Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Résumé

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Résumé

Le cancer du sein est la principale cause de mortalité liée au cancer chez les femmes dans le monde entier. Métastases hépatiques est impliqué dans plus de 30% des cas avec des métastases du cancer du sein, et les résultats de mauvais résultats avec des taux de survie médiane de seulement 4,8 à 15 mois. des modèles de rongeurs actuels des métastases du cancer du sein, y compris primaire xénogreffe de cellules tumorales et des modèles de tumeurs spontanées, rarement des métastases au foie. Intracardiaque et des modèles d'injection intraspléniques ne se traduisent par des métastases hépatiques, cependant, ces modèles peuvent être faussées par le site secondaire concomitante des métastases, ou par une immunité compromise en raison de l'enlèvement de la rate afin d'éviter la croissance de la tumeur au niveau du site d'injection. Pour répondre à la nécessité d'améliorer les modèles de métastases du foie, un procédé d'injection de la veine murine qui délivre des cellules tumorales d'une part, et directement vers le foie a été développé. Ce modèle fournit les cellules tumorales au foie sans complications de métastases simultanées dans d'autres organes ou ablation de la rate. L'optle protocole de la veine porte imized utilise de petits volumes d'injection de 5 à 10 ul, ≥ 32 aiguilles de calibre et hémostatique gaze au niveau du site d'injection pour contrôler la perte de sang. La veine approche d'injection de portail dans Balb / c femelles en utilisant trois lignées tumorales mammaires syngéniques de faire varier le potentiel métastatique a été testé; des cellules hautement métastatique des cellules 4T1, D2A1 modérée métastatiques et les cellules D2.OR faible métastatique. Les concentrations de ≤ résultats 10.000 cellules / injection dans une latence de ~ 20 - 40 jours pour le développement des métastases hépatiques avec les plus élevés métastatique 4T1 et D2A1 lignes, et> 55 jours pour la ligne de D2.OR moins agressif. Ce modèle représente un outil important pour étudier la poitrine métastases du cancer du foie, et peut être applicable à d'autres cancers qui métastasent fréquemment au foie, y compris colorectal et adénocarcinomes pancréatiques.

Introduction

Breast Cancer Métastases du foie

Le foie est un site ordinaire de métastase du cancer du sein, ainsi que des os et des poumons ^1-3. Métastases hépatiques chez les patients atteints de cancer du sein est un facteur pronostique indépendant des résultats très pauvres ^4,5, comme la médiane de survie des patients atteints de cancer du sein avec des gammes de métastases du foie de 4,8 à 15 mois ^6-9. En revanche, les patients atteints de cancer du sein avec des poumons ou des métastases osseuses ont des taux de survie médiane de 9 à 27,4 mois ^8,9 et 16,3 à 56 mois ^8,10-12, respectivement. Métastase est un processus en plusieurs étapes, appelée la cascade métastatique, qui commence par la diffusion des cellules tumorales dans la tumeur primaire et se termine par la mortalité des patients en raison de l'ensemencement et l' excroissance des cellules tumorales en circulation au sein d' un organe éloigné ^13-15. modèles murins de métastases ont révélé que la cascade métastatique est remarquablement inefficace, avec seulement 0,02 - 10%des cellules tumorales circulantes établissant une métastase manifeste ^16,17. Un obstacle majeur de l' inefficacité métastatique est dictée par les microenvironnements de tissus uniques sur les sites secondaires, appelés niches métastatiques ^18, soulignant l'importance de la compréhension des métastases spécifiques au site. La niche métastatique est unique sur le site de récurrence, et est, en partie, caractérisée par le dépôt de différentes protéines de la matrice extracellulaire ^19,20, infiltration de diverses populations de cellules immunitaires ^21-23, et l' homéostasie tissulaire altérée , y compris la production dérégulée de nombreuses cytokines, chimiokines et facteurs de croissance ^15,18,24,25. Ainsi, une compréhension de la niche métastatique spécifique de tissu précède une compréhension de la façon de cibler la maladie métastatique. Cependant, les modèles robustes de métastases hépatiques manquent. De plus, l'amélioration des modèles de métastases hépatiques seront essentiels à l'identification de nouvelles cibles et des traitements efficaces pour les patients atteints de cancer du sein wie métastases hépatiques.

Modèles d'étude du cancer du sein métastase au foie Créé

Actuellement les modèles disponibles pour étudier les métastases du cancer du sein, au foie comprennent des xénogreffes de cellules cancéreuses humaines chez des souris immunodéficientes. Ces modèles utilisent généralement des lignées cellulaires bien étudiés humains cancer du sein tels que MCF-7 et MDA-MB-231 et Nu, Rag1 ^{- / -,} ou immunitaires SCID compromis hôtes murins ^26-29. Modèles de xénogreffe offrent l'avantage d'impliquer des lignées de cellules de cancer humaines dérivées, cependant, compte tenu de la récente appréciation pour les cellules immunitaires dans les métastases ^30-32 et dans la résistance thérapeutique ^33-35, l'étude des métastases dans un hôte compétent entièrement immunitaire est primordiale. Les modèles pour l' étude sein des métastases cancéreuses dans le foie chez des hôtes immunocompétentes comprennent l' injection orthotopique syngénique de cellules tumorales (par exemple, 4T1 et des lignées cellulaires de D2A1) dans le coussinet adipeux mammaire, avec ou sans chirurgierésection de la tumeur primaire, et l' évaluation subséquente des métastases ^36-38. Il faut noter que le taux de métastases hépatiques à partir des modèles de transplantation orthotopique est très faible , voire inexistant par rapport à d' autres sites métastatiques pulmonaires telles que ^39,40 ou survient après métastases pulmonaires est établie, ce qui complique l'étude des métastases hépatiques spécifiques à ^37,39 .

explants tumoraux à partir de modèles spontanés de cancer du sein génétiquement peuvent être ré-injectés dans les coussinets adipeux mammaires d'hôtes naïfs que les cellules tumorales syngéniques. Par exemple, il a été récemment rapporté que les tumeurs spontanées de K14 ^Cre ECAD ^{f / f} P53 ^{f /} souris ^f, quel modèle invasif de carcinome lobulaire du sein, les tumeurs se développent quand orthotopiquement injecté dans des hôtes de type sauvage. Après résection chirurgicale de ces tumeurs lorsqu'elles atteignent 15 mm ^2, 18% des souris ont évolué vers des métastases hépatiques ^40,41. Une troisième approche de modèle utilise des métastases du foiemétastase spontanée chez des souris génétiquement modifiées. À ce jour, les rapports des modèles murins spontanés de cancer du sein métastatique du cancer qui se propager facilement au foie sont rares. Les exceptions incluent la H19-IGF2, p53 ^{fp / fp} MMTV-Cre Wap-Cre et le K14 ^Cre ECAD ^{f / f} P53 ^{f / f} modèles de souris génétiquement modifiées, où les métastases du foie se développe dans un faible pourcentage de souris ^{38,41- 43.} Ainsi, tandis que les modèles de souris génétiquement modifiées facilitent l'étude de toutes les étapes de la cascade métastatique, en fournissant des modèles puissants et cliniquement pertinents, ils sont limités en raison des taux de métastases hépatiques ³⁸ faibles.

Plusieurs modèles de métastases contournent les premières étapes de la cascade métastatique, y compris la dissémination des cellules tumorales de la tumeur primaire et intravasculaire. Ces modèles permettent enquête sur les étapes ultérieures de la cascade métastatique, d'extravasation à l'établissement de tumeurs sur des sites secondaires. L'intle modèle d'injection racardiac délivre des cellules tumorales dans le ventricule gauche, qui distribue des cellules tumorales dans le système circulatoire par l'intermédiaire de l'aorte. l'injection intracardiaque nécessite guidée par ultrasons d'imagerie du site d'injection ou d'autres modalités d'imagerie telles que la bioluminescence de luciférase des cellules pour confirmer tagged injection réussie. L' injection des cellules tumorales via le ventricule gauche peut entraîner des os, du cerveau, du poumon, et / ou des métastases hépatiques, entre autres organes ^44-48. En raison de métastases multi-organes, ces souris ont souvent besoin d'être euthanasiés avant le développement des métastases hépatiques manifeste, niant la capacité d'enquêter pleinement sur la croissance métastatique dans le foie. Une approche alternative qui minimise considérablement le développement du multi-site métastase est le modèle d'injection intra-splénique. L' injection intra - splénique délivre des cellules tumorales via la veine splénique qui rejoint la veine mésentérique supérieure pour devenir la veine ^49,50. Les animaux peuvent être surveillés pour outgrowth des lésions métastatiques dans le foie parce que la formation de métastases dans d' autres sites est rare, et par conséquent, la santé globale de l'animal est maintenu ^49,50. Cependant, il est important de noter que le modèle nécessite une splénectomie intrasplénique pour éviter des tumeurs spléniques ^49,50, une procédure qui a un impact de la fonction immunitaire. Par exemple, une lésion d' ischémie myocardique reperfusion est caractérisée par une infiltration de Ly6C ⁺ sous - populations de monocytes qui proviennent de la rate et sont responsables de la phagocytose et l' activité protéolytique au cours de la cicatrisation des plaies suite à une ischémie ^51,52. Avec une splénectomie, il y a une réduction observée dans les populations monocytaires qui aident à cicatrisante ^52. En outre, la splénectomie a été montré pour réduire la croissance des tumeurs primaires et des métastases pulmonaires dans un modèle de cancer du poumon non à petites cellules, en particulier par une réduction du nombre de circuler et intra-tumorale CCR2 ⁺ CD11b ^{+ +} Ly6C myélo monocytairecellules id ^53. En outre, suite à l' injection intrasplénique splénectomie des cellules de cancer du côlon a donné lieu à des taux réduits de cellules tueuses naturelles anti-tumorale dans les ganglions lymphatiques mésentériques et les métastases hépatiques élevées ^54. En somme, ces résultats suggèrent que la splénectomie compromet le rôle du système immunitaire avec des conséquences ultérieures pour le destin des cellules métastatiques.

Veine Modèle d'injection du foie Métastases

Pour étudier le cancer du sein métastatique au foie chez un hôte compétent totalement à l'abri, dans des conditions où les souris ne sont pas compromises en raison de métastases multi-organes, un modèle d'injection de la veine a été développé. Modèles d'injection intraporte ont été utilisées précédemment pour étudier métastases hépatiques du cancer colorectal et le mélanome ^{55,56 16} lignées cellulaires; Nous décrivons ici l'application de l'injection intraportale au modèle syngénique mammaire métastatique des cellules tumorales. Ce modèle peut être utilisé pour étudierles étapes ultérieures de la cascade métastatique, y compris le cancer du sein extravasation des cellules et l'ensemencement, la tumeur décisions du destin cellulaire concernant la mort / prolifération / dormance, et l'excroissance dans les lésions ouvertes. Dans ce modèle, les lignées de cellules tumorales mammaires syngéniques sont injectées par l' intermédiaire de la veine porte de souris immunes femelles Balb / c compétentes, un procédé qui fournit des cellules tumorales d'une part , et directement vers le foie sans ablation de la rate. Pour développer ce modèle, l'utilisation de quatre lignées cellulaires de tumeurs mammaires qui vont dans leur capacité métastatique de faible à élevé ont été employés: D2.OR, D2A1 et 4T1, et ont utilisé D2A1 marqués avec la protéine fluorescente verte (D2A1-GFP) pour examiner au début points de temps après l'injection de cellules tumorales. 4T1 est une lignée cellulaire hautement métastatique provenant de la tumeur qui 410,4 apparue spontanément dans une souris / c femelles Balb ^{36,37 +} MMTV et des métastases au poumon, le foie, le cerveau et les os de coussinet adipeux mammaire tumeurs primaires ^39,57,58. cellules tumorales D2A1 were également à l' origine dérivée d'une tumeur mammaire spontanée provenant d'un / c hôte Balb après la transplantation de cellules nodule alvéolaires hyperplasiques D2, et sont confirmés pour être métastatique de la tumeur primaire du poumon ^59,60. Les cellules tumorales D2.OR sont une lignée sœur non métastatique à la ligne de D2A1 et, bien qu'ils échappent à la tumeur primaire et arrivent à des sites secondaires, ils établissent rarement des métastases à distance ^60,61.

En outre, il est important d'éviter l'utilisation de médicaments de gestion de la douleur couramment employées, y compris les médicaments non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) pendant ou après l'intervention chirurgicale. Les AINS ont une activité anti-tumorale dans certains cancers du sein ^62-65, et certaines catégories d'AINS augmentent le risque d'hépatotoxicité ^66,67, ce qui pourrait compromettre l'étude des métastases du foie et de la niche de métastases du foie. En outre, des études suggèrent que les AINS influent directement sur le microenvironnement des tissus, ce qui réduit poste pro-métastatiqueprotéines de la matrice racellular ténascine-C ⁶⁸ et collagène fibrillaire ^62,65. Alternativement, l'utilisation d'un dérivé opiacé, buprénorphine, a été utilisé en raison de son efficacité dans la gestion de la douleur des rongeurs ⁶⁹ et en raison de l'absence de preuves que les opioïdes ont une activité anti-tumorale ^70. Ce modèle d'injection de la veine a été optimisé pour les volumes d'injection plus petits de 5 - 10 pi pour éviter des dommages inutiles au foie. Le modèle a également été optimisé pour inclure des aiguilles avec un diamètre plus petit (≥ 32 gauge) et l'utilisation de gaze hémostatique immédiatement après l'injection pour minimiser la perte de sang pendant la procédure. Contrairement à ces paramètres d'injection optimisés, le nombre de cellules devrait être déterminée sur une base individuelle, en fonction du potentiel tumorigène de la lignée cellulaire. Cependant, à partir de ≤ 10 000 cellules / injection pour les études à long terme est recommandée. Pour les noeuds finaux plus courts (par exemple, après l'injection de 24 heures) , les cellules beaucoup plus de tumeurs (par exemple,1 x 10 ⁵ - 1 x 10 ⁶⁾ peuvent être utilisés si cela est justifié. En résumé, le modèle d'injection portale détaillé ici représente un outil utile pour l'étude des métastases du cancer du sein, au foie et évite un certain nombre de limitations des autres modèles de métastases hépatiques. Ce modèle facilite l'étude de l'extravasation des cellules tumorales, l'ensemencement, les décisions du destin début de la survie, la prolifération et la dormance, et l'excroissance métastatique chez des hôtes murins immunitaires compétentes.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux dans cet article ont été examinés et approuvés par l'Oregon Health & Science University Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Préparation de la zone et les instruments chirurgicaux

1. Préparer les ciseaux, pinces, et hémostatique par autoclavage à 124 ° C pendant 30 min, 1 - 2 jours avant les chirurgies prévues. Assurer l'accès à la literie autoclavée ou stériles, des cages, et de la nourriture pour la récupération post-chirurgicale.
2. Préparer une zone chirurgicale aseptique, de préférence dans une hotte à flux laminaire.
   1. Essuyez toutes les surfaces de la zone chirurgicale avec 10% de l'eau de Javel, y compris le coussin chauffant, source de lumière, un tube d'anesthésie et de cône de nez, et toute autre partie de la suite chirurgicale qui sera à proximité immédiate de l'intervention chirurgicale alors qu'il est en cours d'exécution .
   2. Dans le domaine de la chirurgie aseptique, placez le coussin chauffant nettoyé avec champ stérile, source de lumière, un tube d'anesthésie et nosecone, seringues à insuline, Seringues de 1 ml, bupivacaïne, larmes artificielles, une solution saline stérile, 2 x 2 "éponges de gaze stériles, 4 x 4" gaze stérile, coupe de gaze hémostatique dans 0,5 à 1 cm ² pièces, ciseaux, pinces, hémostatique, 4-0 sutures vicryl avec l'aiguille conique, et 50 ml de 2% gluconate de chlorhexidine dans un récipient autoclave.
   3. Assurez-vous qu'il ya place dans cet espace pour les cellules tumorales préparées stockées sur de la glace.
   4. Sur le banc à côté de la zone chirurgicale, préparer la zone de récupération avec un second coussin chauffant et cages propres avec une literie stérile.
      NOTE: Cette zone peut aussi les articles de maison tels que un stérilisateur à billes.

2. Veine Injection

1. Une heure avant les injections prévues, traiter Balb / c souris femelles âgées de 8 - 15 semaines avec 100 ul de 0,015 mg / ml de buprénorphine, sous-cutanée, pour la gestion de la douleur.
   NOTE: Ce protocole d'injection peut être appliquée à toute souche de souris femelle ou mâle à tout âge, en utilisant la appropriéelignées cellulaires pour des modifications à la souche.
2. Préparer les cellules tumorales pour l'injection sur la base de protocoles pour la lignée cellulaire tumorale ou expiant de choix. Tester toutes les lignées de cellules tumorales avant l'administration de la présence d'agents pathogènes murins afin de réduire le risque d'introduction de ces agents pathogènes dans la colonie d'animaux.
   1. Pour les lignées de cellules tumorales Balb / c syngéniques y compris D2A1, D2.OR et les cellules tumorales 4T1, les cellules de décongélation dans un tissu plaque de culture de 10 cm 3 jours avant l'injection de telle sorte que les cellules de jour suivantes sont à ~ 90 - 100% de confluence.
   2. 1 jour, les cellules de lavage de décongélation des cellules tumorales suivant une fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et les cellules confluentes trypsiniser tumorales en utilisant 2 ml de trypsine à 0,05% à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 8 ml de milieu complet (DMEM riche en glucose, 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, et 1x pénicilline / streptomycine) et passage 1h10 dans une nouvelle boîte de 10 cm avec 10 ml de milieu complet.
   3. Le jour de l'injection, laver les cellules une fois avec PBS 1x et trypsinize comme décrit ci-dessus.
   4. Resuspendre les cellules trypsinisées dans 8 ml de milieu complet, essorage pendant 5 min à 1500 xg, retirez le support et remettre en suspension dans 5 ml 1x PBS.
   5. Compter les cellules sur un hémocytomètre en utilisant l'exclusion du bleu trypan pour l'évaluation de la viabilité. La remise en suspension des cellules pour l'injection dans 1 x PBS à une concentration et un volume prédéterminé.
      NOTE: 5 - 10 pi est recommandé que les volumes d'injection plus petits empêchent des dommages inutiles au foie.
   6. Maintenir les cellules sur la glace pendant toute la durée des injections. Après l'achèvement des injections, le retour d'un échantillon de cellules au laboratoire et à mettre en culture dans un milieu complet pendant 1 jour pour assurer la viabilité.
3. Placer la souris sous anesthésie avec de 2 à 2,5% d'isoflurane (2-chloro-2- (difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane) délivré en oxygène. Maintenir la température du corps en utilisant le coussin chauffant. Assurer l'anesthésie complète en évaluant pour une réaction à un pincement de l'orteil, puis maintenir anesthesia de 2 - 2,5% isoflurane.
   NOTE: Il est important de surveiller les animaux taux de respiration et d'ajuster le débit isoflurane en conséquence tout au long de la procédure.
4. Placer une petite quantité de larmes artificielles ou vétérinaire onguent sur chaque oeil pour éviter un séchage excessif des yeux pendant l'intervention chirurgicale.
5. Placez la souris dans une position couchée sur le dos avec un abdomen exposé.
6. Enlever les poils sur le côté gauche ventrale du rongeur à partir du deuxième espace de nervure jusqu'à la 4 ^ème glande mammaire inguinal mamelon en essuyant la surface avec dépilatoire chimique. Laisser le épilatoire reposer pendant 1 - 2 min puis retirez complètement avec de la gaze et H ₂ O. Cette étape peut être fait 1 - 2 jours à l' avance pour gagner du temps si de nombreuses interventions chirurgicales sont prévues.
7. Prenez une 2 x 2 "éponge de gaze stérile (trempé dans 2% de chlorhexidine) et essuyez la souris sur le site de l'épilation. Stériliser toute la zone environnante, y compris la queue, pour minimiser cont bactérienneamination d'instruments.
8. Essuyez le site de l'épilation et ses environs vers le bas avec un tampon à l'alcool.
9. Répéter 2% de chlorhexidine et d'alcool étapes une fois de plus et terminer avec une chlorhexidine finale essuyer pour un total de trois 2% de chlorhexidine et deux lavages de tampon de préparation d'alcool. Ne la chlorhexidine finale essuyer de telle sorte que le produit chimique ne goutte pas autour du site chirurgical pour éviter de se chlorhexidine sur les organes internes. NOTE: L'application de grandes quantités de chlorhexidine et de l'alcool sur la peau et de la fourrure environnante peut se traduire par une baisse significative de la température corporelle. Ne pas essuyer avec un excès de volume au cours des étapes 2,7-2,9. Maintenir la température du corps avec un coussin chauffant.
10. En utilisant des gants stériles et un scalpel stérile avec une lame stérile, une seule incision de 1 pouce dans la peau entre les plans médians et sagittal sur le côté gauche de la souris, en commençant juste au-dessous des nervures et se terminant juste au-dessus du plan de la quatrième inguinale tétine mammaire de la glande.
11. Avec des ciseaux et des pinces autoclavés ou stérilisés perles, faire un 1 pouce semblable incision dans le péritoine. Évitez de couper dans le coussinet adipeux mammaire et veiller à ne pas couper les intestins, le foie, ou le diaphragme.
12. Placer un "bloc 4 x 4 de gaze trempée dans une solution saline stérile sur le côté gauche de la souris, où l'incision est faite, de telle sorte que les organes internes peuvent être placées sur la gaze et ne viennent en contact avec la peau qui l'entoure ou de la zone chirurgicale.
13. Préparer les cellules tumorales par pipetage de haut en bas plusieurs fois les cellules tumorales se déposent lors de la préparation de la souris. Préparer une seringue amovible 25 ul d'aiguille et une aiguille de calibre 32 avec des cellules tumorales. Appuyez sur la seringue jusqu'à ce que les cellules tumorales sont à la pointe de l'aiguille et le piston est au volume approprié pour l'injection; éviter l'injection de bulles d'air.
14. Essuyez l'extérieur de l'aiguille avec un tampon d'alcool stérile pour éliminer toutes les cellules tumorales externes. Faites preuve de prudence pour éviter les piqûres d'aiguille.
15. Tenez le sid médiane de l'incision, y compris la peau et la doublure péritonéale, de côté avec la pince et d'utiliser un coton-tige stérile pour tirer avec précaution les grands et les petits intestins, en les plaçant sur la gaze stérile trempée dans une solution saline stérile. Sortez petits et grands intestins jusqu'à ce que la veine porte est visualisée.
16. Couvrir les organes internes de la gaze imbibée de solution saline pour maintenir l'humidité interne et la stérilité.
17. Avoir un assistant, portant également des gants stériles, maintenez les intestins enveloppés dans la solution saline gaze imbibée doucement hors de la voie avec un coton stérile pointe écouvillon pour révéler pleinement la veine porte. En outre, il peut être nécessaire d'utiliser la pince hémostatique ou une pince autoclavé pour tenir le tissu de côté sur le côté médian de l'incision.
18. Insérez l'aiguille chargée de cellules tumorales ~ 3-5 mm dans la veine porte ~ 10 mm au-dessous du foie à un angle <5 ° à la veine, avec biseau vers le haut. injecter lentement le plein volume contenant les cellules tumorales. Laisser le sang couler passé l'aiguille head pendant plusieurs secondes pour éviter le reflux des cellules tumorales de la veine. Réduire au minimum le déplacement de l'aiguille dans la veine lors de l'injection. Encore une fois, faire preuve de prudence pour éviter les piqûres d'aiguille.
    NOTE: Visualisation de la veine porte se fait sans grossissement, mais un microscope stéréo peut être utilisé si l'on préfère.
19. Retirez l'aiguille tout en plaçant simultanément une pointe de coton applicateur stérile sur la veine avec la pression. Avec l'assistant tenant toujours les intestins de côté placer un morceau de 0,5 à 1 cm ² hémostatique gaze sur le site d'injection sur la veine.
    NOTE: La poudre hémostatique a également été tentée pour cette étape dans le protocole, mais n'a pas été efficace pour arrêter la perte de sang veineux après l'injection.
20. Maintenez la gaze hémostatique sur le site d'injection avec la pression d'un applicateur de pointe de coton stérile pendant 5 min.
21. Évaluer la fermeture de la veine en soulevant soigneusement la gaze hémostatique, si les bâtonnets de gaze au tissu environnant, une petite quantité de Sterile solution saline peut être utilisée pour absorber et soulever la gaze.
22. Si la perte de sang se produit à ce moment, placer une pièce supplémentaire de gaze hémostatique sur le site avec la pression pour 5 minutes supplémentaires. Lorsque le flux sanguin a cessé complètement, retirez la gaze de la souris.
    NOTE: La perte de sang pendant l'intervention chirurgicale doit être évaluée avec soin et si le volume de perte de sang total autorisé est atteint ou dépassé (basé sur des procédures normalisées d'exploitation réglementaires pour les conseils d'examen institutionnels de l'enquêteur) la souris doit être euthanasié sous anesthésie par perfusion cardiaque.
23. Une fois que le site d'injection est réputé intact, sans sang quittant le site d'injection, placer les organes internes doucement dans la cavité abdominale.
24. Suturer la muqueuse péritonéale et ensuite la peau avec stérile suture 4-0 Vicryl et une aiguille conique en utilisant un motif de suture continu ou interrompu simple. En règle générale, la fermeture de l'incision nécessite 10-15 sutures.
25. Injecter 100 ul de bupivacaine (5 mg / ml) le long du site de l'incision pour la gestion de la douleur locale à l'aide d'une seringue à insuline. Injecter 0,5 ml de sérum physiologique stérile par voie sous- cutanée à l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26 pour l'hydratation. Chirurgies prendre 15 - 25 min pour terminer.
26. Pour maintenir des conditions stériles tout au long de l'opération, veiller à ce que tous les outils et les matériaux entrant en contact avec la souris, y compris les mains gantées, sont convenablement nettoyées avant le contact. Si possible, utilisez des matériaux et des gants stériles, ou très peu utilisent une solution d'éthanol à 70% ou une solution d'eau de Javel à 10% pour nettoyer.
27. Si plusieurs chirurgies sont prévues pour une seule session remake de la zone chirurgicale initiale avec drapé frais stériles, seringues à insuline, seringues de 1 ml, solution saline stérile, "éponges de gaze stérile, 4 x 4" 2 x 2 gaze stérile, de la gaze hémostatique coupé en 0,5 - 1 cm ² pièces, 4-0 sutures vicryl avec aiguille conique, et 2% de chlorhexidine. Bead-stériliser les ciseaux, pinces, et hémostatique entre les deux interventions chirurgicales et de permettrerefroidir de manière adéquate à la réutilisation préalable.

3. Récupération, Surveillance Rongeur santé et point final Analyses

1. Après l'intervention chirurgicale est terminée, maintenir la souris sur un coussin chauffant pour la récupération en libre literie, cages propres pour un minimum de 20 min. Les souris prennent généralement 2 - 4 min pour se réveiller de l'anesthésie.
2. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la co-habitation avec d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré de l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance alors qu'il regagne la conscience et de suivre jusqu'à ce que l'animal a retrouvé la capacité de se maintenir en décubitus sternal.
3. Donner des souris de 0,05 à 0,1 mg / kg buprénorphine pour la gestion de la douleur à chaque opération suivante 6-12 h, jusqu'à 72 h.
4. Vérifiez sutures quotidienne pour assurer qu'ils restent intacts lors de la guérison. Dans le cas où les sutures se défont, placez la souris sous anesthésie, enlever les sutures restantes, et le remplacer. Dans le cas d'une infection ou Inflammation consulter le personnel vétérinaire.
   NOTE: L'infection ou l'inflammation n'a pas été rencontré avec ce protocole.
5. Pour les études de métastases, effectuer des vérifications quotidiennes de santé jusqu'à ce que les signes extérieurs de la maladie métastatique sont observées, y compris, mais sans s'y limiter:> 10% de perte de poids / gain, laisser-aller, la perte d'attention aux environs, abdominaux œdème / ascite, les yeux et les oreilles pâles, ou une position courbée.
   REMARQUE: les contrôles de santé quotidiens sont particulièrement importants lors de l'élaboration du modèle pour une utilisation avec une nouvelle lignée cellulaire ou la concentration de cellules jusqu'à ce que la chronologie des métastases est bien comprise.
6. À l' étude du point final, euthanasier les souris par inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale.
   NOTE: D'autres méthodes d'euthanasie approuvées par le comité de surveillance des enquêteurs peut être utilisé, y compris la perfusion avec 1x PBS sous anesthésie. Perfusion du foie est réalisée par canulation de la veine porte, coupant la veine cave inférieure, et en poussant e PBS 1xrugueux le système vasculaire du foie à un débit de 4 ml / min pendant 1-2 min pour éliminer le sang et les leucocytes circulants.
   REMARQUE: Selon le critère d'évaluation pour l'étude, la lignée cellulaire et la concentration utilisée, manifeste métastases hépatiques peut ou peut ne pas être apparent à l'autopsie. lésions micrométastases peuvent être révélées par l'analyse histologique du foie. Endpoints varient en fonction de la conception de l'étude.
7. Extrait du foie avec des ciseaux et des pinces en enlevant d'abord la vésicule biliaire, puis couper à travers la veine cave inférieure supérieure au foie. Couper à travers la veine cave, la veine porte et l'artère hépatique inférieur au foie.
8. Retirez le foie entier doucement et laver 5x dans PBS 1x.
9. Séparer le foie en gauche, lobes droite, médiane et caudé.
10. Formol foie fixe dans 10% du formol tamponné neutre pendant 48 heures tout en agitant à la température ambiante. Procédé tissus à travers une série d'alcools en augmentant la concentration et le xylène; paraffine intégrer le tissu fixe ⁷¹ .
    NOTE: En variante, le foie peut être snap-gelé par le tissu plaçant dans un cryomoule avec la température de coupe optimale (OCT) formule et le gel sur des pastilles de glace sèche immergé dans 95% d'éthanol.
    1. L'utilisation d'un microtome, coupé dans le bloc de tissu inclus dans la paraffine de telle sorte que la taille de match-tête de tissu est révélé.
    2. Couper cinq 4 microns sections de série, ce qui constitue le premier niveau d'analyse.
    3. Couper à travers 250 microns de tissu, jeter ces sections dans les déchets.
    4. A 250 microns couper un second niveau de cinq 4 microns coupes en série.
    5. Répéter au besoin à la section à travers le foie entier. Hématoxyline et éosine la première section de chaque niveau pour évaluer des métastases ^72.
       NOTE: Pour les tissus snap-congelés utiliser un cryostat pour couper des sections.
       REMARQUE: La détection de la maladie micrométastatique nécessitera une coloration spécifique des cellules tumorales.
11. Retirer les souris de l'étude, s'il y a une croissance de la tumeur à l'incision s'asseoire, car cela indique une fuite de cellules tumorales dans le péritoine après l'injection.
    NOTE: Ce problème n'a pas été observé.

Résultats

Le modèle d'injection portale, dans laquelle les cellules tumorales sont délivrés directement dans le foie par l'intermédiaire d'une intervention chirurgicale, permet l'injection de cellules tumorales dans la veine porte. Dans des conditions antiseptiques dans une souris anesthésiée, a ~ 1 pouce incision chirurgicale est faite sur le côté gauche de la souris entre les plans médians et sagittal, en commençant juste au-dessus du plan de la quatrième inguinale glande mammaire trayon et se terminant juste au-dessous des nervures . Les grands et les petits intestins sont légèrement tirés à travers l'incision pour fournir une visualisation de la veine (figure 1A). identification anatomique précise de la veine porte et de l'injection intra-portail réussie peut être confirmée par la pratique du protocole d'injection avec l'encre de Chine ou un colorant similaire. Injection correcte via la veine porte se traduira par l'encre étant livré immédiatement et spécifiquement dans le foie, et ne causera pas l'encre de Chine propagation au poumon (Figure 1B). En outre, en utilisant des cellules de tumeur mammaire de souris D2A1 marqués avec la GFP, la dispersion des cellules tumorales à travers le foie est apparent à quatre - vingt dix minutes après l'injection, ce qui confirme le portail livraison injection dans la veine du foie (figure 1C). A plus fort grossissement , il devient évident que , à 90 minutes après l'injection, les cellules tumorales se trouvent dans sinusoïdes, ainsi que dans le parenchyme hépatique à proximité de triades de portail, où le sang de la veine porte pénètre dans le foie (figure 1C). Ces données suggèrent que l'activité extravasation des cellules tumorales se produit à l'injection de cellules tumorales post 90 min. Pris ensemble, ces données confirment que le modèle d'injection portale délivre le volume d'injection directement vers le foie, avec des cellules tumorales ou d'encre dispersés à travers le foie et aucun moyen de transport appréciable du volume d'injection dans le poumon.

Pour évaluer la robustesse de la veine modèle d'injection de portail, trois separate lignées syngéniques de cellules tumorales mammaires de souris ont été testés chez des souris Balb / c femelles adultes. Ces lignées tumorales mammaires ont été sélectionnés en fonction de leur comportement caractérisé dans les modèles de coussinet adipeux mammaires et comprennent la ligne très agressive et métastatique 4T1 cellulaire, la ligne moins agressive de D2A1 métastatique, et la ligne de D2.OR faible / non-métastatique ^{37,61,73 , 74.} 2.000 et 10.000 cellules par injection ont été testées avec aucune différence notable dans le temps pour le développement de métastases manifeste avec ces faibles concentrations cellulaires. Pour ces études, des marqueurs de substitution des métastases ont été utilisés tels que l'absence de toilettage, la pâleur, et la perte de poids pour justifier la nécropsie, sur lequel la présence ou l'absence de métastases hépatiques ont été confirmés par une évaluation visuelle du foie et d'autres organes pour confirmer la distribution intra-portail . Ces données confirment les rapports précédents que les lignées de cellules 4T1 et D2A1 représentent des lignes plus agressives de tumeurs mammaires, des métastases plus courte taux de survie libres sont observés par rapport à des souris injectéesavec la ligne de D2.OR moins agressif (figure 2A). Les souris injectées avec des cellules 4T1 ou D2A1 tumorales développé des métastases hépatiques ostensibles ~ 30 - 40 jours après l'injection, et certains métastase développé dès que 18 jours après l'injection (figure 2A), alors que seule la souris injectées avec des cellules D2.OR avait développé manifeste métastases hépatiques d'ici la fin de l'étude, qui était de 60 - l'injection de cellules post-tumeur 65 jours. Les métastases ont ensuite été confirmés par sectionnant par le foie dans 250 um niveaux et en analysant l' hématoxyline et à l' éosine (H & E) des coupes colorées (figure 2B-D).

En plus de la détection des lésions métastatiques patents dans le foie de la souris, le modèle de la veine peut également être utilisé pour étudier les événements antérieurs dans la cascade métastatique, y compris la détection de simples cellules / agrégats de cellules suivant l'extravasation, et la formation de micro-métastatique lésions. Multiplexe coloration par immunofluorescence a été utiliséepour détecter 4T1, D2A1, et des cellules tumorales mammaires D2.OR dans le foie quand ils sont présents sous forme de cellules individuelles ou micro-métastatique des lésions, comme H & E ne suffit pas à confirmer la présence de petites lésions. La figure 3A montre un Balb / c foie de souris représentant d'un des foyers micrométastatique putatif de cellules D2A1 tumorales qui sont positifs pour l'épithéliale kératine CK18, négatif pour le marqueur CD45 pan-immune, et négatif pour le marqueur hépatocytaire Heppar-1. Hépatocytes colorent également positif pour CK18, ce qui nécessite l'utilisation de Heppar-1 dans ce panneau de coloration. Une remarque importante est que les cellules des voies biliaires épithéliales et progénitrices du foie tache positive pour CK18, nécessitant une discrimination soigneuse entre les cellules tumorales et les conduits biliaires, en particulier lors de l' évaluation des régions périportaux (figure 3A). Une alternative à multiplexer immunofluorescence pour identifier les cellules disséminées simples et foyers micrométastases est d'utiliser des lignées tumorales mammaires syngéniques marqués avec fluorescente verte amélioréeprotéines (eGFP) et / ou la luciférase et effectuer IHC pour la balise (figure 1C). En raison de l'immunogénicité de eGFP, la luciférase, et d' autres protéines, il est essentiel d'utiliser des modèles de souris qui sont rendues tolérantes à ces protéines, comme le roman "tête rougeoyante" souris immunitaire compétent qui exprime eGFP et la luciférase dans la glande hypophyse antérieure ^75. Pour l' identification des lésions macrométastatique de lignes syngéniques non étiquetées comme la ligne D2A1 de la tumeur, l'immunofluorescence multiplex CK18 / Heppar-1 / CD45 est idéal (figure 3B).

Figure 1: Veine Injection Rend les cellules tumorales directement au foie. A) l' injection de la veine porte; l'incision est faite entre la médiane et sagittal gauche, au-dessus du plan de la glande mammaire inguinal quatrième trayon et se terminant juste au-dessous rib cage. B) Balb / c foie avec une injection de PBS ( à gauche). À la suite de l'Inde injection d'encre par l'intermédiaire de la veine porte du foie (au milieu), mais pas le poumon (à droite) prend l'encre. C) représentatifs minces images de section de cellules tumorales mammaires de souris D2A1 marqués avec la GFP dans un c / foie de souris Balb à 90 min après l'injection de 1 x 10 cellules tumorales ⁶ par l' intermédiaire de la veine porte. Foies ont été fixées au formol, inclus dans la paraffine, sectionnées et colorées avec un anticorps anti-GFP pour la détection de cellules tumorales. Le panneau supérieur montre des cellules sombres brunes tachées tumorales (flèches) dispersées à travers le foie, astérisque indique hépatocytes coloration non spécifique autour des veines centrales; barre d'échelle = 300 um. panneaux inférieurs montrent des images représentatives de cellules tumorales à 90 min post-injection toujours étroitement associée à la vascularisation; barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Excroissance de souris mammaires lignées cellulaires tumorales dans le foie suite à Portal Vein Injection. A) Kaplan-Meier courbe montrant les taux de survie sans métastases chez des souris injectées avec 2.000-10.000 cellules 4T1, D2A1 ou tumeur mammaire D2.OR de la souris. Les souris ont été injectées avec des cellules tumorales et contrôlées pour des signes de métastases, y compris l'absence de toilettage, les yeux clairs, et les variations de poids. Métastase a été confirmé au moment de l'autopsie et par H & E sur des coupes histologiques des foies. N = 2 4T1 2000 cellules; 2 10 000 cellules 4T1. N = 2 D2A1 2000 cellules; 3 D2A1 10.000 cellules. N = 3 D2.OR 2000 cellules; 3 D2.OR 10.000 cellules. Images représentant H & E de B) 4T1 lésions à 21 jours après l'injection de 10.000 cellules, C) des lésions D2A1 à 26 jours après l'injection de cellules tumorales 10.000, et D) lésions D2.OR à59 jours après l'injection de 10.000 cellules; barres d'échelle = 75 pm. lésions similaires sont observés lorsque 2.000 cellules 4T1 ou D2A1 tumorales ont été injectées. Aucune lésion n'a été détectée avec 2.000 cellules D2.OR. Aucun signe de métastases dans d'autres organes ou sur le site d'incision chirurgicale était apparent dans toute la souris sur ces études. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Détection de cellules simples et métastatiques Lésions dans le foie de souris à l' aide de Multiplex immunofluorescence. A) multiplex immunofluorescence représentant des cellules D2A1 tumorales dans une / c foie de souris Balb à 90 min post-injection en utilisant le modèle d'injection de la veine. La coloration a été effectuée à l'aide d'un kit multiplex. De gauche à droite montre DAPI; CD45 pour marquer les leucocytes; Heppar-1 Mark hépatocytes; et CK18 pour marquer les cellules tumorales, des hépatocytes et des voies biliaires épithélium. Image fusionnée montre un cluster putatif de CK18 ⁺ Heppar-1 ^- cellules tumorales D2A1 étroitement associées à une triade portail ^- CD45. Flèche = cellules tumorales D2A1, astérisque = bile épithélium du canal; barre d'échelle = 25 pm. B) une lésion métastatique D2A1 ouverte représentative en utilisant le même panneau de coloration que dans les cellules tumorales sont A. CK18 ⁺ tandis que les hépatocytes adjacents sont CK18 ⁺ Heppar-1 ^+; barre d'échelle = 25 pm. Les images ont été capturées sur un microscope à 0,8 x 20, 40 x 1,3 et 1,4 x 60 objectifs et une caméra CCD, en utilisant le logiciel de microscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le portail de la souris modèle d'injection dans la veine Balb / c permet l'étude des lésions cancéreuses mammaires dans le foie, en l'absence de métastases d'organes multiples facteurs de confusion et dans un hôte compétent totalement à l'abri. Notre protocole est une amélioration des procédures chirurgicales précédemment publiées qui permettent l' accès à la veine porte pour l' injection de cellules tumorales directement dans le foie ^16,55,56. Un progrès que nous avons fait est de réduire significativement le nombre de cellules tumorales injectées à partir de ≥ 1 x 10 ⁵ cellules / injection ^16,55,56 vers le bas à ≤ 10.000 cellules tumorales / injection. Nous avons également développé un modèle pour l'étude des métastases du cancer du sein, au foie. En utilisant ce protocole, deux lignées de cellules cancéreuses mammaires avec un potentiel métastatique connu développent des métastases hépatiques avec un temps de latence plus courte qu'une lignée de cellules de tumeur mammaire plus quiescent. En outre, à des points de temps précoces, les cellules tumorales sont distribuées dans tout le parenchyme hépatique comme des groupes uniques ou des petits de même thisIIs après l'injection des cellules tumorales. Le modèle est prêt à répondre à des questions d'efficacité métastatique dont la tumeur extravasation cellulaire, la survie cellulaire, la dormance et la prolifération - tous les phénotypes qui contribuent au développement de la maladie métastatique micro-métastatique et manifeste dans le foie.

Il est important de tenir compte de nombreux aspects de la veine protocole d'injection avant d'entamer des études. décider soigneusement sur des lignées cellulaires, la concentration de cellules, le nombre total de cellules, et en fin de points d'intérêt sur la base de petites études exploratoires est fortement recommandé. En outre, l'utilisation des hôtes compétents immunitaires et des lignées de cellules syngéniques est d'une importance capitale pour la compréhension des interactions cellulaires hôte-tumeur. La souris nouvellement développé "tête rougeoyante" qui exprime eGFP et la luciférase de la glande hypophyse antérieure est un outil important pour éliminer les réponses de l' hôte à exogène eGFP et la luciférase, les protéines souvent utilisés pour marquer les lignes mammaires tumorales ⁷⁵ . L'utilisation de la souris et syngénique "tête rougeoyante" tagged cellules tumorales vont faciliter l'identification des cellules disséminées simples et foyers micrométastases par IHC sans le souci des réponses inflammatoires à eGFP ou la luciférase. De même, en choisissant soigneusement des stratégies de gestion de la douleur pour assurer anti-minimal ou de l'impact pro-tumorale du régime de traitement médicamenteux est fortement recommandé. Les étapes critiques dans ce protocole comprennent le maintien des conditions stériles à travers des interventions chirurgicales pour faire en sorte que l'infection ne se produit pas, car cela confondra aucun résultat. Il est également important que l'aiguille est correctement placé dans la veine porte pour s'assurer que les cellules tumorales sont délivrés au foie. Pratiquer le protocole avec des colorants tels que l'encre de Chine contribuera à cette question. La croissance tumorale au niveau du site d'incision de la peau est le meilleur indicateur que le placement de l'aiguille incorrecte a eu lieu. Enfin, il est essentiel que la perte de sang de la veine porte est contrôlée de manière adéquate et cesse entièrement avant suturing l'animal. L'utilisation de la gaze hémostatique diminue considérablement le risque de incontrôlée perte de sang de la veine porte après l'injection. Dans nos mains, la mortalité liée procédure due à une perte de sang depuis la veine porte après l'injection a été réduite de 30% à 2% des souris à l'aide de gaze hémostatique.

Il est important de noter que le modèle d'injection portale ne se réplique pas la cascade métastatique complète, mais il est limité à l'étude de l'extravasation des cellules tumorales, des interactions cellulaires tumorales niche suivant l'extravasation et la croissance tumorale. Les modèles qui reproduisent avec précision la cascade métastatique complète au foie, comme cela se produit chez les patients, sont nécessaires d'urgence. Une limitation supplémentaire du modèle d'injection portale est qu'elle est confondue par l'impact de la chirurgie sur l'hôte, la guérison des plaies connue à l' impact progression de la maladie ^76,77.

Le modèle d'injection de la veine représente une amélioration par rapport à l'autre injectionmodèles pour étudier les métastases du foie, y compris intracardiaque et des modèles intraspléniques. Plus précisément, le modèle d'injection portale permet l'étude d'une gamme plus étendue de la progression de la maladie que le modèle intracardiaque, qui est souvent limitée par des métastases concomitantes dans d'autres tissus. En outre, le modèle de la veine porte n'a pas été compliquée par ablation de la rate, comme cela se fait dans le modèle intrasplénique.

Le modèle d'injection de la veine peut se révéler un outil utile pour l'étude des métastases du foie en général. Métastases hépatiques est le site le plus fréquent de métastases dans les adénocarcinomes globale, avec des taux particulièrement élevés dans les cancers du pancréas (85% des métastases sont au foie), du côlon et des adénocarcinomes rectaux (> 70%), ainsi que l'estomac et l'œsophage (> 30 %) ^1. Bien que les modèles de tumeurs primaires spontanées et orthotopique d'adénocarcinomes pancréatiques et du côlon métastasent plus facilement au foie ^78,79, la veine modèle d'injection de portail peut fourne utile à la compréhension du processus métastatique de ces cancers que la livraison contrôlée de cellules tumorales permet des évaluations biochimiques, moléculaires et histologiques à des moments précis après l'arrivée des cellules tumorales. En résumé, le modèle d'injection de la veine porte représente une amélioration importante sur les modèles disponibles de métastases hépatiques de cancer du sein, et peut également être applicable au domaine des métastases du foie en général.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
anti-CD45 antibody	BD Pharmingen	550539	Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory			Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody	Abcam	ab53118	Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody	Vector Laboratories	BA0702	Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x 2 - 3			Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483	For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps			Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody	Dako	M7158	Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge	BD	324702	For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source			Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10%	Anatech Ltd.	135	Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit	PerkinElmer, Inc.	NEL794001KT	Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors			Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x	Corning	30-002-Cl	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline			Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite			Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue	Life Technologies	T10282	For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)	Gibco	25300-054	Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates