Préparation des cellules CD4<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T pour l&#39;analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie

Résumé

Nous décrivons un protocole anticorps coloration standard pour une utilisation en microscopie pour déterminer l'expression de la membrane et la localisation des gangliosides dans repos et les cellules T CD4 ⁺ activés humains naïfs. On décrit également des expériences de PCR en temps réel en utilisant <40.000 cellules qui ne nécessitent pas de kits supplémentaires d'ARN d'entrée faible.

Résumé

Les procédés décrits ici pour l' activation de cellules T CD4 ⁺ naïves en suspension et leur adhérence à lamelles pour une analyse par microscopie confocale permettent la localisation spatiale et la visualisation des gangliosides impliqués dans l' activation des lymphocytes T CD4 ⁺ que l' expression du complément de profilage des expériences telles que la cytométrie de flux, occidental buvard ou PCR en temps réel. La quantification de l'expression des gangliosides par cytométrie de flux et de leur localisation cellulaire par microscopie peut être obtenue par l'utilisation d'anticorps anti-ganglioside avec une haute affinité et spécificité. Néanmoins, un traitement adéquat des cellules en suspension implique le traitement des plaques de culture pour promouvoir l'adhérence nécessaire requis pour la fluorescence ou l'acquisition de la microscopie confocale. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour déterminer GD3 et GD2 expression de ganglioside et colocalisation avec le TCR lors de l' activation naïve de lymphocytes T CD4 ^+. Aussi, real-texpériences ime PCR en utilisant <40.000 cellules sont décrites pour la détermination de la GD3 et des gènes de synthase GM2 / GD2, ce qui démontre que les expériences d'analyse de gène peut être réalisé avec un faible nombre de cellules, et sans qu'il soit nécessaire de kits supplémentaires d'ARN d'entrée bas.

Introduction

Les cellules T CD4 ⁺ orchestrer la réponse immunitaire par l' intermédiaire de leurs fonctions effectrices après activation par les cellules présentant l' antigène ^1. L'étude des mécanismes cellulaires qui sont modulés lors de l'activation permet un aperçu d'un processus de base de la fonction immunitaire. Cependant, l'étude des cellules T CD4 ⁺ naïfs peut être compliqué , car ils représentent une très petite population de cellules dans la périphérie de sang ^2.

Grâce à la microscopie par fluorescence à plusieurs rapports ont étudié la localisation de différentes molécules impliquées dans l' activation des lymphocytes T CD4 ^+, principalement des protéines associées à la membrane plasmique ^3. Les gangliosides sont des glycosphingolipides contenant de l' acide sialique , et même si elles ont été largement étudiées dans les cellules nerveuses où ils sont abondants, d' autres cellules telles que les cellules immunitaires expriment également des gangliosides avec des fonctions pertinentes biologiquement ^4,5. Nous avons précédemment rapporté that lors de l' activation des cellules naïves humaines T CD4 ⁺ il y a une régulation positive de l'α2,8 sialyltransférase ST8Sia 1 (GD3 synthase) et la synthase GM2 / GD2, qui induisent la neoexpression de surface importante de GD2 et la régulation positive de ganglioside GD3 ^6. Une étude plus poussée de GD3, GD2 et d'autres gangliosides dans les cellules immunitaires est nécessaire pour compléter une vue partielle de la fonction immunitaire à base de protéines.

Généralement, l'étude de l' expression des gangliosides est basée sur des techniques telles que la Chromatographie sur couche mince (CCM) ^7, mais cette technique ne permet pas la localisation spatiale de gangliosides à la membrane plasmique ou dans des compartiments sub - cellulaires, en limitant l' analyse biologique.

Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour l'identification d'anticorps médiée et la localisation de GD3 et GD2 gangliosides dans les cellules CD4 ⁺ T naïfs humains et CMSP après anti-CD3 / activation anti-CD28. Avec ce protocole, il is également possible d'analyser l'expression génique et moléculaire de gangliosides dans un faible nombre de cellules en suspension, avec l' acquisition d'images de haute qualité ^6, compte tenu de la petite taille des lymphocytes (9 pm).

Protocole

Le sang périphérique provenant de donneurs sains de sexe masculin a été obtenu avec le consentement éclairé et à l'approbation du Comité de bioéthique du Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Isolement et activation de Human Naïf cellules T CD4 ⁺

1. Recueillir 2 ml de sang périphérique provenant de donneurs humains sains grâce à un consentement éclairé et diluer avec 2 ml de solution stérile PBS-EDTA (1x tampon phosphate salin (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Ajouter le sang dilué lentement au - dessus de 3 ml d' une solution de saccharose avec une densité de 1,077 ⁸ comme décrit précédemment.
   Remarque: La migration différentielle pendant la centrifugation provoquée par les différences de densité provoque érythrocytes dans les sédiments complètement et une couche de cellules mononucléaires moins denses se former au-dessus. 2 ml de sang périphérique rendra environ 0,5 x 10 ⁶ cellules T CD4 ⁺ naïfs après la Purificatisur les marches.
2. Centrifugeuse 30 min à 250 g à 21 ° C (utilisation rotor pour tubes à fond rond avec angle fixe de 30 mm) sans interruption pour générer le gradient de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Après centrifugation, le PBMC peut être clairement observé comme un anneau blanc. Recueillir les PBMC avec une pipette et transférer à tube stérile pour le lavage.
3. Après trois lavages avec une solution de PBS-EDTA à 250 g pendant 10 min procéder à la purification des cellules T CD4 ⁺ naïves. méthodes de tri ou plusieurs types de kits de purification sont disponibles à cet effet. De préférence, utilisez> 1 x 10 ⁷ PBMC pour la purification.
   1. Purifier cellules CD4 ⁺ T naïfs par sélection négative avec des billes magnétiques. Effectuer une sélection négative avec des anticorps anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRy / δ, anti-HLA-DR, et CD235a (glycophorine A). Évaluer le pourcentage de pureté en déterminant des cellules CD4 + CD45RA + à ffaible cytométrie.
      Note: Le cas échéant, procéder à l' incubation des PBMC pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ avec une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans 10 ml de milieu supplémenté pour favoriser l' adhérence des monocytes et poursuivre la purification naïve de lymphocytes T CD4 ^+. La récupération efficace des cellules T CD4 ⁺ naïves provenant du sang périphérique dépend en grande partie du système de purification.
4. Préparer des plaques à 24 puits de culture cellulaire par l'addition de 250 ul par puits de PBS contenant 5 pg / anticorps monoclonal anti- CD3 ml et incuber pendant au moins 2 heures à 37 ° C.
   Remarque: Les plaques à 96 puits peuvent être utilisés quand un petit nombre de cellules CD4 ⁺ T naïfs sont utilisés (par exemple, 2 x10 ⁴ -1 x 10 ^5).
5. Retirer anti CD3 dilution du 24 puits ou 96 puits et laver les plaques à deux reprises à l'aide stérile 1x PBS.
6. Diluer les cellules T CD4 ⁺ naïfs> 95% de pureté (CD4 +CD45RA +) à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans avancé du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 3% de sérum fœtal bovin (ou RPMI supplémenté avec 10% de sérum), 2 mM de glutamine et des antibiotiques (1 U / ml de pénicilline, 1 ug / ml de streptomycine).
   Remarque: Si ganglioside localisation est nécessaire dans les CMSP, suivre le même protocole pour la dilution et de stimulation tel que décrit ci-dessous.
7. Ajouter 500 ul de la dilution cellulaire à des puits enduits anti-CD3 et aux puits non revêtus (cellules de contrôle) dans la plaque de 24 puits. En variante, ajouter 100 ul de la dilution des cellules dans les puits de la plaque à 96 puits.
8. Remplir les conditions de stimulation des cellules T CD4 ⁺ naïfs dans les puits revêtus anti - CD3 en ajoutant 1 pg / ml d'anticorps anti-CD28.
9. Gardez les repos cellules T CD4 ⁺ que le contrôle dans les puits non revêtus , sans addition d'anticorps anti-CD28. Incuber le repos et de cellules T CD4 ⁺ activées pour 0 à 72 heures dans des conditions standard de 37 °C et 5% de CO _2.
10. Pour vérifier une activation adéquate évaluer par cytométrie en flux de l'expression du CD69 marqueur d'activation précoce (16 heures après l'activation) ou CD25 marqueur tardif d'activation (48 heures après l'activation) en repos et activé les cellules CD4 ⁺ T naïves incubées à 37 ° C et 5% de CO ₂ en l' absence ou en présence d'anti - CD3 / CD28 anticorps ^9,10.

2. Le respect de repos et de cellules activées Naïf T CD4 ⁺

1. Stériliser 12 mm rondes lamelles par autoclavage et exposition à la lumière UV pendant au moins 15 min.
2. Placer les lamelles dans des plaques à 24 puits de culture de cellules stériles.
   Remarque: Pour les cultures avec moins de 1 x 10 ⁵ cellules , il est préférable d'utiliser des chambres de glissement avec petits godets adaptés pour empêcher la dispersion des cellules dans la lamelle.
3. Manteau des lamelles (ou chambre de coulissement) avec 200 ul de poly-L-lysine (poids moléculaire de 150 à 300 kDa) 0,1% (p / v) et incuber pendant 5 minutes à rtempérature oom (RT), enlever et sécher pendant au moins 1 heure à température ambiante.
4. Mélanger soigneusement et recueillir le repos et les cellules T CD4 ⁺ naïfs activés à partir des plaques à 24 puits. Compter les cellules et ajuster , si nécessaire avec un milieu supplémenté frais pour transférer 1 x 10 ⁵ cellules aux lamelles revêtues de poly-L-lysine. Incuber les cellules pendant au moins 6 heures à 37 ^° C et 5% de CO _2.

3. Collecte et fixation du repos et Activé Naïf cellules T CD4 ⁺

1. Retirez délicatement le moyen de repos et de culture des cellules CD4 ⁺ T naïfs activés.
2. Ajouter 500 ul de PBS stérile RT lentement.
   Remarque: addition soigneuse et le retrait de solutions de puits empêche le détachement des cellules de la lamelle.
3. Jeter le PBS et ajouter un autre 500 ul de PBS pour éliminer complètement les milieux de culture.
4. Fixer les cellules par addition de 500 ul filtré paraformaldéhyde 4% (filtration supprime des microparticules qui peuvent interférer avec l'analyse de la microscopie) et incuber pendant 30 min à température ambiante (de préférence) ou une nuit à 4 ° C.
   Attention: paraformaldéhyde est un composé toxique et volatile. Il est connu pour être cancérigène pour l'homme. Utilisez soigneusement avec un protocole de sécurité approprié.
5. Retirer le fixateur et laver au moins deux fois avec du PBS à la température ambiante.
6. Procéder à l'étape suivante ou maintenir les puits de la plaque avec 500 ul de PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours jusqu'à ce que la coloration.
   Remarque: Stérilité pendant ce processus permet d'éviter la croissance des micro-organismes.

4. Coloration, Montage et visualisation par microscopie confocale

1. Retirez le PBS des puits. Ajouter 500 pi de tampon de blocage à froid (1 x PBS, 0,5% de qualité standard d'albumine de sérum bovin, 1% de sérum de fœtus bovin à pH 7,4). Incuber pendant 20 min sur la glace.
2. Retirez le tampon de blocage avec précaution et ajouter les anticorps primaires (anti-gangliosides GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),anti- CD25 conjugué à PE et APC conjugué anti- TCR et isotypes témoins dilués dans un tampon de blocage à 2,5 pg / ml.
3. Incuber 2 h sur la glace ou une nuit à 4 ° C.
   Remarque: l'agitation orbitale lente est préférable.
4. Retirer l'anticorps avec précaution et ajouter lentement 500 pi de PBS. Répéter deux fois.
5. Ajouter des anticorps secondaires (FITC anti IgG3 anti- conjuguée à R24 GD3, Alexa Fluor 488 IgG2a anti- conjugué Alexa Fluor 647 ou conjugué pour 14G2a contre GD2) dilué dans du tampon de blocage à 0,1 pg / ml.
6. Incuber pendant 1 heure sur la glace dans l'obscurité sans agitation.
7. Laver trois fois dans du PBS comme décrit dans la section 4.4). Gardez les puits avec suffisamment de PBS pour éviter la déshydratation des échantillons.
8. Ajouter Hoechst 333258 colorant dilué dans du PBS à 0,1 pg / ml.
9. Incuber 15 min à température ambiante et à enlever. Laver trois fois dans du PBS.
10. Placer les lames sur une serviette en papier et ajouter 20 ul de solution de fixation (50% de glycerol dans du PBS) ou de la solution de montage commerciales pour éviter la décoloration et la trempe à partir d'échantillons.
11. Prenez soigneusement la lamelle avec des pincettes fines et placez-le sur la solution de montage. Faire en sorte que le côté de la lamelle couvre-objet, où les cellules sont fixées en contact avec la solution. Sceller les lamelles avec le vernis à ongles et d'analyser en utilisant la fluorescence ou microscopie confocale.

5. Isolement d'ARN

1. Préparer un anticorps anti CD3 (5 ug / ml) revêtu de plaques à 96 puits. Incuber 4 x 10 ⁴ naïves cellules T CD4 ⁺ / puits dans 100 ul de milieu de culture supplémenté avec un anticorps anti- CD28 (1 pg / ml) pour compléter le stimulus. Incuber à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 0-72 h.
2. Après différents temps post-activation placer les cellules dans un tube de microcentrifugeuse.
3. Ajouter 500 pi de PBS et centrifuger à 250 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Retirer le surnageant et ajouter 1ml réactif Trizol.
5. Incuber pendant 5 min à température ambiante et de garder l'échantillon à -8076; C pendant au moins 24 heures. Procéder à l'isolement de l'ARN en cas de besoin.
   Remarque: En quittant l'échantillon à -80 ° C pendant au moins 24 h améliore le rendement de l'ARN. En outre, l'utilisation de gants en main est essentielle pour éviter la dégradation de l'ARN par RNases.
6. Décongeler l'échantillon par incubation à 37 ° C pendant 2 minutes dans un bain d'eau.
7. Ajouter 200 ul de chloroforme et agiter vigoureusement à la main pendant 30 secondes (pour éviter le mélange agressif de l'ARN par vortex). Incuber 5 minutes à température ambiante.
8. Centrifugeuse 15 min à 12000 xg à 4 ° C.
9. Récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
10. Ajouter 500 ul d'isopropanol et inverser le tube trois fois.
11. Incuber 10 min à température ambiante et centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C.
12. Jeter le surnageant par inversion.
13. Ajouter 1 ml de glace froide éthanol à 75% et centrifuger 10 min à 12000 xg à 4 ° C.
14. Complètement jeter le surnageant et sécher le culot d'ARN en laissant le bouchon du tube ouvert.
    ne pase: A ce stade, le culot est pas clairement visible. Continuer malgré tout.
15. Reprendre le culot dans 20 pi d'eau moléculaire de qualité. Calculer la concentration et la pureté des acides nucléiques en mesurant 260 nm et 280 nm, l'absorbance à l'aide NanoDrop.
16. Procédez avec précaution à la synthèse de l'ADNc en utilisant tout kit classique de la transcriptase inverse et en suivant le protocole Référence rechange.
    Remarque: Environ 0,5-2 pg d' ARN est obtenue à partir de 4 x 10 ⁴ cellules T CD4 ⁺ naïfs. ADNc peut être synthétisé à partir de 100 ng d'ARN et utilisé dans des réactions de PCR en temps réel, sans qu'il soit nécessaire pour les kits d'entrée faible d'ARN.

Résultats

Le protocole décrit dans ce manuscrit rend une bonne qualité de culture et de repos adhéré et les cellules T CD4 ⁺ activés humains naïfs (figure 1). Les cellules T CD4 ⁺ activés présentent le profil proliférative caractéristique (figure 1B) par rapport à l'état de repos (figure 1A). Le marqueur de fin d'activation CD25 est utile pour évaluer l'activation efficace à 72 h observé par microsc...

Discussion

Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les gangliosides ou de protéines dans des suspensions cellulaires de lymphocytes T CD4 ⁺ ou d' autres cellules du système immunitaire (par exemple, PBMC, figure 5) à partir d'un petit nombre de cellules. En raison de la petite taille des cellules T et les propriétés non-adhérentes, l'acquisition de fluorescence images microscopiques résultats dans une mauvaise information ou de faible qualité si les cellules ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7