Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure

Résumé

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Résumé

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

réponse adaptative est cruciale pour la survie des bactéries. Afin de détecter et de réagir aux changements environnementaux, les bactéries utilisent un système stimulus-réponse connue sous le nom de signalisation à deux composants. ^1,2 Dans un système à deux composants typique, l'histidine kinase détecte un stimulus apparenté, autophosphoryle son résidu d'histidine conservé, puis transfère le phosphate à un résidu aspartate conservé sur le domaine de récepteur d'une protéine régulatrice de la réponse. ³ Cet événement déclenche un changement dans l'activité du régulateur de réponse, ce qui stimule un effet en aval. ^4,5 Ainsi, les bactéries sont capables de détecter et d' adaptation aux changements dans l'environnement local. Certains systèmes de signalisation à deux composants dévient de cet archétype. Dans certains cas, le domaine sensorielle de l'histidine kinase est une protéine autonome qui détecte directement l'entrée sensorielle et modifie l'activité de la kinase par l'intermédiaire d'une interaction protéine-protéine. ^6-8 Toutefois, le fondsprocessus amental et le rôle global du système reste le même. signalisation à deux composants est un système de stimulus-réponse ubiquitaire qui est essentielle pour la survie des bactéries et histidine kinases jouent un rôle critique dans la transduction du signal. ⁹

Malgré l'importance des histidine kinases à la biologie bactérienne, ils restent mal caractérisés. Ceci est dû à l'instabilité inhérente de phosphohistidine, et l'absence d'une méthode pratique pour la mesure de l'autophosphorylation. Phosphohistidine est plus labile que la phosphosérine, la phosphothréonine et la phosphotyrosine. ¹⁰ Ainsi, les techniques qui sont couramment utilisés pour analyser kinases Ser / Thr / Tyr ne sont pas applicables pour les kinases histidine. ¹¹ essais in vitro pour étudier histidine kinases ont été largement limitée à SDS-PAGE autoradiographie. ^12,13 Dans ce procédé, [γ- ³² P] -ATP est mis en incubation avec la kinase et la phosphorylation de la kinase est analysée par Polélectrophorèse sur gel de yacrylamide (PAGE) suivie par une autoradiographie du gel. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller l'autophosphorylation de kinase, ainsi que phosphotransfert de la kinase à un régulateur de réponse. Cependant, cette méthode présente des inconvénients notables. des analyses basées sur PAGE-sont bas débit et de temps. Ces limitations ne sont pas propices à la caractérisation d'une protéine et déterminer ses paramètres cinétiques. Une méthode alternative pour l'étude des histidine kinases qui a été publié récemment, utilise des anticorps pour détecter phosphohistidine autophosphorylation. ¹⁴ Bien que cette méthode a l'avantage de distinguer entre 1-phosphohistidine et 3-phosphohistidine, en fonction de l'instrumentation utilisée pour la détection, cette méthode ne peut pas offrir une large gamme dynamique ou limite supérieure de détection élevé. Ainsi, il existe un besoin pour un test plus rapide, moins pénible et plus sensibles qui peuvent être utilisés pour étudier ces protéines importantes.

Ici, nous décrivons et demonstrate soigneusement mis au point un essai de nitrocellulose de liaison qui peut être utilisé pour quantifier autophosphorylation de kinase histidine bactérienne purifiée in vitro. Ce test est un débit plus élevé et moins de temps que des analyses basées sur PAGE. Le procédé utilise également Cherenkov rayonnement pour phosphohistidine quantification, qui offre une limite supérieure de détection élevée et une grande plage dynamique. Le dosage peut être utilisé pour déterminer les paramètres cinétiques pour histidine kinases.

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Protocole

Attention: Ce protocole nécessite une formation appropriée dans l'utilisation et la manipulation de matières radioactives. S'il vous plaît utiliser l'équipement de protection individuelle nécessaire en effectuant ce test, y compris protection contre les rayonnements bêta. Les déchets radioactifs doivent être manipulés avec précaution, car de grandes quantités de déchets sont générés au cours de la phase de lavage de l'expérience. Assurez-vous que les déchets sont stockés dans un récipient en position verticale, comme un grand seau ou une bouteille qui ne sera pas facilement renversé ou renversé. Une fois que l'expérience est terminée, transférer soigneusement tous les déchets liquides marqués de manière appropriée les conteneurs de déchets radioactifs. Manipuler tous les matériaux avec soin, et de garder un compteur Geiger à proximité pour surveiller l'espace de travail pour la contamination.

NOTE: Ce protocole est une version révisée d'un essai précédemment de notre groupe. ¹⁵ phosphohistidine stabilité en H ₃ PO ₄ doit être testé pour toute histidine kinase non caractérisés avant d'utiliser cette méthode. Le phosphohistidine sttest d'aptitude a été décrit précédemment. ¹⁵ Un témoin négatif qui ne contient pas kinase doit être inclus. Ceci est nécessaire afin de soustraire le signal de fond de chaque échantillon, et veiller à ce que [γ- ³² P] -ATP est suffisamment lavé de la membrane.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Purifier histidine kinases de la culture bactérienne avant d'utiliser ce test.
   1. Purifier une histidine kinase (ID du gène 1189383) à partir de Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) pour le développement de ce test. Cloner la kinase dans le vecteur d'expression pET-23aHis-TEV utilisant Ndel et sites de restriction Xhol, et effectuer une mutagenèse dirigée pour obtenir le mutant construire Vp1876 D499A.
   2. Transformer le plasmide dans E. coli BL21 (DE3) pLysS, et cultiver des cellules dans les milieux de la tuberculose à 37 ° C. des cultures de supplément avec de l'ampicilline (100 pg / ml) et au chloramphenicol (34 ug / ml) et en agitant croître(250 rpm) jusqu'à une _DO600 de 0,6.
   3. Induire l'expression de la protéine avec de l'IPTG à une concentration finale de 25 uM, et faire croître les cultures pendant une nuit à 16 ° C. Récolte des cellules par centrifugation (5000 xg), lyse par sonication, et centrifuger pour éliminer les débris cellulaires (18.000 xg).
   4. Purifier la kinase marquée par His en utilisant Ni-NTA agarose. Confirmer la pureté par SDS-PAGE. Optimiser la purification pour chaque protéine, et de confirmer la pureté avant d'utiliser ce test.
2. Préparer le mM H ₃ PO ₄ solution 25 de lavage. À 1 litre d'eau déminéralisée distillée, ajouter H ₃ PO ₄ à une concentration finale de 25 mM. Le pH de cette solution est d'environ 2,0. Placer 25 mM H ₃ PO ₄ sur la glace.
3. Préparer une solution 13x mère de 325 mM H ₃ PO _4, à utiliser pour éteindre la réaction de kinase. Le pH de cette solution est d'environ 1,5. Placer 325 mM H ₃ PO ₄ sur la glace.
   NOTE: H ₃ PO ₄ À une concentration finale de 25 mM suffisamment étanche la réaction, et contribue également à bloquer le phosphate radiomarqué qui ne soit pas lié à l'histidine de se lier à la membrane de nitrocellulose.
4. Préparer une solution tampon de réaction du stock 4x contenant 160 mM Tris-HCl pH 8,0, KCl 600, 16 mM MgCl _2, et 40% de glycérol.
5. Quantifier la concentration d' histidine kinase de la protéine par des procédés établis de concentration (Bradford, UV-Vis, etc.). Préparer une solution à ^16,17 histidine kinase ayant une concentration qui est de 4 fois la concentration finale souhaitée. Pour obtenir un signal adéquat, la concentration finale en protéine dans la réaction devrait idéalement être d'au moins 5 um.
6. Préparer une radiomarqué 4x [γ- ³² P] -ATP solution avec la concentration de 4x appropriée d'ATP non marqué et marqué ratio non marqué pour l'expérience.
   NOTE: La quantité de [γ- ³² P] -ATP qui devrait être inclus dans ce mélange dépend de combien [^7; - ³² P] -ATP sera finalement repéré pour chaque réaction. Nous avons obtenu signal adéquat avec des concentrations finales comprises entre 0,1 à 5 uCi par réaction. Il est important que le marqué: le rapport de l'ATP non marqué est maintenu constant pour toutes les réactions dans une expérience donnée. Des dilutions en série doivent être effectuées lorsque les concentrations d'ATP multiples sont souhaitées, comme cela bien garder le étiqueté: rapport constant de l'ATP non marqué dans toutes les concentrations. Les concentrations finales de l'ATP sont généralement comprises entre 10 uM à au moins 1 mM, et chaque concentration doivent être dosés en triple pour obtenir des données cinétiques fiables.
7. 96- appareil bien dot blot
   1. Couper 8 cm x 12 cm morceau de membrane de nitrocellulose (taille des pores 0,2 um).
   2. La position de la nitrocellulose dans un appareil de transfert en point, en veillant à ce que la membrane correspond de telle sorte que l'appareil est fermé, et tous les puits sont complètement recouverte par la membrane. Si le montage est correct, il devrait y avoir aucune fuite d'air lorsque le vide est applied.
   3. Pour recueillir le filtrat, connectez l'appareil à un ballon côté-bras secondaire. À partir de la tige de valve, raccorder un tube adéquat de sorte que l'appareil peut être facilement utilisé sans faire basculer le flacon secondaire.
   4. Connecter le secondaire flacon bras latéral à la source aspiration / dépression.
   5. Vérifier que le dispositif est complètement scellé par application d'un vide à l'appareil. Si l'appareil est correctement assemblé, un vide fort sera présent dans tous les puits. Toutes les connexions de tubes peuvent être enveloppés dans Parafilm ou SARAN pour assurer un joint étanche.
   6. Le cas échéant, pour tester le vide, la pipette 100 ul de tampon de réaction dans un puits. Le vide doit être assez fort pour tirer tout le liquide à travers le puits et sur la membrane.
   7. Éteignez vide jusqu'à ce que tous les échantillons sont prêts à être repéré sur la membrane.

