Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Résumé

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Résumé

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

L' ingénierie tissulaire cardiaque a beaucoup progressé dans la dernière décennie, avec plusieurs groupes d' édition de résultats, les tissus entièrement fonctionnels en battant fabriqués à partir de deux cardiomyocytes murins ^1-6 et, plus récemment, les myocytes cardiaques de cellules souches dérivées humaines ^7-12. Le domaine de l' ingénierie du tissu cardiaque est entraîné par deux objectifs principaux et essentiellement indépendants: 1) pour développer des greffes exogènes qui peuvent être transplantées dans des cœurs défaillants pour améliorer la fonction ^4-6; et 2) pour développer des modèles in vitro pour étudier la physiologie et de la maladie, ou comme outils de dépistage pour le développement thérapeutique ^2,7.

Dimensions Trois (3-D) culture cellulaire est considérée comme essentielle pour le développement d'outils de dépistage de la prochaine génération, comme la matrice 3-D reflète un microenvironnement cardiaque plus naturel que la culture traditionnelle 2-D cellulaire monocouche; En effet , certains aspects de la biologie cellulaire sont fondamentalement différents en 2-D cultures par rapport à 3-D ^13,14 . En outre, les tissus cardiaques modifiés sont construits à partir de composants complètement définies: une matrice extracellulaire et d'une population cellulaire. Pour les tissus cardiaques humains génétiquement traditionnels, tandis que la composition de la matrice extracellulaire (habituellement fibrine ou collagène ^{9 7,8,10)} est strictement contrôlée, la composition de la cellule d'entrée est moins bien définie, avec l'ensemble du mélange de cellules à partir d' une différenciation cardiaque dirigée soit les cellules souches embryonnaires (ESC ^7,9) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP ^10,12) étant ajoutés aux tissus. En fonction de la lignée cellulaire spécifique et l'efficacité du protocole de différenciation utilisé, le pourcentage résultant de cardiomyocytes peut varier de moins de 25% à plus de 90%, le phénotype des cardiomyocytes spécifique (c. -à ventricular-, atrial- ou pacemaker) peut également varier, même la fraction non-cardiomyocytes peut être très hétérogène ^15,16 et de modifier la maturité du m cardiaque différenciéyocytes ^17.

Récentes cardiaque travaux de génie tissulaire a tenté de contrôler la population d'entrée des cellules, soit avec une surface les marqueurs ¹⁸ reporter cardiaque lignée de cellules souches embryonnaires humaines ⁸ ou de la cellule utilisée pour isoler la composante de myocytes cardiaques de la différenciation. Bien qu'initialement un tissu composé de seulement myocytes cardiaques semble être l'idéal, cela est en fait pas le cas; hECTs composés uniquement de myocytes cardiaques ne parviennent pas à compacter dans des tissus fonctionnels, avec certains groupes de trouver un rapport de 3: 1 des myocytes cardiaques: fibroblastes produisant la force de contraction le plus élevé ^8. En utilisant différents procédés de sélection de cellules, y compris les marqueurs de surface pour le tri des cellules vivantes, il est possible de créer hECTs avec des populations cellulaires définies. Tandis que les marqueurs de cellules stromales non cardiaques sont disponibles depuis un certain temps, tels que le marqueur CD90 des fibroblastes putatif ^19,20, les marqueurs de surface des myocytes cardiaques ont été plus difficilespour identifier. SIRPα a été parmi les premiers marqueurs de surface cardiaques identifiés pour les cardiomyocytes humains ¹⁸ et il a été montré très sélectif pour la lignée cardiaque. Récemment, nous avons constaté que double tri pour SIRPα ⁺ et CD90 ^- cellules cardiomyocytes rendements presque purs, avec le CD90 ⁺ population présentant un phénotype de type fibroblaste (Josowitz, observations non publiées). Sur la base de ces constatations recueillies, nous décrivons ici la création d' hECTs en utilisant un 3: 1 combinaison de SIRPα ⁺ / CD90 ^- cardiomyocytes et CD90 ⁺ fibroblastes.

