Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Résumé

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Résumé

Les neurones dopaminergiques représentent moins de 1% du nombre total de neurones dans le cerveau. Cette faible quantité de neurones du cerveau régule les fonctions importantes telles que le contrôle moteur, la motivation et la mémoire de travail. Neurones dopaminergiques nigro-strié sélectivement dégénèrent dans la maladie de Parkinson (MP). Cette perte neuronale progressive est sans équivoque associée aux moteurs symptômes de la pathologie (bradykinésie, tremblement de repos, et une rigidité musculaire). Le principal agent responsable de la dégénérescence des neurones dopaminergiques est encore inconnue. Cependant, ces neurones semblent être extrêmement vulnérables dans diverses conditions. Les cultures primaires constituent l'un des modèles les plus pertinents pour étudier les propriétés et les caractéristiques des neurones dopaminergiques. Ces cultures peuvent être soumis à différents agents de stress qui imitent PD pathologie et de composés neuroprotecteurs pour arrêter ou ralentir la dégénérescence neuronale. Les nombreux modèles de souris transgéniques de la MP qui ont été généATED au cours de la dernière décennie a encore augmenté l'intérêt des chercheurs pour les cultures neuronales dopaminergiques. Ici, le protocole vidéo met l'accent sur la dissection fine de cerveaux de souris embryonnaires. Excision précise de mésencéphale ventral est crucial d'obtenir des cultures de neurones suffisamment riches en cellules dopaminergiques pour permettre des études ultérieures. Ce protocole peut être réalisée avec des souris transgéniques embryonnaires et est approprié pour la coloration par immunofluorescence, de PCR quantitative, la quantification de second messager, ou mort neuronale évaluation / de survie.

Introduction

La dopamine, un des neurotransmetteurs du cerveau essentielles ^1,2, est surtout rejeté par dopaminergiques du mésencéphale (DA) des neurones. La majorité des neurones dopaminergiques de séjourner dans la partie ventrale du mésencéphale ^6.2. Schématiquement, les neurones dopaminergiques du mésencéphale peuvent être divisés en trois anatomiquement et fonctionnellement distinctes des systèmes de projection: mesostriatal, mésolimbique et les voies mésocorticales ^2,5. La voie nigro est impliqué dans le comportement moteur, les voies mésolimbiques jouent un rôle important dans le renforcement, la motivation et l'apprentissage, alors que les voies dopaminergiques projetant vers le cortex préfrontal sont impliquées dans la cognition ^2.

Neurones dopaminergiques sont impliqués dans plusieurs troubles neurologiques humains tels que la schizophrénie, déficit de l'attention, trouble de l'hyperactivité, et la maladie (le PD) de Parkinson ^2,4. PD est caractérisée par une dégénérescence progressive et sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire de liaisonpars compacta (SNC) dans le striatum. La perte de nigro-striée DA neurones entraîne un grave appauvrissement de la dopamine dans le striatum qui est responsable des symptômes moteurs de la maladie (bradykinésie, tremblement de repos, et la rigidité) ^7. La cause initiale de la MP idiopathique n'a pas été établie et les traitements actuels ne sont symptomatiques, visant à restaurer le niveau de dopamine dans le striatum. Le médicament le plus prescrit est la L-Dopa (lévodopa), le précurseur naturel de la dopamine. Bien que l'administration de lévodopa compense la perte de dopamine pendant un certain temps, des complications motrices surviennent après un traitement de longue durée (dyskinésie et états ON / OFF) ^8,9.

La recherche sur les neurones dopaminergiques et PD est en constante progression et les efforts intenses sont déployés pour développer des traitements basés sur la transplantation de cellules, la thérapie génique, ou agents neuroprotecteurs ^10,11. Cependant, reste un problème majeur non élucidé: quelle est la cause de l'extrême vulnerabilité des neurones DA? Une partie de la réponse peut être trouvée dans l'activité des neurones dopaminergiques. Une réduction de l'activité électrique et de l'excitabilité des neurones dopaminergiques semblent augmenter leur propension à dégénérer ^12. Néanmoins, la complexité du PD pathogénie nécessite d'autres études pour identifier les mécanismes impliqués dans la dégénérescence des neurones DA ^13-15.

Les cultures primaires sont particulièrement pertinentes pour l'étude des propriétés des neurones DA ^16-19 et de contester ces neurones à différentes contraintes pour l'évaluation des agents neuroprotecteurs ^20-24. des modèles de culture de Rat sont le plus souvent utilisés, comme la dissection du mésencéphale embryonnaire de rat est plus facile, par rapport à la souris, et des quantités plus élevées de neurones peuvent être obtenus chez le rat. Toutefois, la production de modèles de souris transgéniques de la maladie ²⁵ a considérablement augmenté l'intérêt de la communauté neuroscientifique pour des cultures primaires de la souris ^26-29. Bien que les cultures prepared des animaux nouveau-nés peuvent être utilisés, il est préférable de les préparer à partir d'embryons au stade post-mitotique (E13.5 pour les neurones de mésencéphale), lorsque les neurones ont conservé leur capacité de se différencier. Le protocole ci-dessous présente les neurones de mésencéphale en culture primaire isolés à partir d'embryons de souris (de E13.5), qui sont les plus difficiles à préparer. En particulier, nous fournissons un protocole utilisant un milieu de culture sans sérum pour une meilleure reproductibilité. Les deux étapes les plus critiques dans la préparation de la culture (dissection et dissociation mécanique) seront soigneusement détaillés dans la vidéo associée.

Protocole

Les souris utilisées dans ce travail ont été pris en charge et traités en conformité avec les lignes directrices du Conseil de l'Union européenne (86/609 / UE) pour l'utilisation des animaux de laboratoire.

1 Préparation des solutions obligatoires

1. Solutions mères
   1. 10x poly-L-ornithine (OLP) Solution: peser 10 mg de bromhydrate OLP (poids moléculaire = 30,000-70,000) et dissoudre dans 70 ml d'eau stérile. Filtrer la solution à l'aide de 0,2 um filtre de la seringue, aliquote, et conserver à -20 ° C.
   2. 30% Solution de glucose: peser sur 30 g de D (+) - glucose et le dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   3. Milieu de Eagle modifié de 5x Dulbecco (DMEM) / mélange nutritif F-12 Ham: peser 6 g de poudre DMEM / Ham F-12 et les dissoudre dans de l'eau stérile pour un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   4. 7,5% de bicarbonate de sodium (NaHCO ₃₎ Solutile: peser 7,5 g de NaHCO ₃ et dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   5. 1 M HEPES Solution: Peser 23,8 g d'HEPES et dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   6. 70% (v / v) d'éthanol: Diluer 70 ml d'éthanol absolu avec 30 ml d'eau stérile.
2. Phosphate Buffered Saline de glucose et les antibiotiques (PBS-GAB): ajouter 10 ml de solution à 30% de glucose et 5 ml de solution de pénicilline-streptomycine à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Conserver à 4 ° C.
3. Sérum bovin fœtal inactivé (IFB): Décongeler sérum bovin pendant une nuit à 4 ° C et inactiver à 56 ° C pendant 30 min. Aliquote dans 50 ml et conserver à -20 ° C.
4. Milieu de culture: Dans l'eau stérile, mélanger successivement 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de 1 M HEPES, 2 ml de 200 mM de L-glutamine, 2 ml de pénicilline-streptomycine, 4 ml de glucose à 30% unee 3 ml de 7,5% de NaHCO ₃ à un volume final de 180 ml. Filtrer et utiliser le même jour.
5. Hormone Mix
   1. Préparer 180 ml de milieu de culture. Dissoudre 200 mg d'apo-transferrine dans ce milieu.
   2. Peser 50 mg d'insuline et dissoudre dans 2 ml de HCl 0,1 M. Ajouter lentement 8 ml d'eau stérile tout en mélangeant délicatement. Diluer cette solution dans le milieu de culture.
   3. Peser 19,3 mg de dichlorhydrate de putrescine et de se dissoudre dans 10 ml d'eau stérile. Ajouter 10 ml de la solution de la composition de l'hormone.
   4. Préparer une solution de sélénite de sodium à 3 mM dans de l'eau stérile et une solution de 2 mM de progestérone dans l'éthanol absolu. Ajouter 20 ul de chaque solution de la composition de l'hormone.
   5. Filtrer le mélange d'hormones, en aliquote de 10 ml et conserver à -20 ° C.

2 Préparation de plaques et instruments Culture

1. FBS revêtement des plaques Culture: Le jour avant la dissection, préparer 180 ml de milieu de culture. Ajouter 10 ml d'IFBS à 90 ml de milieu de culture. Ajouter 300 ul / puits de milieu de culture / 10% IFBS dans des plaques à 24 puits pré-enduites de poly-D-lysine. Incuber une nuit à 37 ° C. Conserver les médias restants (avec et sans les appels d'offres) à 4 ° C.
2. Stériliser les instruments et les pipettes Pasteur. Rassemblez les équipements énumérés dans le tableau des matériaux ainsi que d'une hotte de classe II à flux laminaire et un incubateur à _CO2.

3. dissection de souris Mésencéphale

1. Sacrifier une souris enceinte de E13.5 (selon les directives institutionnelles). Nettoyez l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol et d'ouvrir la paroi abdominale. Recueillir les cornes utérines, ouvrez-les avec des ciseaux délicats, disséquer chaque embryon de cornes utérines, et enlever les membranes amniotiques. Placer les embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant stérile PBS-GAB et lavez-les par transfert dans 3 salles de bains successifs identiques en utilisant une pince. Pour dissection, placer les embryons par 3 dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm.
2. Move le plat final Petri sous la loupe binoculaire. Ne pas décapiter les embryons. Avec des ciseaux Vannas, exciser le cerveau.
   1. Retirez délicatement et jeter les régions contremaîtres et du cerveau postérieur. Pour le côté rostral, couper près de la région du thalamus, de la coupe de côté caudal à la région de l'isthme, retirez le colliculus supérieur.
   2. Une fois le mésencéphale ventral est isolé, retirer délicatement les méninges à l'aide de pinces ultra-fines. Recueillir les segments disséqués, sans les méninges, dans un tube de 13 ml stérile remplie de PBS-GAB.
3. Nettoyez le tube contenant le mesencephala à fond avec 70% d'éthanol et l'amener sous le capot.

4. cellule de dissociation

1. Laver mesencephala 3x avec PBS stérile-GAB. Autoriser les fragments du cerveau à régler entre chaque lavage et d'éviter de perturber le tissu. Après le dernier lavage, éliminer soigneusement autant que possible la solution et incuber segments du cerveau dans 3 ml de trypsine / EDTA pendant 15 min à 37 ° C dans unIncubateur à CO _2.
2. Feu-polissez les pipettes Pasteur afin de maximiser la survie des neurones que la fin d'une pipette de verre non poli est forte et peuvent endommager les cellules au cours des étapes de dissociation. Légèrement réduire le diamètre de l'extrémité (jusqu'à 0,5 mm) de la pipette Pasteur tandis que le feu-polissage.
3. Retirez délicatement autant solution / EDTA trypsine que possible et ajouter 10 ml de milieu de culture / 10% les appels d'offres. Laver les segments du cerveau 3x avec milieu de culture / 10% les appels d'offres.
4. Utilisation de la pipette Pasteur polie au feu, commencer dissociation de mesencephala dans 6 ml de milieu de culture / 10% les appels d'offres. Triturez 10x (éviter les bulles d'air), permettent aux morceaux de s'installer, puis recueillir la moyenne dans un nouveau tube stérile de 13 ml.
5. Ajouter 6 ml de milieu de culture, répéter l'étape précédente une fois et récupérer le milieu contenant les cellules dissociées dans le même tube de 13 ml.
6. Centrifuger les cellules à 160 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture supplémenté avec10% mélange d'hormones.

5. cellulaire Placage

1. Compter les cellules en suspension dans une cellule de Malassez et ajuster le volume du milieu à une concentration de 600 000 cellules / ml. Environ 1,7 millions de cellules peuvent être obtenues à partir de l'un mésencéphale de souris.
2. Retirer FBS contenant un milieu de revêtement de plaques à 24 puits et ajouter dans chaque puits 1 ml de suspension cellulaire (600 000 cellules / puits, 2-4% de cellules TH +).
3. Incuber la plaque à 37 ° C et 5% _CO2 / 95% air. Pas de changement de milieu est nécessaire. Les neurones dopaminergiques sont matures après environ 5 à 7 jours in vitro (expression cohérente du transporteur de la dopamine). Maintenir les cellules en culture jusqu'à 15 jours sans remplacement du milieu.

Protocole 6 de immunofluorescence

1. Nettoyage des lamelles couvre-
   1. La veille de la dissection, ajoutez 10 ml d'HCl 1 M dans une boîte de Pétri. Lay à la surface des liquides 12-15 lamelles de verre et attendre 15 min.
   2. Coulez le couvercleglisser dans le liquide et attendre 15 min.
   3. Retirer HCl et laver 3x avec de l'eau.
   4. Laver les lamelles rapidement avec de l'éthanol pur une fois, puis ajouter de l'éthanol pur à l'antenne et attendre 30 min.
   5. Sous le capot, enlever des lamelles nettoyés dans de l'éthanol et ajouter 1 lamelle par puits d'une plaque de culture cellulaire de 12 puits en utilisant des pinces stériles.
   6. Laver deux fois avec de lamelles de l'eau stérile (1 ml / puits). Ensuite, lavez-les une fois avec du PBS stérile.
2. Revêtement des Lamelles
   1. Retirer PBS et ajouter 500 pl / puits de 2x OLP (dilué dans du PBS). Incuber pendant 4 h à 37 ° C dans l'incubateur à CO _2.
   2. Retirer la solution de l'OLP et laver 3 fois avec du PBS stérile.
   3. Retirer du PBS et ajouter 500 pl / puits de 20% les appels d'offres / 1 g / ml laminine. Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans l'incubateur à CO _2.
3. Étalement des cellules pour immunofluorescence
   1. Éliminer le milieu de revêtement de plaques à 12 puits.
   2. Ajouter 900,000 cellules / puits dans un volume de 2 ml et croître les cellules à 37 ° C dans l'incubateur. Les cellules peuvent être maintenues en culture jusqu'à 15 jours sans remplacement du milieu.
4. Immunocoloration
   1. Retirer moyen de plaques à 12 puits et laver avec 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C.
   2. Ajouter 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C, puis ajouter délicatement 160 pl / puits de 8% de paraformaldéhyde (PFA, 2% concentration finale) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
   3. Retirer PFA et laver 3 fois avec PBS / 0,1 M de glycine pendant 10 min.
   4. Retirer PBS, ajouter 300 pl / puits de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de sérum de chèvre et incuber pendant 30 min à température ambiante.
   5. Éliminer le milieu, ajouter 300 ul / puits de l'anticorps primaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Les anticorps primaires qui peuvent être utilisés pour la détection des neurones dopaminergiques et la caractérisation de la culture sont indiqués dans le tableau des matériaux. Garder1 bien sans anticorps primaire à évaluer pour le fond des différents anticorps secondaires.
   6. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes.
   7. Éliminer le milieu, ajouter 300 pl / puits d'anticorps secondaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 1 heure à température ambiante, dans l'obscurité. Anticorps secondaires utilisés sont indiqués dans le tableau des matériaux.
   8. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes.
   9. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS.
   10. Monter les lamelles sur le côté verre diapositives de cellule dans une goutte de Vectashield. Gardez les lames à température ambiante pendant la nuit pour laisser le milieu de montage à sec, puis les stocker à 4 ° C.
   11. Acquérir des images à l'aide d'un microscope confocal ou un microscope à contraste de phase équipé pour l'épifluorescence. Des images représentatives ont été acquises avec un microscope confocal Leica SP2 UV.

Résultats

Un organigramme illustré les étapes de culture de mésencéphale est représenté sur la figure 1. Brièvement, après la collecte d'embryons E13.5 de souris Swiss enceinte, mésencéphale ventral est disséqué à partir de l'ensemble de l'embryon. Les fragments isolés du cerveau sont successivement soumis à une digestion enzymatique et dissociation mécanique. Les cellules dissociées sont sédimentées par centrifugation, remises en suspension dans du milieu de culture et étalées da...

Discussion

Ce protocole présente les procédures et les réactifs nécessaires à la préparation d'une culture primaire de neurones mésencéphaliques de la souris embryonnaire et la procédure d'immunofluorescence pour détecter les neurones dopaminergiques. Les étapes critiques de la procédure sont la dissection des embryons et la dissociation mécanique des fragments de cerveau prélevés. Instruments de dissection de haute qualité contribue à maîtriser la technique de dissection. Neurones dopaminergiques constit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136