour mesurer la réponse de burst oxydatif, les neutrophiles peuvent être ensemencées à 125K cellules / puits. Le volume d'ensemencement final de chaque suspension cellulaire doit être de 200 pl / puits.
4. Centrifuger la plaque à 200 g pendant 1 sec sans frein. Faites pivoter la plaque de 180 ˚ et centrifuger à nouveau sans frein à 300 x g.
5. Apportez ainsi finale volume à 660 pi avec XF-DMEM et incuber à 37 º C pendant 30 minutes avant l'essai XF. Remarque: Des microphotographies de cellules étalées, avant et après le test peut être utilisé pour assurer le placage adéquate et écarter le détachement des cellules.

3. Préparation d'un 24 puits extracellulaire Flux Essai Plate (XF24)

1. Hydrate XF sonde avec une solution d'étalonnage pour un minimum de 2 heures avant le dosage.
2. Préparer 10x stocks de 0,5 pg / ml, 0,6 uM oligomycine FCCP, et 10 uM antimycine A en XF-DMEM et charge 75 pi de solutions mères dans les ports d'injection de la cartouche dans l'ordre ci-dessus. Si les mesures d'éclatement oxydation doivent être obtenus, l'injection de 10x bilan de 100 ng ml de PMA / peut être injectée après antimycine-A.
3. Calibrer la cartouche hydratée et chargé et effectuer le test XF. Les méthodes détaillées pour l'analyse et l'interprétation de la consommation d'oxygène et le pH des changements ont été décrits dans des publications antérieures ^9,13,14 et sont non-Discussed en détail ici.
4. Après essai XF, aspirer tous, mais les 50 dernières ul de DMEM XF-après dosage pour éviter la perte de cellules de la plaque et ajouter ul RIPA tampon de 50 lyse cellulaire et d'effectuer une analyse des protéines pour la normalisation.

Résultats

Afin d'évaluer les bioénergétique des cellules du sang, le sang total est recueilli à partir de sujets humains par ponction veineuse dans un tube de collecte de Vacutainer EDTA ou ACD. L'isolement des leucocytes et des plaquettes suivants collecte de sang est visualisée sur la figure 1A comme décrit dans le protocole. Des échantillons de sang total sont traités dans les 8 heures de collecte pour éviter la mort des cellules et l'activation. Temps de stockage prolongé de plus de 8 heures n'ont pas été testés, mais peuvent entraîner bioénergétique altérées et moins représentatif des conditions physiologiques. Tubes acide citrate dextrose (ACD-8 ml) et de l'EDTA Vacutainer ont été utilisés pour les isolements cellulaires sans effet observé sur la fonction métabolique de cellules isolées. Les anticoagulants sont nécessaires comme des caillots de réduire le nombre de cellules obtenues, interfèrent avec la formation de la phase correcte au cours de la centrifugation en gradient de Ficoll, et entraînent peu ou pas de plaquettes obtenues dans le sérum centrifugé. Tout le sang représente un biolodanger ical et équipement de protection individuelle doivent être mises en œuvre tout au long de la procédure, même après populations de cellules sont isolées ou lysats cellulaires sont générés. Les échantillons doivent être éliminés conformément aux normes d'élimination des déchets humains de l'institution.

Le sang total est centrifugé pour séparer le plasma riche en plaquettes à partir de la couche leucocytaire, la couche blanche juste au-dessus des globules rouges concentrés qui contient les leucocytes. La couche leucocytaire est appliquée sur des gradients de densité et centrifugé pour obtenir les cellules mononucléaires du sang périphérique (monocytes et lymphocytes) et des cellules polynucléaires (granulocytes). Contamination RBC des phases individuelles de cellules MNC et PMN est commun à ce stade et devrait être résolu lors de la purification de MACS. Les divers types de cellules sont ensuite obtenues par incubation avec des anticorps magnétiques pour obtenir des fractions pures. Les monocytes sont collectées par incubation de la fraction des CMSP avec le CD14, le flux continu à partir de til contient des lymphocytes, des monocytes, qui sont ensuite épuisés de globules rouges et des plaquettes. Les neutrophiles sont obtenues par incubation de la couche de cellules polymorphonucléaires avec l'anticorps CD15 (Figure 1A). Par la suite, les plaquettes peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation du plasma riche en plaquettes et on les lave pour éliminer d'autres composants du plasma. Après ces sélections les plaquettes, les monocytes CD14 +, les lymphocytes, les neutrophiles CD15 + peuvent être comptées et étalées sur un support revêtu XF plaque d'analyseur de l'adhésion cellulaire et l'analyse de la bioénergétique oxydative.

Chaque étape de la procédure doit être effectuée dans des conditions stériles et est encouragé à empêcher l'activation prématurée de la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles. Un indicateur de moins de conditions stériles pendant l'isolement est évident lorsque les neutrophiles, qui ont peu ou pas de consommation d'oxygène dans des conditions basales, commencent le dosage flux extracellulaire avec des mesures OCR élevées queprogressivement augmenter ou diminuer tout au long de l'essai. Nous soulignons l'importance de l'imagerie des cellules par microscopie optique à 200X ou plus pour s'assurer que pas de signes morphologiques d'activation ont eu lieu avant le dosage. Par exemple, les neutrophiles affichent normalement un arrondi à la forme irrégulière avec des limites de cellules marquées comme on le voit sur ​​la figure 1B. Cependant, ces cellules vont aplatir contre la surface de la plaque lorsqu'elle est activée et perdent leur morphologie cellulaire distinct. Nous avons déjà signalé les changements morphologiques des leucocytes et des plaquettes activées en utilisant ce protocole et des mesures supplémentaires doivent être prises pour garantir des conditions stériles si l'activation ⁸ rencontrer.

Un schéma simplifié du protocole est vu sur la figure 2 en tant que table de temps dans lequel les étapes principales de l'isolement des cellules, XF préparation de la plaque, et le dosage XF sont détaillées. L'isolement consiste en la séparation par gradient de densité de types de cellules etest suivi par une séparation magnétique. Parallèlement au processus d'isolement cellulaire, XF plaque préparation est nécessaire pour éviter les retards dans le placage de cellule ou de commencer l'essai XF. Ceci est important car des retards importants peuvent conduire à l'activation de la cellule et les paramètres bioénergétiques diminué.

Concentrations cellulaires inadéquats après l'isolement sont un problème et l'optimisation de chaque processus de centrifugation commun est nécessaire pour éviter la perte de cellules. Isolations réussies ont été réalisées sur aussi peu que six ml de sang, mais des modifications peuvent être faites en fonction de la concentration de type cellulaire souhaité circulant. Si le gradient de densité est mal préparé, les phases de cellulaires distincts pourraient ne pas être visible et la perte de cellules peuvent se produire (voir JoVE vidéo d'instruction pour une démonstration visuelle). Plaquettaire insuffisante isolé du PRP est rare, mais a eu lieu si le tampon de lavage ne ​​contient pas de PGI ₂ ou si l'isolement a lieu en dessous de la température ambiante. Le risque d'une plaquettairectivation est souvent empêchée si les plaquettes sont les dernières cellules à isoler, mais si les plaquettes restent dans le tampon de lavage pendant de longues périodes les bioénergétique seront affectés. Il ya eu des cas de populations de plaquettes plus petites qui n'ont pas Pellet lors de la centrifugation de 1500 xg et la bioénergétique de ces cellules n'a pas été largement caractérisés. Voir le tableau 2 pour un guide plus complet de dépannage.

Les profils bioénergétique de leucocytes et les plaquettes peuvent être déterminées en utilisant l'analyseur XF, qui mesure en temps réel consommation d'O ₂ dans les cellules de façon non invasive. Chaque type de cellules est étalée sur la plaque de XF24 avec cinq répétitions comme représenté sur la figure 3A. Tableau 1 indique l' oxydatif basales et les valeurs attendues par type de cellule au cours de l'essai, les concentrations moyennes de protéine par puits. Technologies de débit plus élevé sont disponibles, tels que le XF96, ce qui permet dequatre donateurs à évaluer simultanément comme le montre la figure 3B. Après l'essai, les données sont exportées vers un ordinateur poste de travail pour l'analyse à l'aide du logiciel approprié XF et Microsoft Excel. Les valeurs ont été normalisées à l'OCR teneur totale en protéine dans les puits correspondants et sont exprimés en pmol / min / mg de protéine. Les profils de rafale bioénergétiques-oxydant représentatives de chaque type de cellule ont été signalés récemment par notre groupe ^8. Une analyse plus poussée des paramètres de l'analyse bio-énergétiques (basal, ATP-lié, proton fuite, maximal, et nonmitochondrial poussée oxydative) peut être calculé pour des puits individuels comme précédemment illustré et décrit ci-dessous ^8.

Le taux de consommation d'oxygène de base (OCR) est établie par les trois premières mesures, comme indiqué sur la figure 4A. Oligomycine (0,5 pg / ml), un inhibiteur de la synthase mitochondriale d'ATP est injecté dans le moyen pour estimer la XF OCR couplé à la synthèse d'ATP et repré ted que l'ATP-lié. L'OCR résiduelle moins l'OCR nonmitochondrial peuvent être attribués à fuite de protons. Puis FCCP un découpleur est ajoutée afin de déterminer la reconnaissance optique de caractères maximal, suivi par l'antimycine A, un inhibiteur de la respiration mitochondriale, pour déterminer les sources nonmitochondrial de consommation d'oxygène. La capacité de réserve est une mesure de la quantité d'ATP qui peut être produite sous la demande d'énergie et peut être calculée comme la différence entre le taux maximum de la respiration et de la base. Afin de déterminer la capacité oxydante de salve, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un agoniste de la PKC est injecté pour augmenter l'activité de la NADPH oxydase, et l'augmentation de la vitesse de consommation d'oxygène après stimulation par PMA peut être mesurée en utilisant l'analyseur XF. Figure 4B montrer comment calculer les différents paramètres de la fonction mitochondriale et oxydatif.

1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Figure 1. Isolement des leucocytes et des plaquettes de sang total. A) des échantillons fraîchement recueillis sont séparés en leur plasma et les composants cellulaires par centrifugation et purifiés par gradient de Ficoll et magnétique tri cellulaire activé (MACS) en positif (monocytes et neutrophiles) ou de la sélection négative (lymphocytes), tandis que les plaquettes sont isolées par une grande vitesse de centrifugation plasma riche en plaquettes. B) Images des populations cellulaires isolées fois remises en suspension dans du DMEM XF et étalées à des densités cellulaires indiqués. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Figure 2. Préparation des plaques pour les études XF24 bioénergétique de leucocytes et des plaquettes. Chronologie détaillées pour la préparation d'une plaque d'essai de XF24 par isolement des cellules et le placage et la cartouche d'hydratation et d'injection orifice de chargement.

Figure 3. Disposition des leucocytes et des plaquettes sur XF24 et XF96 plaques d'analyse. A) Les leucocytes (cellules 125-250k / puits) et les plaquettes (25 x 10 ⁶ cellules / puits) à partir d'un seul donneur sont plaqués sur la plaque d'essai de XF24 parmi fond contrôles. 75 ul de stocks de 10x (oligomycine 0,5 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l'antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans XF médias sont chargées dansaux ports d'injection indiqués. B) Les leucocytes (cellules de 75 150k / puits) et les plaquettes (10 x10 ⁶ cellules / puits) de moins de quatre donateurs peuvent être plaqués sur le XF96 dans un volume total de 180 pl XF-DMEM. 20 ul de stocks de 10x oligomycine (1,0 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l'antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans du DMEM-XF sont chargés dans les orifices d'injection indiqués.

Figure 4. Analyse des indices bioénergétique. A) trace Représentant du taux de consommation d'oxygène (OCR) par les mitochondries et burst oxydatif dans les monocytes. Basale OCR est établi (3 premiers taux indiqués par des numéros dans les cercles). Puis additions séquentielles d'oligomycine (O; 0,5 pg / ml), FCCP (F; 0,6 uM) et anticine-A (A; 10 M) sont injectés pour déterminer mitochondriale et la respiration des cellules non activées nonmitochondrial. Enfin, PMA (100 ng / ml) est ajouté à mesurer oxydatif. B) analyse modulaire de la fonction mitochondriale et du métabolisme oxydatif sont calculées par les différences dans les taux selon les indications.

	Optimale de semis Densité	Moy. Basale OCR (pmol O 2 / min)	Moy. Oxydatif OCR (pmol O 2 / min)	Moy. protéines (g) / puits
Monocytes	250k cellules / puits	83,9 (± 13,0)	300,3 (± 58,8)	19,0 (± 2,4)
neutrophiles	250k cellules / puits	6,1 (± 2,2)	1411,8 (± 233,3)	20,6 (± 2,7)
Lymphocytes	250k cellules / puits	52,9 (± 7,7)	15 (± 4,1)	13.2 (± 2.1)
Plaquettes	25 x 10 6 cellules / puits	199,4 (± 20,3)	24 (± 2,7)	47,5 (± 3,1)

Tableau 1. Paramètres normaux pour le dosage XF24: La basales moyenne (Tarif 3) et burst oxydatif (Taux 7) OCR pas corrigé vers OCR nonmitochondrial ou protéines sont présentés par type de cellule plaqué aux densités cellulaires indiqués. La teneur moyenne en protéines par puits est représenté comme effectuée par un dosage DC Lowry. Ces données représentent les valeurs moyennes des6-8 donneurs sains avec parenthèses contenant ± SEM.

Étape	Problème	Raison possible	Solution
1.2	plasma clair	plaquettes granulés lors de la centrifugation	diminuer le temps de centrifugation de 10 min ou lente à 400 xg
	plasma laiteux	excès de lipides	éviter collection postprandiale
1.6	bandes de cellules incomplètes formées	lutinpréparation de gradient cordier, réactif froid	éviter de perturber gradient pendant le pipetage, l'utilisation de la température ambiante réactif
	touffes dans les bandes cellulaires	coagulation du sang peut avoir eu lieu	Prélever le sang des anticoagulants tels que ACD ou EDTA
1.10	aucun culot cellulaire	voir l'étape 1.6	Si brumeux surnageant voir ci-dessous
	surnageant trouble	Contamination de gradient de Ficoll lourd, la contamination des plaquettes	Augmenter la vitesse de centrifugation à 900 xg, diluth avec plus RPMI
1.16, 1.17	faible rendement de leucocytes	contamination RBC lourd, pas assez de sang total, de la coagulation	Double anticorps et RPMI-BSA volumes, de recueillir plus de sang, ajouter anticoagulant
1.19	l'agrégation plaquettaire	PGI 2 omis, l'exposition aux médias froid, stockage prolongé dans le plasma	ajouter PGI 2 à tampon de lavage des plaquettes, des réactifs de température utilisation de la chambre
1.20	faible numération plaquettaire	pertes lors de la centrifugation primaire, l'agrégation plaquettaire	Voirétapes 1.2 et 1.19
2.3	Contamination RBC		Répétez MACS séparation

Tableau 2. Leucocytes et plaquettes isolement dépannage. Le tableau répertorie les problèmes courants rencontrés lors de leucocytes et plaquettes isolement des cellules du sang et des solutions qui peuvent guider les utilisateurs à travers le processus de dépannage ensemble.

Discussion

Ce protocole représente la compilation de plusieurs techniques couramment utilisées pour l'isolement de cellules de sang, d'une manière adaptée à l'analyse de la bioénergétique. Les techniques présentées contigus sont avantageux à d'autres méthodes d'isolement (analyse FACS) pour leur capacité à isoler un grand nombre de cellules dans des conditions contrôlées de médias avec un minimum de contraintes placées sur des cellules isolées. Il présente l'inconvénient de longs isolements même avec un minimum d'interruptions. Ce protocole sert de base pour l'isolement de cellules du sang de sujets humains primaires, qui peuvent être extrapolés à des paramètres cliniques et de recherche de translation.

MACS séparation est une technique d'isolement des cellules fiable qui offre la possibilité d'isoler les cellules directement à partir du sang total, mais ce procédé nécessite de plus grandes quantités d'anticorps et n'est pas optimale pour l'isolement de l'ensemble des quatre types distincts de cellules telles que décrites dans la présente méthode. Il a been aucune preuve pour montrer que la sélection positive des leucocytes par les résultats de séparation MACS dans l'activation en utilisant notre protocole d'isolement. Colonnes MACS fonctionnent par la séquestration de cellules marquées dans un champ magnétique en utilisant des anticorps conjugués à des particules superparamagnétiques 50 nm. Les cellules marquées sont ensuite élues de la colonne. Sélections positives et négatives sont mises en œuvre dans ce protocole afin d'assurer l'isolement rapide et la pureté. Si le nombre de cellules sont obtenues à partir de l'insuffisance isolement ou la pureté en question est, plusieurs anticorps peuvent être ajoutés à l'échantillon selon les instructions du fournisseur et le second passage à travers la colonne de LS peut se traduire par une plus grande pureté (tableau 2). Notre laboratoire a trouvé une grande pureté et l'efficacité de placage à l'aide du protocole existant en analysant suspensions cellulaires finales par analyse FACS ^8.

Analyseurs de flux extracellulaires ont la possibilité de surveiller à la fois la consommation d'oxygène et l'acidification des médias en temps réel sur celle de otses électrodes. La consommation d'oxygène telle qu'elle est observée par la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles est la NADPH oxydase dépendante comme indiqué par l'inhibition avec le DPI ^8. Nous avons constaté une perte dépendant du temps de la capacité de salve oxydative avec isolements prolongés ou des dosages de XF étendues. Ce protocole a été conçu et mis au point pour une utilisation sur le XF24 mais est également compatible avec le XF96 à environ un tiers à une moitié de la cellule XF24 densités d'ensemencement (Figure 3).

Dans la conception de ce protocole, l'adhésion aux protocoles existants pour chaque technique était nécessaire pour des performances optimales avec des modifications apportées uniquement à contrôler les conditions de médias pour l'analyse bioénergétique. Après la maîtrise des techniques, un tel protocole peut être utilisé dans un large éventail d'applications de translation et de recherche pour mesurer la toxicité ou l'efficacité des stratégies de traitement, d'explorer les caractéristiques métaboliques de la maladie, et la production d'oxydants par des monocytes et neutrophils dans des conditions inflammatoires.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer