Method Article
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Mutations de l'ADN sporadiques dans la lignée germinale peuvent conduire à la réussite de la reproduction réduite et, si hérité, peuvent provoquer une maladie génétique ou une prédisposition accrue au cancer chez les enfants 1-3. Preuve substantielle démontre qu'une grande proportion de mutations de novo sont héritées de la lignée germinale paternelle 4, et que le nombre de mutations dans la descendance est positivement corrélée avec l'âge du père au moment de la conception 5. La proportion plus élevée de mutations de sexe masculin est considéré comme un résultat de la différence d'âge au cours de la gamétogenèse entre les sexes, le plus grand nombre de divisions cellulaires de la spermatogenèse par rapport au nombre de divisions cellulaires oogenic dans la lignée germinale femelle 2, et une diminution progressive de l'ADN réparer l'efficacité avec l'âge chez les hommes. Tous ces facteurs contribuent à une probabilité accrue d'erreurs de réplication dans la lignée germinale mâle 6. Cependant, l'impact de l'exposition paternelle à Envirofacteurs nnement sur la fréquence des mutations de novo reste incertaine. Néanmoins, un grand nombre d'agents d'environnement sont connues pour induire des mutations germinales chez les rongeurs 7, et il existe des preuves croissantes que certains de ces agents peut aussi affecter la lignée germinale humaine 8. Malgré ces préoccupations, les produits chimiques sont régulièrement testés pour leur capacité à induire des mutations dans les cellules somatiques à des fins réglementaires et il est généralement admis que les tests somatiques sont suffisantes pour protéger la lignée germinale. Par conséquent, les produits chimiques ne sont que rarement évalués pour leur capacité à induire des mutations germinales.
Tests de mutagénicité des cellules germinales Une raison a été largement omis de la réglementation processus de prise de décision est un manque de méthodes pratiques. Méthodes basées sur des rongeurs traditionnels, tels que les mortels 9 et 10 tests spécifiques locus dominantes, estiment les taux de mutation des cellules germinales en marquant phénotypes mutants dans des embryons ou des descendants deparents exposés. Ces tests nécessitent l'utilisation d'un très grand nombre d'animaux, de temps et de ressources pour acquérir des résultats statistiquement significatifs.
Bien que plusieurs méthodes modernes de quantification de mutation des cellules germinales ont récemment vu le jour, beaucoup souffrent de lacunes en termes de praticité, l'efficacité et la pertinence biologique. Par exemple, répéter mutations de longueur à répétition en tandem simples (RETE) loci élargi peut être quantifiée dans les cellules germinales mâles utilisant une approche PCR de molécule unique 15. Toutefois, l'exécution de cette méthode peut être techniquement difficile et laborieux, et contrairement à des mutations ponctuelles, la signification biologique et la santé des changements dans la longueur de répétition du RETE loci très instable restent peu claires 16. Technologies de séquençage du génome entier modernes peuvent fournir une foule de données biologiquement significative lorsqu'elle est appliquée au problème de mutations héréditaires 4,17, mais le coût élevé, les taux d'erreur élevés, validation associé requispour confirmer les mutations, et bioinformatiques défis limiter encore l'application systématique de cette option à titre d'essai réglementaire 18.
Ici, nous décrivons une méthode pratique pour quantifier directement les mutations induites dans les cellules germinales de souris mâles transgéniques. Ce protocole est décrit par le modèle de MutaMouse transgénique, qui a de multiples copies d'un vecteur concaténés λgt10 de phage recombinant contenant un gène rapporteur lacZ intégré Escherichia coli dans les deux copies du chromosome 3 19 (figure 1).
Ce protocole est également s'appliquer à d'autres rongeurs transgéniques (TGR) modèles basés sur les mêmes principes (BigBlue souris et le rat, ou lacZ plasmide souris, etc.) Ou légèrement différents gènes rapporteurs (de la souris delta gpt et le rat, modèles TGR examinés en Lambert et . al 20). Cette méthode est basée sur l'essai de mutation décrit dans l'une TGR récemment publiéet révisée de l'OCDE directrice pour l'essai 21 et nous élaborons sur les considérations spéciales nécessaires pour accueillir évaluation des mutations dans la lignée germinale mâle en raison des caractéristiques uniques de la spermatogenèse. En bref, l'essai consiste à exposer des souris mâles transgéniques à une substance mutagène, suivie par un temps d'échantillonnage lorsque les lésions pré-mutation sont fixés à des mutations stables. A l'instant d'échantillonnage choisi, les souris sont euthanasiées et les cellules germinales sont recueillies à partir de l'une ou l'autre de la queue de l'épididyme ou les tubes séminifères. Comme nous le verrons, des effets mutagènes à différents stades de la spermatogenèse peut être déterminé en sélectionnant le délai entre l'exposition et la collecte de l'échantillon. Inserts transgéniques, comprenant des copies multiples du génome du phage λ par cellule, sont isolés de l'ADN génomique des cellules germinales et emballés dans des capsides vides de phage λ créant des particules de phage infectieux de λ qui sont ensuite utilisés pour infecter un E. hôte coli. Les bactéries infectées sont cultivées sur sélecmédias tives qui peuvent distinguer les cellules contenant un vecteur d'une copie mutée de lacZ de cellules hébergeant de type sauvage lacZ. L'effet mutagène de l'exposition sur la lignée germinale mâle est déterminée en comparant la fréquence des transgènes mutantes entre le contrôle et les souris traitées (Figure 2, examinées dans Lambert et al. 20). Un grand nombre de cellules germinales peut être analysée à partir d'une seule souris, ce qui donne une sensibilité supérieure ce dosage par rapport aux procédés traditionnels, tout en réduisant le nombre d'animaux requis. Et parce que aucun équipement ou de formation spécialisée est nécessaire, ce test fournit une option pratique et efficace pour les tests de mutation des cellules germinales dans la plupart des laboratoires moléculaires modernes de la biologie de toxicologie /.
Une condition essentielle pour l'application effective de l'essai de mutation des cellules germinales TGR est une compréhension du cycle de la spermatogenèse (Figure 3). Le temps pour les cellules germinales de souris au progrès de stcellules em dans les tubules séminifères à spermatogonies, spermatocytes, spermatides, et enfin à la maturité des spermatozoïdes dans l'épididyme (c.-à-la spermatogenèse.) est d'environ 49 jours. Mutation peut se produire à diverses étapes de ce cycle et est souvent spécifique composé. Deux caractéristiques clés qui revêtent un intérêt particulier à la mutagenèse dans les cellules germinales mâles sont l'arrêt de la synthèse de l'ADN lors de la méiose tôt, et la perte progressive de la capacité de réparation d'ADN 6 à la fin de l'après-méiose, deux processus qui sont nécessaires pour l'induction et la fixation de la plupart des mutations.
En raison de ces caractéristiques uniques de la spermatogenèse, il ya trois variables expérimentales critiques pour la conduite de la TGR mutation des cellules germinales essai: (1) le temps de l'administration du composé d'essai; (2) le temps d'échantillonnage; et (3) la sélection de la population de cellules germinales de recueillir pour analyse (figure 3 et tableau 1). Le temps d'administration est le experimeNTAL variables qui détermine la façon dont les cellules cibles longues sont exposées aux composés d'essai. La longueur de la durée d'administration peut également être utilisé pour cibler l'exposition à des types cellulaires spécifiques ou des phases de la spermatogenèse. Par exemple, une administration quotidienne unique pourrait être utilisée pour déterminer les effets d'une exposition de courte durée sur un type cellulaire particulier. De même, l'exposition peut être porté à toute une phase de la spermatogenèse, par exemple en ciblant les spermatocytes seule division méiose, ou division mitotique des spermatogonies en utilisant un temps d'administration de 2 semaine et un temps d'échantillonnage approprié. Temps de l'administration chronique et subchronique sont utilisées pour évaluer les effets de l'exposition à long terme, pour assurer la distribution de pharmacocinétique du composé suffisante de test, ou de permettre une accumulation suffisante de mutations de mutagènes faibles (par exemple le temps d'administration de 28 jours recommandé dans le test de l'OCDE directive).
Temps d'échantillonnage est la variable critique pour déterminer à quila phase de la spermatogenèse les cellules cibles étaient dans au moment de l'exposition. La période d'échantillonnage dicte combien de temps, et donc combien plus loin le long du cycle de la spermatogenèse, les cellules passer après l'exposition. Par exemple, pour étudier les effets dans les spermatogonies de cellules souches, un temps d'échantillonnage> 49 jours est nécessaire si la collecte de sperme en pleine maturité, ou> 42 jours si la collecte de cellules germinales immatures à partir des tubules séminifères, afin de s'assurer que toutes les cellules recueillies ont eu suffisamment de temps pour développer à partir de cellules exposées tiges. Il est important de noter que le temps d'échantillonnage d'au moins 70 jours serait préférable de démontrer un véritable effet sur les cellules souches à prévoir suffisamment de temps pour la distribution de pharmacocinétique de la substance toxique, pour l'élimination des cellules exposées à des phases ultérieures de la spermatogenèse, et pour tenir compte de une période de stérilité temporaire qui peut se produire ~ 6 semaines après l'exposition à des composés hautement mutagènes 22. De même, un temps d'échantillonnage de 21 jours permettrait de garantir que les spermatozoïdes colleDirection exécutive de l'épididyme de la queue de l'auraient tout juste de terminer la méiose, le dernier jour de l'exposition.
Les cellules germinales peuvent être collectées comme spermatozoïdes matures de la queue de l'épididyme, ou un mélange de différents types de tubes séminifères des cellules de la spermatogenèse. Sperme mûr dans le reste de la queue de ~ 3 jours, ce qui permet de déterminer avec précision par rapport au type de cellule ou de la phase de la spermatogenèse à partir de laquelle le sperme est issue de tout protocole expérimental donné. Ainsi, l'analyse de la queue de sperme permis hautement recherches sur les effets de mutations spécifiques au stade ciblé. D'autre part, les suspensions de cellules recueillies à partir des tubules séminifères contiennent un mélange de différents types de cellules germinales dans les différentes phases du développement, et offrent donc une moins bonne résolution de la phase de la spermatogenèse, dans lequel les mutations sont originaires. En outre, les suspensions de cellules récupérées à partir des tubules séminifères ont tendance à contenir une représentation des spermatides-dessus, suivie par les spermatocytes, et very peu spermatogonies et les cellules souches (ces proportions sont représentés par des barres blanches gradués sur la figure 3). En outre, les suspensions préparées à partir des tubules séminifères peuvent également contenir diverses cellules somatiques. Ainsi, en raison tant de types de cellules sont présentes, les effets de mutations peuvent être influencées par une variété de cellules non cibles. Toutefois, la collecte des échantillons de tubes séminifères offre une option économique pour le dépistage simultané de plusieurs types de cellules germinales, et une intégration facile de l'analyse des cellules germinales dans le protocole d'essai standard de l'OCDE pour une mutation somatique.
Pour réitérer, selon les besoins du chercheur, le temps d'administration, la durée de l'échantillonnage et de la population de cellules recueillies peuvent être ajustés pour interroger les effets de l'exposition à divers types de cellules et à des phases différentes de la spermatogenèse. En choisissant soigneusement ces variables, les expériences peuvent être conçus pour des études mécanistiques ciblées, ou pour le test réglementaire plus généraliséefins ing.
Pour atteindre la maîtrise de l'analyse, nous recommandons l'utilisation d'une administration orale aiguë de 100 mg / kg de N-éthyl-N-nitrosourée (FRA), suivie par une période d'échantillonnage de 70 jours de contrôle positif. Analyse de la queue des spermatozoïdes vise ainsi les cellules souches des spermatogonies (figure 3), qui présentent généralement une multiplication par 4-5 dans la fréquence des mutants (MF) par rapport aux témoins suite à cette dose très mutagène de FRA. Il est à noter que cette dose est connue pour induire la stérilité six semaines après l'exposition, ainsi il peut ne pas être une dose de commande approprié pour la réduction des temps d'échantillonnage. Cette dose sera également produire une augmentation détectable dans la plupart des tissus MF 20 somatiques. Les résultats représentatifs présentés ci-dessous ont été recueillies à la suite d'un régime d'exposition aiguë +70 utilisant trois doses de FRA jusqu'à et y compris 100 mg / kg.
Tous les protocoles impliquant l'élevage, l'entretien et la manipulation ont été approuvés par le comité de protection des animaux de Santé Canada.
1. expositions animaux
2. isolement et la digestion de la queue de sperme
Extraction / chloroforme 3 de phénol de l'ADN de sperme de la queue
Remarque: En raison de l'ADN nucléaire dans les spermatides en phase tardive et du sperme mûr est complexé avec des protamines, et est très condensée par rapport à l'ADN de cellules somatiques, les méthodes d'isolement d'acides nucléiques classiques ne génère pas l'ADN de rendement et une pureté suffisante pour l'essai de mutation à travailler efficace. Plusieurs extractions au phénol-chloroforme après une digestion agressif sont tenus de libérer et purifier l'ADN de sperme (basée sur des méthodes de 15).
4. isolement et la digestion des cellules germinales de séminifères tubules
5 phénol / chloroforme Extraction d'ADN à partir de cellules germinales Tube séminifère
Remarque: Une extraction moins agressif est utilisé pour isoler l'ADN des cellules des tubules séminifères germinale, étant donné que ces types de cellules ne sont pas encore progressé à ncondensation NUCLEAIRE.
6. LacZ mutation Assay
La contamination bactérienne ou fongique peut interférer avec l'efficacité de l'emballage, ainsi que la croissance de la plaque dentaire et le ballon. Il est donc essentiel d'effectuer les essais de lacZ en utilisant les mesures d'asepsie appropriées pour empêcher la contamination de la réaction de l'emballage, de la culture et de la croissance hôte médias.
7. Statistiques
L'appareil d'essai pour l'analyse est la souris. Les données produites par ce test ne sont généralement pas distribuées normalement. En tant que tel, sélectionner la méthode statistique d'analyse sur la base de la caractéristique de distribution de données.
REMARQUE: Standard analyses paramétriques (. Exemple, analyse de la variance) peut être utilisé si la transformation de données appropriée est appliquée à égaliser la variance de la réponse dans l'ensemble des observation. Poisson ou analyses de régression binomiale sont souvent plus approprié. Analyse non paramétrique peut également être utilisé. Nous employons habituellement la régression de Poisson en utilisant la procédure du modèle linéaire généralisé (c'est à dire., Proc GENMOD) en SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) telle que décrite par Lemieux et al 26.
Avec un nombre de plages moyenne de 200 000 plaques par animal, on observe généralement un fond moyenne MF d'environ 2,8 x 10 -5 dans les cellules germinales mâles avec une déviation standard de 1,7 x 10 -5 dans nos groupes de contrôle (basé sur les données de huit indépendant expériences). Avec ce nombre de plaque, le niveau de fond et de la variance, les groupes de dose avec n = 5 animaux chacun sont suffisants pour détecter une augmentation de 2 fois dans MF avec une puissance> 0,8.
Les résultats sont généralement signalées dans les tableaux ou graphiques formats. Tableau 2 et figure 6 montrent des résultats représentatifs de la queue des spermatozoïdes des hommes MutaMouse (n = 5 par groupe) exposés à une dose unique orale aiguë de 0, 25, 50 et 100 mg / kg N-éthyl-N-nitrosourée (ENU), suivie par un temps d'échantillonnage de 70 jours. Cette période de 70 jours permet de mesurer des événements mutationnels qui ont eu lieu dans les spermatozoïdes qui sont des cellules souches des spermatogonies au moment de l'exposition (Figure 3). La densité de la plaque sur des plaques typiques mutantes et titrage sont présentés sur la figure 7. Comme représenté dans le tableau 2 et figure 6, une exposition de courte durée ENU induit une augmentation dose-dépendante significative de la MF de cellules souches des spermatogonies. La faible dose a induit une augmentation significative de 2,6 fois par rapport aux témoins, ce qui a une ligne de base MF de 2,6 x 10 -5. Induction maximale a eu lieu dans la dose élevée, ce qui a provoqué une augmentation d'un facteur 4,4 par rapport aux témoins.
Un exemple de cette analyse effectuée sur les cellules des tubules germinales séminifères se trouve à Douglas et al. 27, où MF a été déterminée dans des cellules de tubule germinales à différents intervalles de temps après une répétition de l'injection intra-péritonéale de 5 jours de 50 mg / kg ENU. Dans cette étude, la proportion de mutants dans les cellules séminifères ont augmenté jusqu'à 15 jours après le traitement et sont restées constantes par la suite.
Expoque le régime | Des tissus prélevés | Type de cellules recueillies (cellule cible) | Phase de cellule cible au début de l'exposition | Phases passés lors de l'exposition |
Aiguë + 70 | Cauda | Spermatozoïdes matures | les cellules souches | les cellules souches |
14 + 21 | Cauda | Spermatozoïdes matures | Spermatogonies | Spermatide |
14 + 35 | Cauda | Spermatozoïdes matures | les cellules souches | Spermatocyte |
+ 28 3 | Cauda | Spermatozoïdes matures | Spermatocyte | Spermatocyte Spermatide Spermatozoïdes matures |
Tubules | les cellules souches | les cellules souches | les cellules souches | |
Spermatogonies | Spermatogonia | Spermatogonies | ||
Spermatocyte | Spermatocyte | |||
Spermatide | Spermatide | |||
28 + 49 | Cauda | Spermatozoïdes matures | cel souches | les cellules souches |
Tubules | les cellules souches Spermatogonies Spermatocyte Spermatide | les cellules souches | les cellules souches |
Tableau 1 Les types de cellules et les phases de la spermatogenèse qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par divers modèles expérimentaux.
Groupe dose | Animaux # | Mutant PFU | Total des PFU | MF (x10 -5) | Moyenne MF (x 10 -5) | Facteur de changement | p-valeur |
Contrôle | 1 | 5 | 180245 | 2.8 | 2.6 | 1.0 | - |
2 | 4 | 137835 | 2.9 | ||||
3 | 11 | 385672 | 2.9 | ||||
4 | 2 | 431396 | 0,5 | ||||
5 | 6 | 152413 | 3.9 | ||||
25 mg / kg | 6 | 17 | 162353 | 10.5 | 6.9 | 2.6 | 0,0002 |
7 | 14 | 150094 | 9.3 | ||||
8 | 4 | 154401 | 2.6 | ||||
9 | 9 | 154401 | 5.8 | ||||
10 | 12 | 196978 | 6.1 | ||||
50 mg / kg | 11 | 17 | 155727 | 10,9 | 9.3 | 3.6 | <0,0001 |
12 | 11 | 135847 | 8.1 | ||||
13 | 25 | 193499 | 12,9 | ||||
14 | 12 | 133859 | 9.0 | ||||
15 | 14 | 252807 | 5.5 | ||||
100 mg / kg | 16 | 26 | 170968 | 15.2 | 11,5 | 4.4 | <0,0001 |
17 | 28 | 234584 | 11,9 | ||||
18 | 10 | 145289 | 6.9 | ||||
19 | 35 | 292236 | 12,0 | ||||
20 | 22 | 190848 | 11,5 |
Le tableau 2 de la fréquence de mutants de la queue du sperme dans lacZ mâle transgénique de mglace exposée aiguë à FRA quand ils étaient les spermatogonies souches (de temps d'administration = 1 journée, le temps d'échantillonnage = 70 jours). PFU = plaque forming unit, MF = fréquence des mutants.
Figure 1: Une représentation schématique de la construction du phage λgt10.
Figure 2: Un aperçu du rongeur germe test de mutation des cellules transgéniques.
Figure 3 Une vue schématique de la spermatogenèse chez la souris et les types de cellules et de phases qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par différents modèles expérimentaux. Remarque: Les barres blanches diplômés représentent la proportion relative des types de cellules présentes dans les suspensions cellulaires préparées à partir des tubules séminifères (c. spermatides> Spermatocytes> spermatogonies> cellules souches). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 Collection de la queue de l'épididyme de souris. A) Faire une incision dans l'abdomen vers le scrotum. B) Identifier le coussinet adipeux de l'épididyme. C) Tirez doucement sur le coussinet adipeux de faire ressortir les testicules et de l'épididyme. D) Recherchez et exciser la queue de l'épididyme.
Figure 5 Préparation de la suspension de cellules germinales à partir des tubules séminifères. A) Une incision est faite dans la capsule épithéliale du testicule, de l'exposition des tubes séminifères. B) Les tubes séminifères sont pressés hors de la capsule. C) un rouleau de tissu est délicatement passé sur les tubes à un angle de 5-10 ° par rapport à libérer les cellules germinales contiennent. D) La suspension de cellules germinales sont collectées pour un autre traitement.
Figure 6 Représentation graphique de la fréquence des mutations de lacZ dans MutaMouse sperme exposé aiguë que les cellules souches de FRA (n = 5). Chaquetriangle représente la MF d'un animal. * p <0,05 comme déterminé par régression de Poisson.
Figure 7 plaques d'agar représentatifs de l'essai de mutation de rongeurs transgéniques avec des plaques formées sur une pelouse de E. coli bactéries hôtes. A) Les plaques "mutants" auront très peu de plaques (marqués par des flèches), en particulier dans les groupes de dose de contrôle, qui de temps en temps avoir zéro plaques sur des plaques. B) Les plaques "de titre" peuvent avoir des centaines de plaques.
Par rapport aux méthodes traditionnelles, le test de mutation des cellules germinales TGR fournit un moyen plus rapide, plus économique et plus sensibles de quantifier induit des mutations des cellules germinales in vivo. En évaluant transgène MF directement dans le sperme, par opposition à la descendance, le nombre d'animaux, le temps et les ressources nécessaires pour évaluer le pouvoir mutagène de la lignée germinale d'un seul composé est considérablement réduite. En termes de sensibilité, nous avons pu détecter une augmentation de 2,6 fois importante dans les cellules souches des spermatogonies MF après une exposition à 25 mg / kg FRA utilisant seulement 5 animaux par groupe de dose. En revanche, le test du locus spécifique a été incapable de détecter toute modification significative de MF à cette même dose en utilisant> 3.000 souris dans le groupe exposé et> 500 000 souris témoins 28.
En plus de sa pertinence pour les deux enquêtes mécanistes et réglementaires, cette méthode donne l'occasion à des études comparatives entre somatique et germinale ligne Mutatisur les taux. Des données récentes suggèrent que, pour certains agents mutations de cellules germinales peuvent être induites à une concentration inférieure à celle requise pour une mutation somatique. Par exemple, une exposition prolongée à la N-hydroxyméthylacrylamide, un métabolite de la acrylamide cancérigène alimentaire 12, augmente la fréquence des mutations des cellules germinales létales dominantes chez la souris sans affecter la fréquence de micronoyaux dans les cellules rouges du sang, une mesure traditionnelle de la cellule somatique dommages cytogénétiques 13. En outre, l'exposition de souris à deux fréquences de mutation principale et secondaire du tabac la fumée de tabac élevés à répétition en tandem loci d'ADN dans le sperme à des doses qui n'augmentent pas la fréquence des micronoyaux dans le sang 14. Ces résultats remettent en question l'hypothèse selon laquelle les tests de génotoxicité somatique est toujours protecteur de la lignée germinale, et renforcent la demande pour un moyen plus efficace et rentable pour quantifier germe fréquence de mutation cellulaire. Toutefois, la preuve pour préférentiels mutagènes des cellules germinales est encore faible, En grande partie en raison du manque de données disponibles pour comparer les taux de mutation dans les tissus des cellules somatiques et germinales. Le test de mutation TGR permet de tester en parallèle et la comparaison des taux de mutation induite dans plusieurs tissus utilisant le même transgène. Ainsi, le test de mutation comparative en utilisant le test TGR aiderait à combler les lacunes de données autour de la possibilité d'effets sur les cellules germinales préférentiels.
Évaluation simultanée de la mutation de cellules somatiques et germinales à des fins réglementaires permettrait également d'améliorer l'efficacité en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. La ligne directrice de l'OCDE pour les mutations somatiques recommande un temps d'administration de 28 jours, suivie d'une période d'échantillonnage de trois jours (28 + 3). Analyse de la queue des spermatozoïdes peut offrir une faible sensibilité à ce point de temps, car il cible les cellules exposées surtout pendant les spermatocytes et spermatides phases de la spermatogenèse (figure 3). Les cellules de ces phases ne synthétisent pas l'ADN et perdent progressivement leur capacité de réparation de l'ADN 6 </ Sup>. En outre, l'échantillonnage de la queue des spermatozoïdes à ce point dans le temps ne permettrait pas de détecter des mutations qui se produisent dans les cellules de spermatogonies et souches. Ainsi, pour l'intégration dans la conception 28 + 3, la directrice de l'OCDE recommande la collecte de cellules germinales à partir des tubules séminifères. Cette population mixte contient des cellules dérivées de la synthèse d'ADN et de types de cellules de réparation compétent, notamment les cellules souches, et sont exposés à travers la majorité des phases spermatogenèse. Toutefois, en raison de la nature mixte de ces cellules, séminifère analyse de cellules de tubules ne fournit pas d'information spécifique à la phase. En outre, il est à craindre que la présence de cellules non-cibles peuvent influencer le MF observé (par exemple faux positifs appels mutagène sur les cellules germinales en raison de la contamination de cellules somatiques mutés, ou dilution d'un signal de cellules germinales muté à partir de cellules germinales réparation de l'ADN déficientes) . Actuellement, il n'existe pas de données suffisantes pour conclure si les résultats des cellules des tubules séminifères à 28 + 3 offre la même sensibilité et la spécificité d'uns de la queue des spermatozoïdes à des moments ultérieurs. Notre laboratoire compare actuellement les CM induits dans les cellules des tubules séminifères et la queue des spermatozoïdes prélevés après différents temps d'échantillonnage pour aborder cette question. Nous notons que la directrice de l'OCDE suggère une période d'échantillonnage de remplacement de 28 jours pour les tissus en division lente tels que le foie qui peut également être adapté à l'analyse des cellules germinales. Néanmoins, les données disponibles sont encore insuffisantes et nous sommes actuellement pas en mesure de recommander un modèle expérimental unique pour l'analyse simultanée de cellules somatiques et les cellules germinales en utilisant le test de mutation TGR à des fins réglementaires.
Une des caractéristiques de cet essai qui devrait être noté est que les événements de mutation sont évalués sur un transgène non murin. Cependant, il ya suffisamment de preuves pour suggérer que le transgène répond aux agents mutagènes environnementaux d'une manière similaire à des gènes endogènes 20. En outre, parce que les origines précises des événements mutationnels indépendants sont difficiles àrésoudre, les résultats sont généralement rapportées comme une fréquence de mutants (par opposition à une fréquence de mutation). La fréquence de mutation peut être effectivement résolu que si les résultats sont corrigés pour l'expansion clonale (par exemple. La division et la multiplication d'une cellule mutée qui peut contribuer à la fréquence observée des mutants transgéniques) par séquençage d'ADN. Le séquençage des transgènes mutants peut être effectuée pour caractériser les mutations de lacZ, et identifier les mutants qui peuvent être dérivés à partir des événements de l'expansion clonale, bien que cela augmente considérablement le temps et le coût de l'analyse. En plus du gène lacZ, theλgt10 vecteur transgénique héberge un gène par mutation reporter alternatif dépendant de la température: une variante du gène λ du cil, ce qui est plus court (294 pb par rapport à la 3021 pb lacZ, figure 1) et plus facile à la séquence 29. Le séquençage permet également l'analyse du spectre de mutation induite, donnant un aperçu de la mutatiomécanisme final du composé en question. Un exemple extrême de l'expansion clonale est l'apparition d'un "jackpot" mutation (c'est à dire., Mutations transgéniques à un stade très précoce du développement d'un organe qui contribuent à une MF considérablement élevée, parfois des centaines de milliers de fois supérieures à fond). Animaux ou des tissus avec un "jackpot" mutation doivent être retirés de l'analyse.
Le test que nous avons décrit est largement applicable à d'autres modèles, tels que la TGR BigBlue souris et le rat, la souris et le plasmide lacZ, qui abritent une mutation vecteurs rapporteurs similaires (passés en revue dans 20). La grande majorité des études sur les cellules germinales menées à ce jour qui emploient des méthodes similaires ont porté presque exclusivement sur mutagènes bien caractérisées telles que FRA et le rayonnement (revue dans 30). Il est prévu que la récente publication de la ligne directrice d'essai de l'OCDE pour l'essai TGR, ce test serade plus en plus populaire pour le dépistage chimique et évaluation réglementaire. L'incorporation de la cellule germinale test de mutation TGR dans une batterie de test réglementaire comblera le vide existant en permettant une évaluation efficace de l'induction de mutations dans les cellules germinales 11. De plus, ce dosage peut être utilisé pour mesurer MF dans pratiquement n'importe quel tissu, en fournissant un moyen adapté pour comparer les sensibilités relatives des cellules somatiques et les cellules germinales à l'induction de mutations par points de terminaison à des agents environnementaux génétiques identiques.
The authors declare that they have no competing financial interests.
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MutaMouse | Covance | - | |
E. coli (lacZ-/galE-) | Covance | - | See reference 25 in manuscript |
Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | - | |
Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3 M solutution, pH 5.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool | ||
Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
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