2. Réaction Initiation et Trempe

1. Le mélange des composants de la réaction
   1. Avant initiation, préparer tous les quatre composants de la réaction sous forme de solutions de stock 4x: tampon de réaction (voir section 1.4), l' histidine kinase (1,5), [γ- ³² P] -ATP (1.6), et ddH ₂ O.
   2. Mélanger des volumes égaux de tampon de réaction, de l' histidine kinase, et ddH ₂ O. Laisser ces composants de réaction pour équilibrer à la température ambiante pendant une courte durée (10 minutes).
      Remarque: Le volume final de la réaction dépend du fait que l'expérience est dépendante du temps, une enzyme dépendante, ou d'un substrat dépendant. réactions dépendantes du temps doivent être plus grands, comme plusieurs aliquotes sont prises à partir de la même réaction et trempés au point de temps désiré. Le volume réactionnel dépendra du nombre de points temporels désirés. L'essai est optimisé pour chaque tache sur la membrane de nitrocellulose pour contenir 30 ul de la réaction. Ainsi, si 10 points de temps sont souhaités, le volume de réaction doit être d'au moins 300 pi (volume plus élevé tel que 330 ul serait préférable dans le cas d'éventuelles erreurs de pipetage).Enzymes et des expériences de substrat dépendant nécessitent des volumes réactionnels plus petits. Le volume de réaction pour ces expériences peuvent être aussi petites que 30 pi, comme cela est le volume final qui sera repéré sur la membrane de nitrocellulose.
   3. Pour amorcer la réaction, ajouter un volume de solution [γ- ³² P] -ATP à la réaction et mélanger par pipetage de haut en bas. Suivre le temps de réaction écoulé avec une minuterie et laisser la réaction se dérouler pendant le temps désiré.
   4. Pour étancher la réaction, on ajoute 1/13 du volume réactionnel total de glacé 325 mM de H ₃ PO ₄ à la réaction et mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas. En variante, ajouter une aliquote de la réaction à 325 mM de H ₃ PO _4.
      NOTE: La concentration finale de H ₃ PO ₄ devrait être de 25 mM pour étancher suffisamment la réaction. Par exemple, ajouter 2,5 ul de 325 mM de H ₃ PO ₄ à 30 ul de réaction ou d' ajouter 30 uL réaction à 2,5 mM , 325 ul de H ₃ PO 4. Le pH final de la réaction est d'environ 4,0. Cette concentration de H ₃ PO ₄ a été testé et confirmé pour arrêter la réaction de kinase dans ce tampon sans dégrader phosphohistidine.
      1. Par exemple, mélanger 7,5 pi 4x tampon de réaction, 7,5 pi 4x histidine kinase, et 7,5 ul ddH ₂ O. Initier réaction avec 7,5 pl [γ- ³² P] -ATP. Stopper la réaction avec 2,5 ul de 325 mM de H ₃ PO _4.
   5. Placer immédiatement les réactions trempées sur la glace jusqu'à ce que toutes les réactions ont été terminées.
      NOTE: Afin de maximiser l'efficacité, il est conseillé d'initier une réaction toutes les 15 ou 20 s jusqu'à ce que toutes les réactions sont initiées, et une fois le temps de réaction désiré est passé, étancher une réaction toutes les 15 ou 20 s jusqu'à ce que tous sont trempés. Pour ceux qui utilisent le test pour la première fois, un intervalle plus long peut être plus facile à gérer.

3. Spotting oRéactions f Désaltérée sur nitrocellulose

1. Démarrez vide sur 96 puits appareil de dot blot
   1. Placez l'appareil dot 96 puits pré-assemblé blot (section 1.7) dans un récipient secondaire. Ce récipient doit être suffisamment grand pour que l'appareil se démonte facilement en, car l'appareil et de la membrane seront radioactifs après leur utilisation.
   2. Appliquer le vide à l'appareil de transfert en point à 96 puits.
   3. Une fois que l'appareil est sous vide, pipeter avec soin la réaction trempée directement sur la membrane de nitrocellulose dans chaque puits. Répétez jusqu'à ce que toutes les réactions sont chargées sur la membrane. Étant donné que la capacité de liaison de nitrocellulose (75-110 ug / ^cm2) est supérieure à la quantité d'histidine kinase qui est repéré, on peut supposer que la quasi - totalité de la kinase se lie à la membrane lorsqu'elle est chargée correctement.
      REMARQUE: Selon l'appareil utilisé, il faut prendre soin de ne pas percer la nitrocellulose. Observer que la totalité de la réaction a pris contact avec ee nitrocellulose. Il est facile pour une partie ou la totalité de la réaction de coller aux parois du puits, et ne pas atteindre la nitrocellulose.
   4. Laver les puits avec 100 pi de glace-froid 25 mM H ₃ PO _4. Ceci permettra à un volume de réaction qui peut avoir été piégé dans le puits pour atteindre la membrane, assurant le chargement complet de toutes les réactions. Permettre à tout le volume de circuler à travers la membrane.
2. Appareil de démontage et de transfert de membrane de nitrocellulose
   1. Démontez soigneusement l'appareil avant de couper le vide. Noter que tant l'appareil et de la membrane de nitrocellulose sont radioactifs à ce moment. Ne retirez pas les composants de l'appareil à partir du conteneur secondaire en ce moment.
   2. Avec une pince, transférer soigneusement la membrane de nitrocellulose de l'appareil à un récipient d'environ 200 ml de 25 mM refroidi à la glace H ₃ PO _4. Placez un couvercle sur ce récipient, comme le lavage sera radioactive. A ce moment, le vide peut être coupée.

4. nitrocellulose Processing

1. nitrocellulose laver
   1. Placer le récipient avec la membrane de lavage sur une bascule. Laisser la membrane de basculer doucement pendant 20 min.
   2. Après 20 minutes, décanter avec précaution la solution de lavage utilisée dans un grand seau à utiliser pour le stockage temporaire des déchets. Ajouter 200 ml de glace-froid 25 mM H ₃ PO ₄ à la membrane et répéter.
      REMARQUE: Au moins trois 20 lavages min sont nécessaires pour éliminer fond [γ- ³² P] -ATP signal de la membrane. Après le troisième lavage, tester la solution de lavage utilisée pour le rayonnement avec un compteur Geiger. Continuer le lavage de la membrane comme décrit ci-dessus jusqu'à ce qu'aucun signal est présent dans la solution de lavage.
2. séchage de nitrocellulose
   1. Après la membrane est suffisamment lavé, permettre à la membrane à l'air brièvement sec. Cela prend généralement 5 min ou moins.

5. Exposition à l'écran Storage Phosphor

Remarque: Cette section est facultative. Exposer la membrane à un écran de phosphore est bénéfique en ce qu'elle permet la visualisation de l'intensité de la kinase radiomarqué dans chaque tache sur la membrane. L'intensité relative de ces points est directement proportionnelle à la quantité d'histidine kinase phosphorylée dans chaque champ. L'intensité peut être quantifiée avec le logiciel de traitement d'image, et ces résultats peuvent être comparés à ceux générés par l'article 7. En outre, cette étape permet un contrôle de la qualité. Anomalies vu dans cette analyse pourrait expliquer les résultats irréguliers obtenus à partir de comptage à scintillation.

1. préparation de l'écran phosphorescent
   1. Avant d'exposer la membrane à l'écran luminophore de stockage, exposer l'écran de substance fluorescente à la lumière blanche pendant au moins 5 min. Cela garantit que toute image résiduelle qui peut être détenu par l'écran est effacé.
   2. Assurez-vous que l'écran est propreet sec. Si nécessaire, nettoyer délicatement l'écran avec une solution de nettoyage de l'écran de phosphore approuvé par le fabricant de l'écran, et essuyez.
2. Préparation de membrane en nitrocellulose
   1. envelopper soigneusement la membrane de nitrocellulose sèche dans une pellicule de plastique mince pour empêcher l'humidité résiduelle d'endommager l'écran luminescent. Vérifiez qu'il n'y a pas de rides ou des bulles.
3. L'exposition à écran luminescent
   1. Placez la membrane de nitrocellulose enveloppé dans la cassette d'écran luminescent de stockage, placez l'écran face vers le bas sur la membrane, et fermer la cassette. Ne pas ouvrir la cassette ou de déplacer la membrane jusqu'à ce qu'il soit temps de balayer l'écran luminescent, comme déplacement de la membrane lors de l'exposition entraînera une double image ou tachées d'être capturé.
   2. Exposer pendant au moins 4 h, ou aussi longtemps que le fabricant de l'écran luminescent suggère.
   3. Une fois l'exposition terminée, balayer l'écran de phosphore et de capturer l'image avec un scanner de phosphore.

6. Préparer membrane de nitrocellulose pour Scintillation Counting

1. Ponceau S coloration et décoloration
   1. immerger brièvement la membrane de nitrocellulose dans une solution de coloration de Ponceau (0,1% de Ponceau S (p / v) dans 5% d'acide acétique) pendant 1 - 2 min. Mouiller la totalité de la membrane avec la tache avant décoloration.
   2. Décanter excès Ponceau S de la membrane.
   3. Rincer la membrane avec ddH ₂ O jusqu'à ce que seuls les spots de l'histidine kinase sont colorées. Notez que cette procédure ne fonctionnera que si tous les points contiennent des quantités détectables de protéine.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour confirmer que la kinase est lié à la nitrocellulose, et que la protéine de chargement est encore dans toutes les taches. Elle permet aussi la kinase repérée à découper facilement à partir de la membrane.
2. Découper taches
   1. Avec des ciseaux, découper chaque tache sur la membrane de nitrocellulose. Il est pas nécessaire de couper parfaitement along le bord de la tache taché; si la membrane a été lavée suffisamment fond dû à la taille variable des taches découpées sera négligeable. Il est seulement important de découper l'ensemble de tache pour chaque réaction.
   2. En utilisant des pinces, transférer soigneusement chaque tache dans des flacons de scintillation. Aucun cocktail de scintillation est nécessaire que le ³² P est facilement détectable par le rayonnement Tcherenkov.
      NOTE: Sinon, l'endroit peut être coupé à l'aide d'un perce-bouchon aiguisé. Retirer chaque spot de la nitrocellulose avec le perce-bouchon, et le pousser dans un flacon de scintillation avec une épingle. Avec ce procédé, la membrane n'a pas besoin d'être touché, ce qui réduit davantage l'exposition aux rayonnements.
3. Détermination de CPM / pmol de [γ- ³² P] -ATP solution
   1. Spot plusieurs dilutions de [γ- ³² P] -ATP solution (section 1.5) sur 1 cm x 1 cm carrés de nitrocellulose. En bref air sec.
   2. En utilisant des pinces, transférer soigneusement chaque carré en scintillationflacons. Aucun cocktail de scintillation est nécessaire. Ces échantillons seront utilisés pour générer une courbe standard pour déterminer le CPM / pmol de la solution d'ATP.

7. Scintillation Counting

1. Chargez tous les flacons de scintillation en scintillation contre cassettes. cassettes de charge dans un compteur à scintillation.
2. Exécutez le programme de comptage de scintillation pour mesurer CPM pour chaque flacon. Ces données, ainsi que le CPM / pmol du mélange ATP radiomarqué (de la section 6.3), peuvent être utilisés pour calculer la quantité de phosphorylée histidine kinase présent dans chaque point, et donc le taux d'autophosphorylation. ^18,19

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Résultats

Un ensemble de données représentatives a été généré avec une image capturée avec un imageur de phosphore (figure 1), Ponceau S tache de la membrane de nitrocellulose (Figure 2), et les données de comptage de scintillations (figure 3). La figure 3A montre les constantes cinétiques enzymatiques dans une parcelle Lineweaver-Burk. Ces résultats ont été obtenus en utilisant une histidine kinase purifiée à...

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Discussion

L'essai de liaison nitrocellulose nous avons décrit présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes précédemment utilisées pour caractériser histidine kinases. En comparaison avec SDS / autoradiographie traditionnel basé PAGE, notre méthode est un débit plus élevé et moins de temps. La membrane de nitrocellulose est plus facile à manipuler que des gels de SDS, et n'a pas besoin d'être réparé. Coloration Ponceau la nitrocellulose permet aux taches protéiques à visualiser. Cela fourni...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose