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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Résumé

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

réponse adaptative est cruciale pour la survie des bactéries. Afin de détecter et de réagir aux changements environnementaux, les bactéries utilisent un système stimulus-réponse connue sous le nom de signalisation à deux composants. 1,2 Dans un système à deux composants typique, l'histidine kinase détecte un stimulus apparenté, autophosphoryle son résidu d'histidine conservé, puis transfère le phosphate à un résidu aspartate conservé sur le domaine de récepteur d'une protéine régulatrice de la réponse. 3 Cet événement déclenche un changement dans l'activité du régulateur de réponse, ce qui stimule un effet en aval. 4,5....

Protocole

Attention: Ce protocole nécessite une formation appropriée dans l'utilisation et la manipulation de matières radioactives. S'il vous plaît utiliser l'équipement de protection individuelle nécessaire en effectuant ce test, y compris protection contre les rayonnements bêta. Les déchets radioactifs doivent être manipulés avec précaution, car de grandes quantités de déchets sont générés au cours de la phase de lavage de l'expérience. Assurez-vous que les déchets sont stockés dans un récipient en position verticale, comme un grand seau ou une bouteille qui ne sera pas facilement renversé ou renversé. Une fois que l'expérience est terminée, transférer soigneusement tous les....

Résultats

Un ensemble de données représentatives a été généré avec une image capturée avec un imageur de phosphore (figure 1), Ponceau S tache de la membrane de nitrocellulose (Figure 2), et les données de comptage de scintillations (figure 3). La figure 3A montre les constantes cinétiques enzymatiques dans une parcelle Lineweaver-Burk. Ces résultats ont été obtenus en utilisant une histidine kinase purifiée à.......

Discussion

L'essai de liaison nitrocellulose nous avons décrit présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes précédemment utilisées pour caractériser histidine kinases. En comparaison avec SDS / autoradiographie traditionnel basé PAGE, notre méthode est un débit plus élevé et moins de temps. La membrane de nitrocellulose est plus facile à manipuler que des gels de SDS, et n'a pas besoin d'être réparé. Coloration Ponceau la nitrocellulose permet aux taches protéiques à visualiser. Cela fourni.......

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le ministère de l'éducation par l'aide d'études supérieures en zones de programme national de Need (P200A100044).

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphoric acidVWRAAAA18067-APFor quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris baseRPIT60040-5000.0Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chlorideRPIP41000-2500.0For kinase reaction buffer
Magnesium chlorideRPIM24000-500.0For kinase reaction buffer
GlycerolRPIG22020-4000.0For kinase reaction buffer
5'-ATPPromegaE6011Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATPPerkin ElmerNEG002Z250UC 6000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatusBio-rad1706545For spotting reactions
NitrocelluloseWhatman32-10401396-PKFor spotting reactions
Ponceau SSigma aldrichP3504-50GFor staining nitrocellulose

Références

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opi....

Réimpressions et Autorisations

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