La capacité à concevoir un tissu cardiaque humain complètement défini est essentiel non seulement pour créer des outils de dépistage robustes, mais aussi pour le développement de systèmes modèles pour étudier émergents cellules et thérapies cardiaques géniques. En particulier, de nombreuses thérapies cellulaires pour l' insuffisance cardiaque, en utilisant des types de cellules incluant des cellules souches mésenchymateuses (MSC) ²¹ , les cellules souches cardiaques ²² et les cellules mononucléaires de la moelle osseuse ^23-25 ​​ont été testés dans des essais cliniques. Bien que plusieurs des premiers résultats ont été prometteurs ^21,23,25, la prestation initiale diminue souvent au fil du temps ^26-29. Une tendance similaire a été rapportée dans murins d' ingénierie des tissus cardiaques, qui présentent un avantage fonctionnel important en raison de MSC supplémentation, mais l'avantage ne ​​soit pas soutenue pendant la culture à long terme ^1. Sous-jacent la performance sous-optimale est notre connaissance limitée des mécanismes régissant les thérapies cellulaires. Une meilleure compréhension de la façon dont les cellules thérapeutiques exercer leur influence bénéfique, ainsi que les conséquences négatives potentielles des interactions myocytes-nonmyocyte, permettrait le développement de thérapies améliorées qui donne des avantages cliniquement significatifs et durables, avec des effets secondaires minimes, pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque.

Ici, nous décrivons l'utilisation de hECTs définies à interrogate mécanismes de thérapie cellulaire. La composition tissulaire contrôlé est essentiel d'identifier les facteurs spécifiques qui influent les performances des cardiomyocytes. Directement complétant hECTs avec le type de cellules d'intérêt thérapeutique (par exemple, MSCs), peut révéler les effets sur la performance cardiaque de myocytes, comme nous l' avons démontré dans ECTs de rat ^1.

Le protocole en plusieurs étapes suivant commence par la différenciation des cellules souches cardiaques dirigée, suivie par la fabrication du bioréacteur multi-tissulaire, et se terminant par une description de la construction de tissu et l'analyse fonctionnelle. Nos expériences sont effectuées en utilisant la ligne H7 NIH approuvé les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Cependant, les protocoles suivants ont également été testés en utilisant une lignée de CSEh supplémentaire et trois induite cellules souches pluripotentes (hiPSC) lignes avec des résultats similaires. Nous avons constaté que l'efficacité dans la différenciation des cardiomyocytes et de succès dans la fabrication HECT peut être lignée cellulaire dépendante, en particulier for lignes hiPSC dérivées de patients individuels. En suivant ce protocole, deux plats de 6 puits sont plaquées avec un total de 1,68 millions de CSEh (140.000 cellules par puits), ce qui donne environ 2,5 millions de myocytes après différenciation pendant 20 jours et le tri, assez pour faire six tissus définis.

Protocole

Remarque: Effectuez toutes les manipulations de cellules dans des conditions aseptiques en utilisant une classe II enceinte de sécurité biologique de filtre HEPA et stériliser toutes les solutions en les filtrant à travers un filtre de 0,2 um. Effectuer la construction des tissus et des tests de fonction soit dans les mêmes conditions aseptiques ou une hotte à flux laminaire.

1. Ensemencement des H7 CSEh dans la préparation pour Différenciation cardiaque

1. (Jour 1) Préparation de la membrane basale Matrice
   1. Décongeler 150 ul aliquote de CSEh matrice de membrane basale qualifiée sur la glace durant la nuit à 4 ° C.
2. (Jour 0-4) Placage des CSEh sur des plaques revêtues
   1. Diluer la matrice décongelé dans 12 ml de glace-froid DMEM / F12 et bien mélanger.
   2. Transfert 1 ml de la solution / F12-matrice DMEM dans chaque puits d'une boîte de culture de tissu à 6 puits traités. Chaque aliquote de matrice peut recouvrir deux plaques 6 puits.
   3. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant au moins 1 h.
      Remarque:notre expérience, les plats revêtus scellés avec de la paraffine peuvent être stockés dans une solution de matrice à 4 ° C pendant jusqu'à 10 jours avant utilisation.
   4. À environ 75% de confluence, se dissocier hESC H7 de l'antenne parabolique de 10 cm en utilisant 6 ml de réactif de dissociation non enzymatique. Après 5 min, gratter doucement les cellules de la surface de culture en utilisant un grattoir à cellules à usage unique et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml de centrifugation stérile.
   5. Retirer 0,5 ml de la solution de dissociation des cellules provenant du tube de 15 ml et le transfert à un nouveau tube ml stérile 15 (en laissant 5,5 ml du réactif de dissociation pour dissocier en outre l'hESC) pour la propagation de la lignée de cellules souches.
   6. Pellet les 0,5 ml de cellules à 300 xg pendant 5 min à 20 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement dans 8 ml de milieu de cellules souches pluripotentes contenant 1% de pénicilline-streptomycine , puis transfert à un nouveau revêtu, de 10 cm pour culture de tissus et de maintenir 37 ° C et 5% de CO ₂ pour maintenir la lignée de cellules souches.
      Remarque: Gardez les médias sur les cellules souches pluripotentes sur la glace lors des changements de médias.
   7. Pendant ce temps, ajouter 5,5 ul de 10 mM d'inhibiteur de ROCK Y-27632 à 5,5 ml de solution restante de dissociation et de continuer à incuber à la température ambiante pendant encore 5 à 10 min. Mélanger délicatement les cellules avec un 5 ml pipettes sérologiques. Continuer à incuber jusqu'à obtenir une suspension cellulaire unique est obtenue, puis sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
   8. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu de cellules souches pluripotentes et d'effectuer un comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre.
   9. Seed chaque puits de la plaque à 6 puits à une densité de 140.000 cellules par puits. Ensemencer deux plaques 6 puits pour créer un total de six tissus définis. Éliminer toutes les cellules restantes après placage.
   10. Remplir les puits de 1 ml avec des milieux de cellules souches pluripotentes et incuber à 37 ° C, 5% de CO _2. Vingt-quatre heures plus tard, retirez le support et ajouter 2 ml de milieu de cellules souches pluripotentes frais à chaque puits (figure 1A ).
   11. Vérifiez la confluence des plaques chaque jour et commencer la différenciation une fois que les cellules atteignent environ 75% de confluence (Figure 1B - D).

2. (Jour 4-24) Différenciation des embryons humains Cellules souches à cardiomyocytes ^30,31

1. (Jour 4-7, Différenciation Day 0-3) Mesoderm Induction
   1. Préparer un milieu RPMI différenciation I (tableau 1) en combinant 500 ml de RPMI 1640 avec 10 supplément ml B27 (sans insuline) et 5 ml de solution mère de pénicilline-streptomycine (10 000 UI / ml de pénicilline, 10 000 ug / ml de streptomycine). Aliquoter, sur la glace, en tubes de 50 ml et conserver à 4 ° C.
   2. (Jour 4, Différenciation jour 0) Préparer mésoderme médias d'induction en ajoutant 2,4 ul du CHIR99021 petit inhibiteur de GSK3 molécule (10 mM, 6 pM concentration finale) à 12 ml de milieu de différenciation RPMI I. Supprimer les médias de cellules souches pluripotentes de chaque puits unend remplacer par 2 ml de médias mésoderme d'induction par puits. Remettre la plaque dans l'incubateur.
      Remarque: la mort cellulaire significative se produit généralement avec l'addition d'CHIR99021 (figure 1E). La monocouche se rétablira, mais il est important de rincer les cellules mortes loin avec le rinçage DMEM / F12.
   3. (Jour 5, Différenciation Jour 1) Préparer les médias mésoderme à induction frais comme décrit ci-dessus. Retirez les médias de chaque puits et rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits. Ajouter 2 ml de milieu mésoderme d'induction fraîche à chaque puits.
      Remarque: Rinçage chaque jour de la Journée 0-10 augmente considérablement le rendement et la pureté des myocytes cardiaques.
   4. (Jour 6, Différenciation Jour 2) Supprimer les médias d'induction cardiaques et rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits. Remplacer le rinçage avec 2 ml de RPMI médias de différenciation I (pas de petites molécules ajouté, mais toujours avec le B27 (sans insuline) supplément) et revenir à l'incubateur.
2. (Jour 7-13, Différenciation Day 3-10) Cardiac Mesoderm Induction
   1. (Jour 7, Différenciation Jour 3) Préparer cardiaque médias mésoderme d'induction en ajoutant 6 pl de la petite molécule Wnt inhibiteur IWR-1 (10 mM, 5 uM final) à 12 ml de RPMI médias de différenciation I.
   2. Retirez le support de chaque puits, rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits et le remplacer par 2 ml de cardiaque médias mésoderme d'induction par puits.
   3. (Jour 8, Différenciation Jour 4) Préparer un 12 ml supplémentaires de milieu d'induction du mésoderme cardiaque comme décrit ci-dessus. Retirez le support ajouté la veille, rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits et le remplacer par 2 ml de milieu frais de différenciation mésoderme cardiaque par puits et retourner à l'incubateur.
   4. (Jour 9-10, Différenciation Day 5-6) Sur les deux jours, retirez les médias cardiaques mésoderme à induction et rincer chaque puits avec 1 ml de DMEM / F12.
   5. Ajouter 2 ml de milieu frais de différenciation RPMI I (pas de petites molécules ajoutées, mais toujours avec le B27 (sans insuline) supplément)à chaque puits et retourner la plaque dans l'incubateur.
3. (Jour 11-24, Différenciation Day 7-20) hES dérivés cardiaque Organisation myocytes / Maturation
   1. Préparer le milieu RPMI de différenciation II (tableau 1) en combinant 500 ml de RPMI 1640 avec supplément de 10 ml de B27 (avec de l' insuline) et 5 ml de solution mère de pénicilline-streptomycine. Aliquoter, sur la glace, en tubes de 50 ml et conserver à 4 ° C.
   2. (Jour 11, Différenciation Jour 7) Retirez le support de différenciation RPMI (sans insuline) de chaque puits et rincer avec 1 ml de DMEM / F12. Remplacer par 2 ml de nouveaux médias de différenciation RPMI II (avec l'insuline) à chaque puits et revenir à l'incubateur.
      Remarque: battre spontanée doit d'abord être observée entre les jours 7 et 10. Si battage est pas observée pendant ce temps, il indique généralement une faible efficacité de différenciation. Le protocole peut être poursuivi jusqu'à ce jour 15 dans un effort pour observer les coups, mais si aucun battement est observé par jour 15 il est préférable de stes une nouvelle différenciation.
   3. (Jour 12-24, Différenciation Day 8-20) Chaque jour, supprimer les anciens médias de différenciation et le remplacer par 2 ml de RPMI frais médias de différenciation II par puits pour permettre la maturation des cellules et de l' organisation de la monocouche de battage (Figure 1F, Vidéo Figure 1 ).
      Remarque: En fonction de la mort cellulaire résiduelle, il peut être nécessaire de rincer avec 1 ml de DMEM / F12 par jour de différenciation 10.

3. (Jour 24, Différenciation Jour 20) Isolement de myocytes cardiaques et de cellules fibroblaste

1. Dissocier les cellules de la monocouche
   1. Retirez le support de différenciation et rincer une fois avec 1 ml de PBS.
   2. Désolidariser les monocouches avec 1 ml de la solution de dissociation enzymatique (0,04% trypsine / 0,03% d'EDTA) dans chaque puits.
   3. Déplacer la plaque dans l'incubateur pendant 10 min. Pendant ce temps, ajouter 12 ul d'inhibiteur de ROCK 6 ml de solution de trypsine de neutralisation.
   4. Gently ajouter 1 ml de la solution de trypsine de neutralisation contenant l'inhibiteur de ROCK à chaque puits de la plaque pour neutraliser la solution de trypsine.
   5. L'utilisation d'un transfert pipette stérile, mélanger doucement chaque puits pour briser les amas de cellules.
   6. Transférer tous les 12 ml de la plaque de 6 puits dans un tube de 15 ml centrifugeuse.
      Note: Depuis deux plaques de 6 puits sont utilisés dans ce protocole, deux tubes de 15 ml seront nécessaires.
   7. Transfert 3 ml de PBS dans un puits de la plaque, puis transférer séquentiellement les mêmes 3 ml à chaque puits à la suite de recueillir toutes les cellules résiduelles sur le plat. Transférer les 3 ml restants de la finale et dans le même tube de 15 ml de centrifugeuse contenant les cellules.
   8. Pellet à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C.
2. Préparer les cellules pour cellules vivantes Tri par FACS
   1. Préparer le tampon de coloration en ajoutant 5 ml de sérum bovin fœtal à 45 ml de PBS sur de la glace avec 50 ul d'inhibiteur de ROCK.
   2. Retirer le surnageant de la cellule pelsoit (dans 3.1.8) et remettre en suspension dans 1,2 ml de tampon de coloration.
   3. Transférer 200 pi de la suspension cellulaire à une nouvelle pré-refroidi, 50 ml tube de centrifugation sur la glace. Ce sera le contrôle de la coloration négative.
   4. Transférer le 1 ml restante de la suspension cellulaire à une nouvelle pré-refroidi, 50 ml tube de centrifugation sur la glace et ajouter 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (dilution 1: 500) et 4 pi de CD90-FITC (dilution 1: 250) . Mélanger délicatement la suspension cellulaire avec une pipette de transfert et de retour sur la glace.
   5. Incuber à la fois le contrôle négatif et de l'échantillon, sur un agitateur à bascule, sur la glace, à 4 ° C pendant 1 heure.
   6. Préparer des tubes de prélèvement d'échantillons en ajoutant 3 ml de milieu RPMI (avec de l'insuline) à deux tubes de 15 ml de centrifugeuse. Ajouter 3 ul d'inhibiteur de ROCK à chaque tube et stocker sur la glace.
   7. Pellet les cellules colorées à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et rincer deux fois avec au moins 10 ml de PBS glacé par rinçage.
   8. Ajouter 1 pi de DAPI (1 pg / ml) à 5 ml de tampon de coloration. Doucementremettre en suspension le culot échantillon avec 1-3 ml de tampon de coloration contenant DAPI à l'aide d'une pipette de transfert.
   9. Ajouter 500 pi de tampon de coloration (sans DAPI ajouté) au témoin négatif.
   10. filtrer doucement à la fois le contrôle négatif et de l'échantillon à travers un tamis de 40 um cellulaire pour éliminer des amas de cellules et transférer au polystyrène tubes FACS sur la glace. amener immédiatement les échantillons à la trieuse de cellules.
   11. Similaires à des cellules vivantes établi des méthodes de tri ^18, utilisent le contrôle négatif pour définir les portes, sélectionner des cellules vivantes (DAPI négatif) et recueillir les deux le FITC ⁺ (ie, CD90 ⁺ fibroblastes) et PE / Cy7 ⁺ (ie, SIRPα ⁺ cardiomyocytes ) populations indépendamment à 20 psi (Figure 2).
       Remarque: Après avoir réglé les portes, le contrôle négatif peut être fixé dans 4% PFA afin de déterminer l'efficacité de la différenciation par coloration pour la troponine cardiaque-T.
       Remarque: Certains chercheurs préfèrent utiliser unisotype contrôle plutôt que le contrôle des souillures pour régler les portes afin de compenser pour la liaison d'anticorps non spécifique. Un soi-disant fluorescence moins un (FMO) le contrôle est une autre possibilité. En raison de la distribution bimodale claire de la FITC, DAPI et signaux PE-Cy7, nous gated de la population positive conservatrice visant loin dans la grille positive, ce qui exclut peut-être quelques vrais positifs, mais contribue à minimiser les faux positifs.
3. Cellule réagrégation dans la préparation pour le génie tissulaire
   1. Une fois le tri cellulaire, sédimenter les deux tubes de prélèvement et remettre en suspension dans 1 ml de DMEM contenant 10% de sérum bovin néonatale, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,2% amphotéricine B ( "media NBS").
   2. Combinez le SIRPα ⁺ et CD90 ⁺ dans un rapport de 3: 1 et plaque les cellules combinées dans une culture non-tissu traité boîte de Pétri à une densité de 2 millions de cellules par 60 cm ² (boîte de 10 cm). Ajouter 10 ml de milieu NBS et 101; l d'inhibiteur de ROCK Y-27632.
   3. Placer une suspension de cellules dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures pour permettre la réagrégation cellulaire en petits amas.

Tissue Engineering 4. cardiaque humaine

1. Fabriquer le bioréacteur multi-tissus
   Remarque: Pour compléter les illustrations de la figure 3A, les fichiers CAO avec des schémas de conception de bioréacteurs détaillées sont disponibles sur demande auprès des auteurs.
   1. Machine maître moule PDMS par forage de six trous espacés de 0,5 mm de diamètre dans un 9 x 33 x 3,25 mm parallélépipède de polytétrafluoroéthylène.
   2. L' utilisation d' une fraise, machine à un cadre de polysulfone mesurant 25 x 35 x 11 mm ^3. Le but du cadre est de tenir les PDMS postes (construits à partir de la distribution faite ci-dessus) en alignement avec les puits de la plaque de base.
   3. L' utilisation d' un 1 mm endmill, machine 6 puits (6 x 1 x 1 mm ^3), 4 mm à l' écart dans un morceau de poly noir 20 x 40 x 5 mm ³tétrafluoroéthylène pour former le socle.
   4. Mélanger la base élastomère et un agent de durcissement pour polydiméthylsiloxane (PDMS) en 10: 1 rapport p / p et ajouter au moule de polytétrafluoroéthylène personnalisé (étape 4.1.1) pour créer deux rangées de six postes de force de détection, et incuber pendant la nuit et sous vide à 80 ° C. Après durcissement, enlever délicatement les PDMS du moule maître et marquez soigneusement les sommets de chaque poste avec un marqueur permanent noir pour un contraste amélioré et automatisé en temps réel le suivi post déviation.
      Remarque: polytétrafluoroéthylène est assez doux et peut être facilement endommagés. Faites attention lors du nettoyage du moule maître avant PDMS coulée pour assurer la longévité du système et de la géométrie PDMS post cohérente. Un fil de 0,5 mm peut être utilisé pour nettoyer les trous pour les poteaux après chaque utilisation, mais prendre soin de ne pas racler l'intérieur des trous.
      Note: Une alternative est de dégazer les PDMS sous vide pendant plusieurs heures à la température ambiante, puis laisser le remède mélange à la pression ambiante.Cela peut conduire à moins de bulles de gaz résiduels qui se forment dans le PDMS pendant le processus de durcissement.
   5. Stériliser tous les composants dans un autoclave à vapeur.
      Remarque: Le maître moule PDMS (étape 4.1.1) et le cadre de polysulfone (étape 4.1.2) sont à la fois réutilisables. Les PDMS postes créés à partir de la distribution (étape 4.1.4) est également réutilisable, mais seulement pour environ 10 utilisations. Cependant, plus PDMS messages peuvent être créés au besoin à l'aide du moule maître.
2. Recueillir les cellules cardiaques refusionnés
   1. Retirer les cellules refusionnés de l'incubateur et transférer tous les 10 ml du milieu de la réagrégation dans un tube centrifuge de 50 ml.
   2. Rincer la plaque avec 3 ml de PBS et transférer le liquide de rinçage dans le même tube centrifuge de 50 ml contenant le milieu de la réagrégation.
   3. Ajouter 3 ml de 0,04% de trypsine / 0,03% d'EDTA à la boîte de 10 cm et revenir à l'incubateur pendant 5 min.
   4. Après 5 min, examiner la plaque avec un microscope composé inversé à un grossissement de 10X pour assurer dissocia cellulaire complètetion de l'antenne. Si certains groupes résiduels sont encore attachés, agiter doucement la plaque pour détacher les touffes. Si les grappes restent attachés, revenir à l'incubateur pour un autre 2-3 min. Ne pas incuber plus de dix minutes ou la mort cellulaire significative peut se produire.
   5. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter 3 ml de solution de trypsine de neutralisation. Mélanger doucement la solution de neutralisation de la solution de trypsine-cellule et transfert vers le tube de centrifugeuse de 50 ml contenant les médias de réagrégation et rincer une fois avec PBS.
   6. Rincer l'ensemble de récipient avec 5 ml de PBS et transférer dans le même tube de 50 ml contenant les cellules.
   7. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
   8. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de NBS médias, puis transfert à un tube de 1,5 ml.
   9. Pellet à 300 xg pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. Les cellules cardiaques (CD90 ⁺ et les cellules stromales SIRPα ⁺ MYOCytes) sont maintenant prêts pour la construction des tissus.
3. (Facultatif) Recueillir les cellules supplémentaires d'intérêt
   Remarque: En plus des tissus définis contenant uniquement SIRPα ⁺ cardiomyocytes et les cellules de type fibroblaste CD90 ^+, il est possible d'ajouter des cellules d'intérêt supplémentaires pour interroger leur effet sur ​​la fonction des tissus. Par exemple il a été démontré MSCs de rat pour améliorer la fonction de rat d' ingénierie des tissus cardiaques ^1. L'étape optionnelle suivante décrit la collecte de cellules supplémentaires pour le système défini.
   1. Recueillir le type de cellule supplémentaire d'intérêt (par exemple, les cellules souches mésenchymateuses) en utilisant 0,25% de trypsine / EDTA 0,1%.
   2. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante, puis remise en suspension dans 5 ml de milieu de culture cellulaire approprié pour le type cellulaire d'intérêt. Par exemple, pour les cellules souches mésenchymateuses, l'utilisation DMEM additionné de 20% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,2% de l'amphotéricine B à la culture du caunes.
   3. Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre, puis sédimenter les cellules à nouveau à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
   4. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de milieu de culture cellulaire et le transfert à un tube de 1,5 ml.
   5. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
   6. Retirer le surnageant. Les cellules supplémentaires sont maintenant prêts pour la construction des tissus.
      Remarque: si les cellules supplémentaires sont ajoutés à une concentration de 10% du nombre total de cellules dans le tissu, puis pour les tissus définis, il faudra 50.000 cellules supplémentaires par le tissu que chaque tissu contient 500.000 cellules cardiaques ( les deux cellules stromales CD90 ⁺ et les myocytes SIRPα ^+).
4. Créer les droits Engineered cardiaques Tissues
   Remarque: Conservez toutes les solutions sur la glace et les cellules à la température ambiante. Tous les volumes indiqués ci-dessous sont par le tissu. En règle générale, environ six tissus peuvent être construits à partir de deux 6 puits plates de différenciations cardiaques.
   1. Diluer 60,0 pi de 5 mg / ml de collagène disponible à 3,125 mg / ml avec 1,5 pi de 1 M NaOH, 9,6 pi de 10x PBS et 24,9 pi d'eau stérile désionisée ultrapure.
      étape critique: Eviter l'introduction de bulles d'air à chaque solution lors de la préparation sous forme de bulles d'air vont perturber la formation de tissu propre.
   2. Ajouter 12,0 ul de fois 10x MEM et 0,2 N HEPES pH 9 au mélange dilué de collagène pour créer le mélange de collagène. Ajouter les deux solutions sur le côté du tube de centrifugeuse de 15 ml afin d'éviter l'introduction de bulles d'air dans le mélange de collagène.
   3. Ajouter la matrice de membrane basale jusqu'à une concentration finale de 0,9 mg / ml au mélange de collagène et de stocker de la glace pour créer le mélange de tissu final. La concentration finale de collagène doit être de 2 mg / ml.
   4. Ajouter 500.000 des cellules refusionnés au mélange de tissu (myocytes + concentration de fibroblaste est de 20 millions / ml) et remplir un volume final de 25 ul partissus soit avec les médias NBS exempts de cellules ou 50.000 cellules du type de cellule supplémentaire d'intérêt (par exemple, CSMh) et bien mélanger pour former une suspension homogène de la cellule.
      Note: Le nombre de cellules supplémentées varie d'une des différentes applications. Ici 10% supplémentation est utilisé.
   5. Avec soin, la pipette 25 ul de la suspension cellulaire dans chacun des six puits dans la plaque de fond du bioréacteur, sans introduire de bulles d'air dans le puits.
   6. Poussez deux rangées de capteurs de force de PDMS sur chaque côté du cadre de polysulfone, formant 6 paires de messages opposés, puis inversez le cadre sur le dessus de la plaque de base de sorte qu'une paire de messages entre chaque puits contenant la suspension cellulaire.
      Remarque: Le cadre de polysulfone comprend des onglets pour faciliter l'alignement des PDMS.
   7. Placez délicatement le bioréacteur, socle vers le bas, dans un plat de 60 mm, puis placez le plat sans son couvercle à l'intérieur d'un plat de 10 cm, placez le couvercle de 10 cm sur le dessus, et déplacer l'ensemble du bioréacteur entier dansau tissu incubateur de culture, deux heures d'attente pour que le tissu gel.
   8. Après 2 heures, retirer le bioréacteur de l'incubateur et ajouter 14 ml de NBS médias à la totalité de l'ensemble, assez pour couvrir la plaque de base. Retour à l'incubateur, et changer la moitié des médias chaque jour.
   9. Quarante-huit heures plus tard, retirez soigneusement la plaque de base en déplaçant doucement chaque côté de l'embase hors du cadre de quelques millimètres à un moment, changer les médias, puis retourner le bioréacteur, les tissus vers le bas, aux médias.
   10. Continuez de changer la moitié des milieux de culture NBS chaque jour.
       Note: les contractions spontanées du tissu peuvent être observés dès 3 jours après la construction des tissus, générant des forces de contraction mesurables dès le jour 5 à 7.

Résultats

Pour obtenir les myocytes cardiaques, une version légèrement modifiée des méthodes de différenciation Boheler et Lian est utilisé ^30,31. Il est impératif que la différenciation commence au cours de la phase logarithmique de la croissance cellulaire, mais aussi que la population de départ est suffisamment confluentes pour obtenir un nombre utilisable de cellules après tri (environ 75% est optimal). Typiquement, pour H7 CSEh, placage à une densité de 140.000 CSEh par puits d'un plat à 6 puits d...

Discussion

La construction de tissus humains définis par génie cardiaque (HECT) peut fournir un modèle plus cohérent et fiable de la fonction cardiaque humaine myocytes. Critique, tous les composants cellulaires et extracellulaires dans le système sont connus et peuvent être manipulées comme désiré, en éliminant ainsi l'influence des facteurs de confusion d'autres types cellulaires inconnus résultant du processus de différenciation. Pour équilibrer la croissance cellulaire rapide et un rendement élevé, il es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors