Tuning une colonne sectorielle écoulement parallèle et Activation de la détection multiplexée

Résumé

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Résumé

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Colonnes Flow Technology actifs

La technologie de flux actif (AFT) colonnes de chromatographie ont été récemment développés pour surmonter l'inefficacité dans les séparations associés aux flux hétérogénéité ^{1-6 et} également pour permettre la détection multiplex. Dans ce détail particulier de la communication, nous le processus opérationnel du parallèle segmentée flux colonne (PSF) avec détection multiplex. Les avantages fonctionnels de la colonne de fibres discontinues de polyesters sont les suivants: (1) le flux à partir de la région centrale radiale du lit de colonne est isolé de la zone périphérique ou de paroi de l'écoulement, (2) le volume de la phase mobile qui doit être générée par une détection source est réduit, et les sources (3) de détection peut être multiplexé à élargir l'information échantillon sans inculquer retards de détection à travers chaque processus de détection, ou ultérieurement nécessitant la division d'un flux d'écoulement post-colonne ^7,8. La fonction clé dans la conception de la colonne de PSF qui permet à l'unvantage de détection multiplexée est la nouvelle sortie assemblage de raccord et fritte. La figure 1 est une photographie de la colonne par rapport à l'AFT une colonne classique. Il est important de comprendre que le processus de division obtenu en utilisant des colonnes de flux segmenté parallèles est pas le même que flux d'écoulement post-colonne fractionnement. Dans un flux d'écoulement post-colonne diviser toute la bande de l'échantillon à partir du bord d'attaque vers les extrémités de la queue est aussi échantillonnés (c.-à-axialement), ainsi, chaque flux de circulation est égale à l'égard de l'efficacité et de la sensibilité; l'amplitude de la sensibilité étant ainsi divisée par les fentes numériques. Dans PSF, toutefois, les échantillons du procédé de fendage de la bande radialement, axialement pas. En tant que tel, les échantillons de l'orifice central de la pointe de bourrage de pointe - la région la plus concentrée du pic. Ainsi, la sensibilité est la plus élevée ici que la pointe ne soit pas dilué par la région de queue diffus. L'échantillon élue à partir des ports périphériques est pas aussi efficace que dans le central zone, mais, étant donné que la bande est échantillonné radialement, et non axialement, la largeur du pic est plus étroite que ce qui serait le cas pour un processus d'échantillonnage que divise le pic dans la direction axiale, à savoir une fraction de post-colonne. Par conséquent la sensibilité d'un détecteur dépendant de la concentration ne soit pas réduit.

Dans la colonne de PSF, le raccord de sortie comporte plusieurs orifices de sortie et à l'intérieur de cet embout, il est logé une fritte annulaire. La partie intérieure de ce annulaires canaux de fritte écoulement hors de la colonne par l'intermédiaire de l'orifice central radial de sortie, tandis que la partie radiale externe des canaux de sortie de fritte écoulement hors de la colonne par l'intermédiaire des orifices d'écoulement de sortie périphérique ou région de paroi. Les parties intérieure et extérieure de la fritte de sortie sont séparés par une barrière imperméable qui empêche l'écoulement transversal entre ces régions d'écoulement ^2. En conséquence de cette conception le courant central de l'écoulement radial à travers le lit de colonne est séparée des compléments d'écoulement de la région de paroiide la colonne. La part relative de l'écoulement de ces deux régions peut être modifiée pour presque tout rapport souhaité par la gestion de la pression afin d'optimiser divers aspects fonctionnels de la technologie de la colonne, comme l'efficacité de la séparation ou de la sensibilité de détection. En substance, cette conception établit efficacement dans la colonne de plus grand format d'une colonne «virtuel», ayant un diamètre interne plus étroit, et donc les fonctions de colonne comme une colonne à paroi-moins vrai, en surmontant lit colonne hétérogénéité et les effets de paroi ^9,10.

Les principaux avantages de colonnes PSF sont des améliorations dans l'efficacité de la colonne, la minimisation du traitement solvant pour la source (s) de détection et permettant la détection multiplex. Cependant, un avantage supplémentaire est que, depuis la queue et les régions bordant d'une bande sont retirés de l'élution profil global du soluté à élution ou la détection est présente dans une concentration supérieure, autrement, serait observée pour les mêmes solute injection de charge et concentration sur une colonne classique, en fonction du rapport de segmentation utilisé. En conséquence, il est souvent observé un gain de l'intensité du signal pour les séparations menées sur des colonnes de PSF ^2. En fait, si le rapport de segmentation est ajustée de telle sorte que 25% de la sortie d'écoulement de chacun des quatre orifices de sortie, l'intensité du signal qui est observé en utilisant Violet (UV) détection Ultra montre pratiquement exactement la même intensité de signal en tant que ressort au moyen d'un conventionnel où l'ensemble de colonne (100%) de la phase mobile est analysée ^7. En outre, un réglage fin du rapport de sortie entre les régions d'écoulement central et la paroi permet efficacité de la colonne à optimiser. Les gains en efficacité de la colonne observées en utilisant des colonnes AFT ne peut pas être déclaré à une seule valeur, étant donné que ces gains d'efficacité sont fonction de trois facteurs: (1) le débit, (2) le rapport de segmentation, et (3) le facteur de rétention de soluté . Néanmoins, des gains d'efficacité par rapport à conventional colonnes sont presque toujours observées, et parfois ces gains sont plus de 100% du nombre de plateaux théoriques ^1,2. La possibilité de régler le rapport de segmentation permet à l'analyste d'adapter efficacement le diamètre de la colonne «virtuel», ce qui est un facteur important en ce qui concerne le processus de détection. Par exemple, une colonne de diamètre (id) 2,1 mm virtuel interne est établie à partir d'une colonne physique id 4,6 mm lorsque le rapport de segmentation est de 21% de phase mobile d'élution à partir de l'orifice radial de sortie central. Dans ces conditions, la colonne virtuelle id 2,1 mm se produit avec un rendement qui peut être supérieur à 70% supérieure à la colonne classique de 2,1 mm id, en fonction du débit, et soluté facteur de rétention ^10.

La conception de la colonne de PSF courant qui est utilisé pour la détection multiplexée comprend un port raccord de sortie 4, mais la colonne peut être munie d'un orifice 2-embout également, cependant, cette limite de détection to deux détecteurs. Le fonctionnement de base de ces colonnes est cependant le même, sauf que les quatre détecteurs peuvent être couplés simultanément à la colonne de sortie PSF 4 ports d'élargir le champ de détection multiplexée. En dehors de colonne tubes conjonctif avant et après, les seules exigences supplémentaires d'opérer une colonne de PSF est un tube qui peut être relié à des orifices de sortie périphériques, et un moyen par lequel la quantité de phase mobile passant à travers chaque tube peut être mesuré, typiquement soit une mesure de masse ou une mesure volumétrique. Pour la facilité de réglage, le diamètre interne de tous les tubes d'écoulement de sortie devrait être la même. Le rapport d'écoulement entre les orifices de sortie centraux périphériques et radiales est ensuite modifiée par l'utilisation de la gestion de la pression, en changeant simplement la longueur de la tubulure situé sur la sortie périphérique montage, ou la longueur du tube de post détecteur sur l'orifice central radial de sortie.

Détection multiplexée Utilisation des colonnes de PSF

Un avantage important de colonnes de PSF est que chacun des orifices de sortie de sortie peut être relié directement à une source de détection, permettant ainsi une détection multiplexée. Dans un système de détection bien conçu d'une seule analyse avec détection multiplexée peut fournir des informations importantes en ce qui concerne la nature des composants dans l'échantillon. Surtout, essais destructifs et non destructifs peuvent être menées à exactement au même moment, sans délai de détection. Ceci permet l'affectation de absolu, par exemple, des anti-oxydants à l'aide de DPPH ^• réactif, avec des composants observés pour éluer avec la spectrométrie de masse (MS) Réponses ^7,11 détection UV et / ou. Par conséquent, quatre détecteurs indépendants peuvent être actionnés simultanément avec des parties appropriées de flux dirigés vers chaque détecteur par l'intermédiaire de l'un des quatre orifices de sortie. Depuis l'écoulement à travers ces ports peut être facilement réglé la quantité de soluté d'atteindre l'un des détecteurs peut être ajustée en fonctionla sensibilité de la source de détecteur donné. Il convient de noter, cependant, que la migration du soluté le plus efficace est observée à travers l'orifice central radial de sortie. Chacun des ports périphériques offrent une efficacité de séparation équivalente, qui lorsqu'il est réglé à 25% dans chaque port, est seulement légèrement moins efficace qu'une colonne classique. En tant que tel, il est important que le détecteur quantitative être réglé pour analyser l'échantillon de l'orifice radial de sortie central.

Lorsque la mise en place d'une colonne de PSF dans le but de la détection de multiplexage, il ya un certain nombre de considérations qui doivent être faits pour obtenir des résultats efficaces et de haute qualité; soit les dimensions de tubes pour chaque port, le port de choix d'un type de détecteur et réglage du débit.

Dimensions du tube pour chaque port

Dans la chromatographie la longueur du tube post-colonne joue un rôle crucial dans l'efficacité et la performance de la séparation. Grand dead volume à la suite de longue ou large tubulure id de sortie de la colonne de détecteur se traduira par une perte d'efficacité, la résolution et la sensibilité. Ainsi, les dimensions de tubes appropriés doivent être utilisés lors de la création de la colonne de PSF pour atteindre le potentiel maximal en fournissant une séparation efficace tout en offrant les avantages de multiplexage.

Port de détecteur

Figure 2 est une illustration d'un exemple de configuration de la détection multiplexée (Ultra Violet-Visible (U-Vis), spectromètre de masse (MS) et de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) détection). L'illustration montre le port central est fixé au détecteur MS, alors que le DPPH ^• et détecteurs UV-Vis sont fixés aux ports périphériques. Étant donné que le détecteur MS est la plus sensible des trois, ce détecteur de flux a été dirigé à partir de l'orifice de sortie central. Comme DPPH ^• détection est sélective à l'presence d'antioxydants, et la moins sensible et le plus tolérant à l'élargissement de bande, le débit de ce détecteur a été dirigé à partir d'un port périphérique. L'UV-Vis était un détecteur secondaire «générique», afin d'écouler ce détecteur a été réalisé à partir d'un deuxième port périphérique.

Réglage du débit

Une fois que le tube a été fixé appropriée à partir d'un orifice de détecteur, le flux sortant de chacun des détecteurs peut être ajustée à la quantité nécessaire. Un moyen simple de mesurer la quantité de flux sortant de chaque détecteur est de peser la quantité de phase mobile qui est éluée à travers chaque port sur une période de temps donnée. Le flux de pourcentage peut donc être déterminée, et les rapports d'écoulement peut être réglé par l'allongement ou le raccourcissement ou l'autre du tube attaché à la ligne de sortie sur les détecteurs en conséquence en fonction des besoins des détecteurs de choix. Différents détecteurs ont des exigences différentes de l'écoulement, par exemple, la cellule d'écoulement deun détecteur de fluorescence (FLD) n'a pas le débit limité, mais des précautions doivent être prises pour éviter une surpression de la cellule d'écoulement. Ainsi la commande de l'écoulement à travers la FLD est habituellement atteint en ajustant la chute de pression dans les autres détecteurs et le reste de l'écoulement puis traverse la FLD. Un détecteur qui est sensible à la quantité de flux qui est fourni est la MS. Généralement, les spectromètres de masse actuels haut de gamme peuvent facilement traiter environ 1 à 1,5 ml / min de la phase mobile aqueuse modérément. Au-dessus de ce débit, les inondations de la source peut faire les MS inutilisable. Cependant, la sensibilité de détection dans la plupart des spectromètres de masse est bénéficié en utilisant des débits plus faibles; donc les capacités de fractionnement de flux de PSF sont extrêmement utiles pour des applications impliquant la détection MS. Haute colonne débits volumétriques peuvent être utilisés, mais avec des charges de faible volume transporté au détecteur MS. Réglage de l'écoulement vers le détecteur MS, cependant, doit être effectué en ajustant la chute de pression avant laMS détecteur, plutôt que de soumettre MS. Ici, l'utilisation de tubes de forage étroite (0,1 mm id) est très utile, car la pression peut être facilement ajustée sans ajouter volume mort inapproprié.

Selon le type de détecteur le réglage du rapport de segmentation peut être effectuée détecteur soit avant ou après. Si un détecteur non-destructive, tels que UV-Vis est utilisé, le pourcentage de débit serait mesurée et réglée après détecteur. Si un détecteur destructrice unique est utilisé dans le multiplex mis en place le pourcentage de débit est déterminé par le calcul de retour par rapport à d'autres pourcentages de flux de port. Si un détecteur à base de réactif est utilisé comme DPPH ^•, le pourcentage d'écoulement est mesurée d'après le détecteur sans addition de réactif; et si deux ou plus destructrices détecteurs sont utilisés, alors le rapport d'écoulement est mesurée pré-détecteur. Systèmes qui peuvent nécessiter des instruments supplémentaires, tels DPPH ^{• Détection,} aura la pression du système supplémentaire qui peut modifier le débitpourcentage une fois connecté au système de détection. Par conséquent, une attention particulière devrait être accordée à la pression du système d'un détecteur destructrice, lors du réglage de pourcentage de débit pré-détecteur. Quel que soit le rapport de débit qui est définie par l'un des ports, des informations quantitatives devrait être obtenue grâce à la normalisation appropriée. Une fois que les taux d'écoulement sont fixés, cependant, ils sont robustes, et ils ne changent pas, même dans des conditions d'élution en gradient ^{à 7,}

Le protocole de vidéo détaillée accompagnant ce manuscrit est destiné à montrer comment utiliser et régler un fonctionnement de la colonne de PSF dans un mode multiplexé de détection.

Protocole

Remarque: Ce protocole contient des instructions sur la façon d'utiliser une colonne de PSF sur un système HPLC couplée avec plusieurs détecteurs pour la détection multiplex. Le protocole a été écrit en supposant que le lecteur a les connaissances de base et de l'expérience en chromatographie et diverses méthodes de détection HPLC.

Attention: S'il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et les réactifs avant utilisation (par exemple, la fiche signalétique pour le méthanol). Assurer l'utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Assurer l'utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et instrumentation du détecteur, et de veiller à l'utilisation d'équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées).

1. Mise en place d'instruments HPLC

1. Préparer l'instrument HPLC avec de l'eau ultra-pure (par exemple, 100% d'eau Milli-Q) de line A et 100% de méthanol pour la ligne B comme phase mobile et purger les pompes selon l'exigence du fabricant. Si l'un des détecteurs utilisés MS est, comme ici, ajouter de l'acide formique à 0,1% pour les deux phases mobiles A et B.
2. Mettre en place la HPLC composants et capteurs instrumentaux comme illustré sur la figure 2. Ceci nécessite le placement commode de détecteurs par rapport à la colonne de façon à minimiser le volume mort entre le détecteur et la colonne. La flexibilité dans la configuration du système HPLC est souhaitable.

2. Mise en place d'UV-Vis et Détecteurs MS

1. Régler le détecteur UV-Vis à la longueur d'onde souhaitée dépendante de l'échantillon d'intérêt (par exemple, 280 nm).
2. Réglez le détecteur MS en mode positif pour le comte total Ion (TIC) analyse en utilisant la méthode de détection Full Scan. Réglez également les paramètres MS suivants en conséquence: température du vaporisateur 500 ° C, la température capillaire 350 ° C, la gaine de gaz fixé à un taux de 60 unités, les flux de gaz auxiliaire40 et balayer flux de gaz à 5 unités, et la tension de pulvérisation de 3,5 kV. Ces paramètres peuvent être ajustés plus tard pour besoins spécifiques des utilisateurs qui dépendent de l'échantillon analysé.

3. Préparation de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH ^•) Réactif installation de DPPH ^• Détecteur de système

1. Peser 25 mg de DPPH ^• et dissoudre dans 250 ml de methanol dans un ballon volumétrique.
2. Ajouter 250 ul d'acide formique à la DPPH ^• réactif. Couvrir le flacon dans une feuille pour éviter l'exposition à la lumière.
3. Soniquer le ballon contenant le DPPH ^• réactif pendant 10 min.
4. Purger le DPPH ^• pompe avec le prêt DPPH ^• réactif selon l'exigence du fabricant.
5. Mettre en place le DPPH ^• Système selon la Figure 2 par la ligne de fixation de la pompe à l'entrée d'une pièce en T.
6. Fixez une bobine de réaction de 100 ul THe sortie de la pièce en T et fixer l'autre extrémité de la bobine de réaction du détecteur.
7. Encase la bobine de réaction dans un four à colonne et régler la température de la colonne de chauffage à 60 ° C.
8. Réglez le DPPH ^• détecteur UV-Vis à 520 nm.

4. Mise en place de PSF Colonne

1. Relier l'entrée de la colonne de PSF de l'instrument CLHP.
2. Connectez le port au centre du détecteur MS, en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm tube ID.
3. Connecter un port périphérique au détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm tubes id.
4. Connecter un autre port périphérique à la pièce en T du système de détection DPPH ^• en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm tubes id.
5. Bloquer le port périphérique utilisé à l'aide d'un bouchon de colonne.
6. Ramener le taux de la pompe HPLC de flux à 1 ml min ^{-1 à} 100% de la ligne B - 100% de méthanol (acide formique à 0,1%).
7. Équilibrer la colonne avec le methanol mobiles ph 100%ase pendant 20 min pour une colonne de 250 x mm de longueur 4,6 mm id. Ce temps est mis à l'échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.

5. Réglage de la colonne de PSF pour la détection multiplexée

1. Mesure de la masse d'au moins deux récipients de collecte vides (une pour le port connecté au détecteur UV-Vis et une pour le DPPH ^{• Détecteur)} en utilisant une balance analytique.
2. Recueillir la phase mobile de l'UV-Vis et les DPPH ^• ports en deux, les navires de collecte pré-pesée distincts (5.1). Enregistrez la période de temps pour la collecte. Recueillir au moins 500 mg de solvant dans chaque récipient.
3. Peser les récipients de collecte et de déterminer la masse de la phase mobile. Compte tenu de la densité de 0,791 g de methanol est ml ^-1, déterminer le volume de la phase mobile ont été recueillies à partir de chaque port.
4. Par différence, qui est, débit d'ensemble de la pompe nominal moins le taux d'écoulement à travers le DPPH ^• et UV-Vis detectoorifices d'écoulement r, déterminent le taux au détecteur MS de flux. Exprimer chaque partie d'écoulement en tant que pourcentage du débit total.
   Remarque: Dans l'idéal, les pourcentages de flux sont les suivantes: à la MS est de 18% du débit total, à l'UV-Vis 22%, au DPPH ^• détecteur 60%.
5. Si non, ajuster les pourcentages d'écoulement en modifiant la pression de retour sur le détecteur UV-Vis. Par exemple, si l'écoulement à l'UV-Vis est trop élevée, diminuer la proportion en ajoutant ajouter une section de 15 cm de 0,13 mm id tube à la sortie du détecteur UV-Vis. Puis répétez les étapes 5.1 à 5.5.

6. Conditions de configuration finale

1. Fixer le taux de la DPPH ^• pompe de réactif à la même débit sortant de l'orifice de sortie relié à la DPPH ^• détecteur de débit.
   Remarque: La colonne de PSF multiplexé avec UV-Vis, DPPH ^• MS et est maintenant prêt pour l'analyse.

Résultats

Une analyse par HPLC en multiplex est effectuée en utilisant une colonne AFT en mode PSF (figure 1) et mis en place comme illustré sur la figure 2. Ce type de configuration laisse un échantillon de café à analyser simultanément à l'aide d'UV-Vis, DPPH ^• et MS dans Total Ion comte de mode (TIC). Les composés de l'échantillon de café qui ont répondu au DPPH ^• pourraient alors être facilement adaptés à la hauteur des UV-V...

Discussion

Cette étude implique la caractérisation et le profilage de café en utilisant HPLC avec détection multiplex employant une colonne parallèle courant segmenté (PSF). Multiplexé HPLC en utilisant des colonnes de PSF permet la caractérisation et l'identification des entités chimiques clés en réduisant la complexité des données de l'échantillon tout en obtenant un degré plus élevé de l'information spécifique à molécule en une fraction du temps nécessaire en utilisant des procédés multi-déte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels