Une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées Fat

Résumé

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Résumé

L'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire sont très prometteurs cliniquement. À cet égard, des cellules pluripotentes, telles que des cellules souches mésenchymateuses (MSC) peuvent être utilisés en thérapeutique, dans un avenir proche, pour restaurer la fonction des organes endommagés. Néanmoins, plusieurs questions techniques, y compris la procédure très envahissante d'isoler MSCs et l'inefficacité entourant leur amplification, entravent actuellement l'utilisation clinique potentielle de ces modalités thérapeutiques. Ici, nous introduisons une méthode très efficace pour la production de cellules graisseuses dédifférenciées (DFAT), les cellules MSC-like. Fait intéressant, les cellules peuvent être différenciées DFAT en plusieurs types cellulaires incluant adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Bien que d'autres groupes ont déjà présenté différentes méthodes pour générer des cellules DFAT du tissu adipeux mature, notre méthode nous permet de produire des cellules DFAT plus efficacement. À cet égard, nous démontrons que le milieu de culture DFAT (DCM), supplémenté avec 20% de FBS,est plus efficace pour générer des cellules DFAT que DMEM, supplémenté avec 20% de FBS. En outre, les cellules DFAT produites par notre procédé de culture cellulaire peuvent être redifférenciés dans plusieurs types de tissus. En tant que tel, un modèle très intéressant et utile pour l'étude de la dédifférenciation du tissu est présenté.

Introduction

La thérapie cellulaire et l' ingénierie tissulaire sont des sujets brûlants dans le domaine de la médecine régénérative ^1-5. Bien que ces modalités thérapeutiques très prometteuses, plusieurs problèmes techniques entravent actuellement leur utilisation clinique. À cet égard, comme dans la génération de cellules iPS, toutes les thérapies d'ingénierie tissulaire doivent produire des cellules libres de transduction de gènes externes afin de maintenir la sécurité des patients. En conséquence, nous avons été le premier groupe à produire avec succès des cellules DFAT humaines ^6. Plusieurs autres groupes de recherche ont depuis adopté notre méthode pour générer des cellules DFAT d'origine mammifère ^7-9, soulignant en outre l'utilité de notre modèle.

Au cours de plusieurs études, nous avons constaté que la qualité du milieu de culture cellulaire peut être modifiée en ajustant la teneur du milieu cellulaire. Cette constatation a conduit à une augmentation du taux de production de cellules DFAT de réussite et une meilleure qualité de cellule; les deux facteurs critiquesgénérer efficacement des cellules pour les futurs essais cliniques. À cet égard, un meilleur milieu de culture DFAT (DCM, un support similaire à souches mésenchymateuses milieu cellulaire, qui contient de l'insuline humaine recombinante, l'albumine sérique, l'acide L-glutamique, de plusieurs acides gras et de cholestérol) et un procédé pour DFAT génération de cellules et prolifération a été développé (plus d'informations sur le contenu du DCM est disponible sur demande). En utilisant cette méthode cellules DFAT de haute qualité ont été obtenues avec la capacité de se différencier en différents types de cellules, y compris adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Au total, ce protocole de culture cellulaire validé améliore la qualité des cellules DFAT et peut être très utile pour améliorer les applications cliniques de la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire.

Protocole

Des échantillons de graisse sous-cutanée humaine ont été obtenus chez des patients subissant une intervention chirurgicale dans les départements de chirurgie plastique, urologie, chirurgie pédiatrique et chirurgie orthopédique de Nihon University Hospital Itabashi (Tokyo, Japon). Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit, et le Comité d'éthique de la Faculté de médecine de l'Université Nihon a approuvé l'étude.

1. Préparation des tissus

1. Amener l'échantillon de tissu à partir de la salle d'opération au laboratoire.
2. Laver 1-2 g de tissu adipeux avec 5 ml de PBS (-) à la température ambiante (RT) une fois, dans un tube de 50 ml, puis placer l'échantillon dans un plat en plastique de 10 cm.

2. digestion à la collagénase

1. Retirer l'échantillon du PBS (-), puis ajouter 10 ml de solution stérile à 0,1% (p / v) de solution de collagénase (collagénase de type II), le récipient contenant l'échantillon de tissu.
2. Émincer le tissu avec des ciseaux chirurgicaux pendant environ 15 min, jusqu'à ce qu'elle atteigne une purée se composentence.
3. Par la suite, la digestion du tissu haché dans 0,1% (p / v) d'une solution de collagénase à 37 ° C pendant 30 min (60 min) dans un tube de 50 ml, en agitant doucement sur un agitateur.
4. Filtrer l'échantillon digéré à travers un filtre de 100 um dans un tube de 50 ml. Ensuite, passer 10 ml de DCM (voir le tableau des matériaux) additionné de 2% de FBS à travers le filtre.

3. Cellule d'isolement

1. Centrifuger les cellules filtrées à 100 xg pendant 1 min à température ambiante.
2. A ce stade, la préparation 5 ml de DCM, supplémenté avec 2% de FBS dans un tube de 50 ml.
3. Ensuite, dessinez les cellules graisseuses flottantes en utilisant une pipette de 1000 et ajouter les cellules à un milieu contenant 50 ml de tube.
4. Par la suite, secouer le tube de 50 ml doucement pour mélanger le milieu DCM avec les cellules.
5. Ensuite, centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante.
6. Jeter le milieu au fond du tube en utilisant une aiguille de 18 G et une seringue de 20 ml.
7. Ensuite, ajouter 10 ml de DCM supplemented FBS à 2% aux cellules recueillies.
8. Mélanger le DCM avec les cellules en agitant doucement le tube de 50 ml.
9. Centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante.

4. Cellules Placage

1. Ajouter 41 ml de DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS à 12,5 cm flacon.
2. Ensuite, en utilisant une pipette de 200 pi ajouter 40 ul de cellules adipeuses dans le ballon.
3. Ensuite, remplir le flacon avec du DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS. ÉTAPE CRITIQUE: À ce stade, faire en sorte que les cellules sont réparties dans tout le milieu. Contrôler visuellement les cellules détachées et ensuite garder le ballon sur le couvercle d'une boîte de Pétri ronde pour le maintenir à plat.
4. Enfin, placer le ballon à l' intérieur de l'incubateur et à laisser non perturbée dans un incubateur à _CO2 à 5% à 37 ° C pendant 7 jours.
5. Après une semaine d'incubation, inverser le flacon et vérifier les cellules DFAT. Ensuite, évaluer DFAT génération cellulaire compétences comme décrit ¹⁰ depuis à ce stade fibroblcellules ast-like (cellules DFAT) sont situés dans des régions distinctes de cellules graisseuses.
6. Ajouter 5 ml de DCM ou du DMEM supplémenté avec 20% de FBS dans le ballon après l'enlèvement du milieu de culture de la cellule précédente. Laisser les cellules DFAT à croître pendant une semaine après avoir changé le milieu.
7. L'utilisation d'un compteur de cellules, compter le nombre de cellules DFAT générées dans différentes conditions de culture cellulaire (DCM vs. DMEM).

Résultats

Dans cette étude, la méthode et d' outils pour DFAT génération de cellules a été améliorée (Figure 1). Notre méthode nous permet de générer des cellules DFAT utilisant à la fois du DCM et du milieu DMEM contenant 20% de FBS (figure 2A). En tant que tel, nous avons comparé l'efficacité de DCM et DMEM dans la génération de cellules DFAT. À cet égard, le DCM amélioré DFAT la prolifération cellulaire par trois fois par rapp...

Discussion

Adipocytes matures qui subissent en dédifférenciation in vitro, un processus connu sous le nom de la culture de plafond, peuvent revenir à un phénotype plus primitif et d' acquérir des capacités prolifératives. Ces cellules sont appelées graisse comme dédifférenciées (DFAT) cellules. Le potentiel de différenciation multilignée DFAT des cellules a été évaluée. Analyse par cytométrie en flux et l' analyse de l' expression du gène a révélé que les cellules DFAT étaient t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G needle	NIPRO	02-002
20 ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550