Une teneur élevée test d'imagerie pour l'identification des inhibiteurs de la neurotoxine botulique

Résumé

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Résumé

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Introduction

La bactérie Clostridium botulinum produit une neurotoxine botulique, l'une des toxines biologiques les plus puissants connus à l'homme ^1. Il ya 7 sérotypes distincts de neurotoxines botuliques (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induire une paralysie à la jonction neuromusculaire due à la protéolyse complexe SNARE ^2,3. SNARE protéolyse empêche neurotransmetteur vésicule-membrane fusion et donc blocs neurotransmetteur exocytose ^4. La cible SNARE spécifique dépend du sérotype BoNT notamment impliqué dans le processus d'intoxication. BoNT / A et BoNT / E clivent la SNAP-25 alors que BoNT / C clive les deux SNAP-25 et syntaxine ^5. Le sérotypes restants synaptobrévine Cleave (appelé aussi associée à la vésicule protéine membranaire (VAMP). BoNT / A a été choisi pour le développement de tests car il est responsable d'une forte proportion de botulisme d'origine naturelle et a la plus longue durée d'action ^6. Développement de la petite molécule thérapeutique contre BoNT / A est un objectif majeur pournotre programme de découverte de médicaments et a utilisé des méthodes à base de cibles traditionnelles pour identifier des inhibiteurs place protéolytiques actives ^{7, 8-10.} Cependant, la création d'inhibiteurs de site actif avec une activité à large spectre contre plusieurs sérotypes et post-exposition efficacité sera probablement difficile.

Nous avons donc mis en place une approche novatrice, phénotypique découverte de médicaments qui utilise BoNT SNAP-25 clivage comme critère d'évaluation fonctionnelle pour identifier les petites molécules qui peuvent bloquer BoNT médiation intoxication des neurones moteurs. SNAP-25 est nécessaire pour la libération de neurotransmetteurs, comme la dégradation de SNAP-25 est un facteur prédictif de la paralysie et de la létalité in vivo. Par exemple, le criblage cellulaire pourrait conduire à la découverte de nouveaux modulateurs de facteurs cellulaires responsables de l'inactivation de la toxine ou l'inhibition des voies de toxines dans les cellules ciblées. Un facteur important dans le développement de tests phénotypiques est la sélection de modèles biologiques physiologiquement pertinents. We et d'autres ont décrit la souris souches embryonnaires (ES) motoneurones dérivés de cellules qui récapitulent le caractère immunologique de neurones moteurs primaires, y compris l'expression de SNAP-25 ^{11- 13.} Fait important, ces systèmes cellulaires sont très sensibles à la BoNT / A et démontrent l'intoxication clivage dépendant de la dose de SNAP-25 en réponse à des concentrations de toxine ^11,12 croissant. Les neurones moteurs différenciés sont également produites en quantités suffisantes pour l'analyse comparative de la plaque à haut débit et a permis la conception d'un ensemble de tests cellulaires.

Le test phénotypique est une méthode d'immunofluorescence utilisant deux anticorps distincts à quantifier clivage de pleine longueur exprimé de manière endogène SNAP-25 au cours de la BoNT / A ivresse de la culture souris du motoneurone. Un terminal carboxyle de BoNT / A (BACS) de clivage anticorps qui reconnaît sensible seulement longueur SNAP-25 permet l'évaluation de la BoNT / A à médiation par protéolyse de SNAP-25expression dans le moteur de la souris ¹⁰ neurones. Un schéma de principe du dosage du HCl est représenté sur la figure 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Plate 20000 différenciées des cellules ES de souris (MES) / puits dans une lysine 96 plaques revêtues de poly-D et ainsi maintenir dans des neurones moteurs milieux de différenciation terminale pour les 7/5 jours.

1. Administration composé et intoxication avec BoNT / A

Effectuer tous les travaux suivants dans un boîtier BSL2 pour maintenir la conformité avec les lignes directrices des CDC / NIH.

1. Préparer 10 mM solutions de chaque composé bibliothèque dans 100% de DMSO en polypropylène plaques à 96 puits. Utilisez le 10 mM à préparer une plaque de dilution intermédiaire qui est 10 fois supérieure à la concentration de dépistage souhaité. Préparer 100 uM plaque intermédiaire à raison de 10 mM en plaque de 96 puits et diluer à 100 uM en utilisant des milieux de culture. Distribuer 10 pl des composés sur 90 pi de milieu sur les cellules ^11. Tester les composés à 10 uM de concentration finale et assurer le pourcentage final de DMSO ne doit pas excéder 0,5%.
2. Effectuer toutes goujons qui utilisent des cellules vivantes et la toxine active sous le niveau de biosécurité 2 conditions. Remplacez les médias dans les plaques à 96 puits avec 80 ul de milieu de différenciation terminale frais à l'aide d'un manuel 12 canaux pipette. Effectuer aspiration et distribuer étapes en lignes pour éviter l'exposition des cellules sans les médias à l'air ambiant.
3. Pré-traiter les cellules avec des composés avant l'application de la toxine par l'addition de 10 pl de 10x composés de la plaque de source à l'aide d'une pipette 12 canaux, suivi du mélange par aspiration (deux fois). Pour chaque plaque de 96 puits, traiter deux colonnes de 6 puits avec 10x DMSO dilué dans les médias pour servir de signal élevé et les contrôles de signaux faibles. La colonne sans traitement BoNT présente le plus haut niveau de la longueur SNAP-25 (contrôle de signal haute). Traiter l'autre colonne avec BoNT seul (sans composés) que le contrôle de signal faible. Utiliser une faible contrôle pour observer l'efficacité de clivage BoNT de SNAP-25 et sa détection par l'anticorps BACS (Figure 2).
4. Incuber les cellules avec les composés pendant 30 min à 37 ° C et 6% de CO ₂ dans l'incubateur de culture cellulaire.
5. Préparation à partir de neurotoxine botulinique A a 1 mg / ml source commerciale dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un stock de travail 10x finale par dilution avec un milieu de différenciation terminale.
6. Initier intoxication par addition de 10 pl de 10x BoNT / Un stock dans les puits désignés pour le traitement et faible signal commande à l'aide d'une pipette multicanaux (figure 2). Traiter les puits désignés comme un grand contrôle avec le milieu seul.
7. Décontaminer tous articles en plastique et autres produits jetables qui entre en contact avec BoNT / A au cours de l'étude par immersion dans une solution d'hypochlorite de 0,825% dans l'eau pendant au moins 20 min. Effectuer toutes les procédures dans les armoires de biosécurité et de décontaminer les zones de travail à la fois avant et après des expériences avec 5% de détergent désinfectant nettoyant comme solution MicroChem.
8. Étiqueter clairement les plaques d'un usage de la toxine et Incubmangé plaques traitées avec 1 nM / l de BoNT / A pendant 4 heures à 37 ° C et 6% _de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. Afficher une signalisation appropriée pour informer les collègues que la toxine est en usage dans le laboratoire.
9. Arrêter BONT / A clivage protéolytique par le méthanol fixation. Retirez le support contenant la toxine et composés à partir de chaque puits avec une pipette multicanaux et jeter dans une solution d'eau de Javel à 10%. Ajouter de la glace du méthanol froid (100 pi) directement à chaque puits.
10. Incuber les plaques pendant 15 min à température ambiante (TA) pour permettre la fixation de se produire.
11. Après fixation, gérer en toute sécurité les réactifs mis au rebut (considérés comme neutralisés) avec un niveau de biosécurité 1 protocoles et jeter en conséquence.
12. Jeter méthanol et utiliser 100 pi de PBS à laver les cellules et les réhydrater avant la coloration immunologique. Effectuer deux lavages PBS supplémentaires.
13. Après le lavage final, laisser PBS dans les puits, des plaques d'étanchéité avec un film adhésif de microplaques et conserver à 4 ° C jusqu'à l'analyse. plaques de conserver à 4 ° C for plusieurs jours.

2. Immunocoloration

La procédure de coloration immunologique est une opération en plusieurs étapes de main-d'œuvre qui comprend répétitives réactifs cycles distribution / aspirer et un lavage intensif de plaque qui peut conduire à l'introduction potentielle de variabilité significative intraplaque et interplaque. Une approche semi-automatique est appliqué pour enregistrer le temps du personnel de laboratoire, d'augmenter le débit essai, et minimiser la variabilité immunomarquage.

1. Utiliser un poste de travail automatisé équipé d'une tête de 96 bien capable de transférer des volumes allant jusqu'à 250 pi et intégré avec un bras de préhension robotisé pour déplacer du matériel de laboratoire en différents endroits sur le pont modulaire (voir Matériel et équipement) pour ce protocole.
   1. La plate-forme modulaire est conçu pour accueillir différents types de matériel de laboratoire et peut supporter jusqu'à 11 articles en tout temps. Le gestionnaire de microplaques automatisé est équipé d'un magasin à double empilement de microplaques pour maintenir etmanipuler jusqu'à 50 plaques par cycle.
   2. Le poste de travail automatisé est situé à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique de classe II conçus pour l'équipement d'automatisation de laboratoire pour assurer la stérilité et de la sécurité. Par immunomarquage automatique, le pont est disposé comme représenté sur la figure 3 afin de permettre l'accès des réactifs en fonction des besoins et sans intervention humaine.
2. Plaques pré-charge contenant des cellules fixes dans le magasin de la plaque et le transfert de la plate-forme en tant que nécessaire pour les opérations de manipulation de liquides. Utilisez la tête 96 de la pipette équipée avec 250 pi conseils pour aspirer PBS dans les puits jusqu'à 10 pi. Perméabiliser les membranes cellulaires pour faciliter la liaison à des cibles intracellulaires avec le tampon de perméabilisation (0,1% de Triton-X 100) anticorps. Distribuer tampon de perméabilisation (100 ul) dans chaque puits des plaques avant de revenir à la deuxième magasin de stockage de l'empileur de microplaques pendant une incubation de 15 min à température ambiante (RT).
3. Retirer le tampon de perméabilisation et perform lavage de la plaque avec du PBS (deux fois), comme décrit précédemment à l'étape 1.13.
4. Après la dernière étape de lavage, éliminer le tampon PBS et dispense 100 pi de tampon de blocage contenant 1% de sérum de cheval et 0,1% de Tween 20 dans du PBS dans tous les microplaques avant de les retourner au magasin de plaques pendant 1 heure d'incubation à la température ambiante.
5. Utilisez deux anticorps primaires pour immunomarquage: un anticorps anti-souris BACS polyclonaux de lapin, pour la détection de SNAP-25 et un anticorps monoclonal de souris pleine longueur anti-III anticorps de la tubuline pour la détection de neurones (voir Matériel et équipement). Après 60 min d'incubation, éliminer le tampon de blocage et dispenser 50 pi de 4ug / ml d'anticorps BACS et 0,5 pg / ml de III-tubuline dans un tampon de blocage dans les plaques.
6. Incuber pendant 1 heure à la température ambiante éliminer les anticorps primaires et laver trois fois avec 100 ul de PBS contenant 0,05% de Tween (PBST).
7. Utilisation d'une IgG anti-souris marqué avec Alexa Fluor 647 de visualiser le -III tubuline et anti-IgG de lapin marqués avec Alexa FLuor 568 pour visualiser les anticorps BACS. Préparer les anticorps en tant que 2 ug / ml de la dilution dans du tampon de blocage et distribuer 50 pi du mélange dans chaque puits.
   REMARQUE: Les anticorps secondaires sélectionnés pour immunomarquage sont marqués avec des fluorophores différents pour permettre la détection de leur lumière fluorescente émise à des longueurs d'onde distinctes en utilisant différents canaux à l'intérieur du détecteur de l'imageur à haute contenu.
8. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer les anticorps secondaires et laver 3 fois avec 100 pi de PBST.
9. Après le lavage final, ajouter 100 ul de PBS contenant du colorant Hoechst (32 uM) pour colorer l'ADN pour la détection des noyaux.
10. Sceller les plaques avec un film imperméable lumière pour protéger les fluorophores de photoblanchiment. Les plaques peuvent être conservées à 4   ° C pendant plusieurs semaines sans perte significative de signaux.

3. Imaging

REMARQUE: Effectuer l'acquisition d'images à l'aide de haut contenu Imaging Syssystème (Voir matériel et équipement).

1. Spécification de haute teneur Définitions Imager:
   1. Sélectionnez le type de plaque, mise en page, le nombre de champs, objectif: Greiner u clair, le format 96 puits, 16, respectivement 20X eau.
   2. Sélectionnez les canaux: noyau excitation EX: 405 nm comme canal 4; cytoplasme EX: 644 nm comme canal 2; antigène spécifique canal d'anticorps EX: 561 nm comme canal 3 et Configurer la puissance d'excitation de chaque laser, expérience d'installation comme deux expositions, exposition 1 avec une excitation à 644 nm, exposition 2 avec deux excitations à 405 nm et 561 nm. Sélectionnez binning comme Bin2.
   3. Utilisez les puits de contrôle élevés pour l'optimisation de l'exposition avec une intensité maximale SNAP-25 canaux et puits de faible contrôle de l'intensité minimale.
   4. Réglez l'exposition, de sorte que l'intensité de chaque canal est d'environ la moitié du niveau de saturation (2000-2500 unités relatives).
   5. Identifier le plan optimal de Z sur le canal de masque de cellule à l'aide delta script de correction. Voir Figure 5 pour les résultats après immunomarquage et d'imagerie. Exporter des données vers le serveur où le logiciel d'analyse d'image réside.

4. Analyse d'image (Figure 6)

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent l'application des algorithmes logiciels Columbus.

1. Sélectionnez un algorithme approprié pour segmenter les objets primaires (noyaux). Si nécessaire, ajuster les seuils de fond et les paramètres de contraste. Le logiciel Columbus propose 4 méthodes de détection des noyaux. Sélectionnez la méthode que les noyaux des segments avec précision par une inspection visuelle noyaux segmentés (en F igure méthode 6a M est sélectionné).
2. Sélectionnez l'algorithme de neurites (CSIRO Neurites Analyse 2) de segmenter les neurites Si nécessaire, ajuster les paramètres de seuil de fond et de contraste pour enlever fond. Voir Figure 6b pour les paramètres utilisés pour détecter les neurites.
3. Identifier les régions de neurites (segments de neurites) de based sur des objets secondaires (neurites) en utilisant une extension de pixel de -3 de la tubuline β-canal III (Alexa farine 640) comme masque (Figure 6c).
4. Calculer l'intensité des canaux de signaux (SNAP-25, (568) Alexa farine pour la région des neurites et le canal de la tubuline β-III (Figure 6d et 6e).
5. Sélectionnez les paramètres souhaités pour l'exportation, telles que la longueur des neurites, des intensités moyennes de SNAP-25, la tubuline β-III, le nombre de noyaux, numéro de segment neurites, etc. (figure 6f).
6. plaques de transfert de gerbeurs de plaques à l'aide du robot et la charge dans le Haut-Imager contenu pour l'acquisition de l'image.

5. Analyse des données:

Pour évaluer la robustesse de l'essai conçu, calculer les paramètres suivants de l'expérience en fonction de plaque.

1. Signal (S) à fond (B): S / B = intensité du contrôle du signal haute moyenne) / moyenne intensité de faible contrôle du signal
2. coefficient de variation (CV) de signal et de fond (pour mesurer l'uniformité du signal spécifique): CV = (écart-type (SD) / moyenne de l'échantillon) * 100 (%), pour déterminer la variabilité dans la manipulation de liquides, réactifs, etc.
3. Signal to Noise: S = (intensité de signal de dire - l'intensité de faible contrôle de signal moyenne) / SD de faible contrôle
   1. Calculer le facteur Z 'avec ivresse de la moitié d'une plaque de 96 puits et une intoxication maquette de l'autre moitié. Z '= 1 - 3 * (SD de contrôle de signal haute + SD de faible contrôle du signal) / (moyenne de contrôle de signal haute - moyenne faible contrôle de signal). Pour une analyse plus approfondie des données de dépistage, de normaliser certains des paramètres premières primaires sur une base de plaque pour permettre la comparaison entre les plaques et entre les différents jours d'expériences.
4. Pour cent de clivage, ce qui reflète la réduction du signal associé à la longueur totale de SNAP-25 détectée par un anticorps spécifique (BACS): Clivage% = 100% * (mean intensité de contrôle de signal haute - l'intensité de l'échantillon) intensité de contrôle de signal de haute / moyenne.
5. Pour cent de l'inhibition de clivage:% d'inhibition = 100% * (intensité de l'échantillon - intensité de faible contrôle de signal moyenne) / (intensité de commande de signal haute moyenne - faible intensité de contrôle de signal moyenne).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Les données de contrôle hautes et basses créés deux populations distinctes de la différence de deux valeurs médianes supérieures à trois écarts-types (figure 7A). Le but du processus de sélection est de trouver des composés sein de la population de l'échantillon avec des valeurs plus proches de la population de contrôle positif, en supposant une distribution normale au sein de la population de l'échantillon (figure 7B, (i)). Les points de données qui sont 3 écart...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

La puissance élevée de neurotoxines botuliques et la facilité relative de leur armement a abouti à leur classification dans la catégorie A (priorité) les agents de bioterrorisme par les US Centers for Disease Control and Prevention. Malheureusement, il n'y a pas approuvé par la FDA thérapeutiques pour contrer BoNT intoxication après la toxine a été intériorisée par les neurones moteurs. Tout mécanisme druggable qui favorise la récupération neuronale de BoNT intoxication pourrait conduire à l'él...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack