Examen des phénotypes d&#39;accueil en<em&gt; affinis de Gambusia</em&gt; Après le traitement aux antibiotiques

Résumé

Cette étude porte sur les méthodes d'effets sur un hôte modèle de poissons suivants altération des communautés microbiome composition de la peau et de l'intestin par un antibiotique révéler.

Résumé

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

Il a été établi que les antibiotiques peuvent perturber le microbiome humain conduisant à dysbiose, ce qui signifie un déséquilibre de la communauté microbienne. La modification de la composition du microbiote après des traitements antibiotiques a été montré pour réduire la diversité de la communauté, de réduire les principaux membres, et modifier le métabolisme de la communauté, en particulier dans l'intestin ^{1, 2.} Perturbation antibiotique du microbiome intestinal peut réduire la résistance à la colonisation à Clostridium difficile ^{3, 4} et ⁵ Salmonella.

En outre, la perturbation de la flore microbienne a été liée au développement de nombreux syndromes et de maladies chez les humains (par exemple, associée aux antibiotiques entérocolite, d'une maladie intestinale inflammatoire, des troubles métaboliques, etc.). Les antibiotiques sont également largement mises en œuvre dans l'agriculture en tant que promoteurs de croissance dansbétail et de la volaille ^6. L'utilisation de ces outils puissants ne sont pas sans effets collatéraux, ce qui est évident dans l'augmentation rapide de la résistance aux antibiotiques, ainsi que les effets d'un microbiome perturbé a avec son hôte habité. De nombreuses études ont montré que large spectre l'utilisation des antibiotiques a de longues conséquences durables sur la structure et la fonction du microbiote, mais les effets secondaires à partir d'un microbiome impact sur la physiologie de l'hôte de l'antibiotique perturbé sont que des spéculations qui doivent encore être pris en charge.

L'interaction entre l'hôte, le microbiote, et des antibiotiques est loin d'être compris de manière concise. Par conséquent, un modèle simple et plus traitable est avantageux de faire la lumière sur le système très complexe de mammifère. surfaces muqueuses chez l'homme, y compris l'intestin, abritent la plus forte densité et la diversité des microbes, et aussi des interactions microbes hôtes les plus intimes. Le microbiome de la peau de la muqueuse des offres de poissons slusieurs avantages en tant que système modèle. Le Teleostei (poissons osseux) est l' une des premières lignées à diverger au sens Vertébrés que téléostéens ont à la fois inné et acquis des systèmes immunitaires qui ont évolué conjointement une relation avec les communautés bactériennes commensales ^7. Part de la peau de poisson de nombreuses caractéristiques avec des surfaces de type 1 muqueuses de mammifères, telles que les fonctions physiologiques, les composants de l' immunité et l' arrangement des cellules productrices de mucus ^8. L'emplacement de la surface extérieure de la muqueuse du poisson de la peau offre une microbiome facile à manipuler expérimentalement et l'échantillon.

Le Western mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), est un poisson modèle qui a été utilisé dans le passé pour l' étude de la toxicologie et l' accouplement ^{9, 10, 11.} Compte tenu de la petite taille, l'abondance de la population dans la nature comme une espèce envahissante, m coût des soins inimal et nature robuste, nous avons développé G. affinis comme un modèle de microbiome muqueuse. En outre, Gambusia partager la physiologie de donner naissance à des jeunes avec les mammifères vivipares, ce qui est rare chez les espèces de poissons. Nous avons terminé l'étude la plus vaste au moment de la peau de poisson microbiote normale en utilisant 16S profilage avec Gambusia ^12. D' autres travaux a démontré trois effets négatifs sur l'hôte après la rupture de la peau et le microbiote intestinal au moyen d' un antibiotique à large spectre ^13.

Cinq différents effets ont été examinés dans le poisson après l'exposition aux antibiotiques. L'avantage de l'hôte le mieux établi du microbiome est l'exclusion compétitive des agents pathogènes. Le poisson pathogène Edwardsiella ictaluri est connu pour provoquer des flambées de entérosepticémie dans les élevages de poissons - chats commerciaux ^14. E. ictaluri a également été démontré pour infecter lethally poisson zèbreclass = "xref"> ^{15, 16} et ¹⁷ Gambusia. Un défi avec cet agent pathogène à partir de la colonne d'eau peut servir comme une mesure d'exclusion. A titre de comparaison à la sensibilité à un agent pathogène particulier, la survie au cours de l'exposition à une forte densité d'organismes mixtes a également été réalisée. Fèces et les sols riches en matière organique ont été utilisés comme sources couramment rencontrés des communautés microbiennes.

Un autre rôle établi la communauté intestinale bactérienne effectue est le traitement des nutriments et de l'énergie récolte, affectant ainsi l'absorption nutritionnelle globale pour l'hôte. Comme une mesure brute de la nutrition, le poids corporel du poisson a été comparée avant et après un mois d'être nourris avec un régime standard. poissons traités aux antibiotiques en moyenne ont perdu du poids alors que les poissons de contrôle, en moyenne, ont pris du poids au cours du mois. Le mécanisme de ce manque de gain de poids est difficile. Un possible facteur est le temps de transit des aliments dans l'intestin. A moti GIméthode lité a été adapté de zebrafish (Adam Rich, SUNY Brockport, communication personnelle) pour déterminer le temps de transit. Il n'a pas encore été déterminé si les poissons traités aux antibiotiques ont un temps de transit modifié.

Un défi commun connu dans le milieu naturel par tous les organismes, en particulier le poisson, est un stress osmotique. Gambusia ont été montré pour adapter rapidement lorsque aiguë a souligné à de fortes concentrations de salinité ^18. Étonnamment, le poisson avec un microbiome antibiotique modifié exposé réduit la survie à une contrainte élevée en sel. Le mécanisme de ce nouveau phénotype est sous enquête. Une autre contrainte commune sur les animaux aquatiques, en particulier dans les aquariums, est des formes toxiques d'azote (ammoniac, nitrate et nitrite). Survival contre nitrate n'a pas été significativement différente entre les poissons traités aux antibiotiques et le contrôle. Les méthodes présentées dans ce manuscrit peuvent être utilisés avec Gambusia ou modèle de poisson similaire organismes, tels que le zèbrepoissons et medaka, pour mesurer phénotypes dans les poissons suivants manipulation expérimentale.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous l'approbation des protocoles IACUC, numérotés 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 et 14-04-17-1018-3-01.

1. Collection animale, manutention et d'entretien éthique

1. Recueillir Gambusia affinis à partir du site de champ (guide d'identification à http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) en utilisant une petite épuisette et lieu en 19 L seaux. Utilisez inspection visuelle pour identifier les espèces.
2. poissons de repos pour 1 - 2 d dans un seau avec de l'eau de l'étang. Ensuite, transférer le poisson dans 76 ou 189 réservoirs L aquarium remplis d'eau / eau du robinet de la moitié de la moitié de l'étang à 25 ° C, aérées avec un airstone bouillonnant. Utilisez un petit filet d'immersion lors de la manipulation du poisson à perturber au minimum leur microbiome peau.
   NOTE: la densité de poisson ne devrait pas être supérieure à 20 poissons / 38 L d'eau de l'aquarium. Les poissons sont acclimatés à l'aquarium pendant au moins 5 d avant l'expérimentation.
3. Nourris des poissons sur un régime quotidien avec 5 mg de nourriture en flocons par poisson. Hopoissons ld avec un / 12 h cycle d'obscurité 12 h de lumière.

2. Exposition aux antibiotiques initiale pour toutes les expériences

1. Dessin tous les poissons de chaque expérience de la même aquarium, placez en deux groupes distincts (traités: exposés à des antibiotiques et de contrôle: non exposée) dans 19 L seaux. Les données antérieures recueillies montre que les poissons dans le même aquarium ont homogénéisés microbiomes de la peau qui ont peu de variation dans la composition des communautés. ¹²
2. Au cours d' expériences, garder les poissons dans 2 litres d'eau de l' étang artificiel (APW; 0,33 g / L de _CaCl2, 0,33 g / L MgSO _4, 0,19 g / L de NaHCO ₃₎ qui est stérilisé par autoclavage avant utilisation.
3. Préparer la solution mère antibiotique rifampicine en ajoutant 50 mg / ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). La rifampicine est un antibiotique à large spectre représentatif qui est non toxique pour les poissons. Chez les humains et les souris, il est bien distribuée dans les tissus.
4. De stock rifampicine administrer une finaleconcentration de 25 ug / ml dans 2 litres d'APW pour l'exposition aux antibiotiques du groupe de poissons traités pendant 3 jours. Notez que, après 3 d, le nombre de bactéries de la peau cultivable retour similaire à celui de la peau de poisson prétraité.
5. En parallèle, garder un groupe de poissons non traitée et de donner APW une quantité équivalente de DMSO (0,5 ml par litre de APW) dans la colonne d'eau pour agir en tant que groupe de contrôle.
6. Que des expériences ont pour but de mesurer les effets d'un microbiome antibiotique modifié sur des phénotypes de poissons, afin d'éviter des effets directement à partir de l'antibiotique lui-même, suite à l'exposition de trois jours d'antibiotiques (ou témoin) période, les poissons de transfert dans un seau avec 2 litres d' APW frais.
   1. Utilisez une période de repos de 10 h alors l'antibiotique est éliminé par les corps des poissons. Base de ce temps d'élimination des expériences où les poissons ont été exposées à 25 ug / ml d'antibiotique pendant trois jours. Euthanasier les poissons en coupant la moelle épinière suivie par décérébration, puis homogénéiser l'ensemble du corps en utilisant un broyeur de tissus.
   2. Déterminer la présence d'antibiotiques en plaçant 50 pi de cette suspension après 0,2 um filtrage dans le centre d'une boîte de Pétri agar. Faire un trou pour cette suspension en appuyant sur une tête en bas pointe de pipette 200 ul stérile dans l'agar-agar, qui enlève un petit bouchon.
   3. Utiliser des plaques de gélose avec 20 ml volume mesuré de gélose nutritive, et répartir uniformément à l' aide d' un coton - tige avec un organisme indicateur, Bacillus subtilis, qui est sensible à la rifampicine. Obtenir B. subtilis à partir d' une gélose nutritive en incubation à 25 ° CO / N et à l' aide du tampon de coton pour obtenir une colonie. L'observation d'une zone d'inhibition après une nuit d'incubation à 25 ° C indique la présence d'antibiotiques dans les tissus du poisson.

3. microbiome Extraction

1. Extraire un échantillon de microbiome peau de l'épiderme externe de la muqueuse en plaçant le poisson dans un tube conique de 15 ml stérile remplie de 2 ml de PBST stérile (137 mM de NaCl, phosphate 10 mM, 0,1% de Tween 20, pH 7,4) solution et tourbillonnement à un réglage de 10 pendant 1 min avec les incréments de 10 Suspension de. Détergent et le sel dans le tampon favorise même la dispersion des bactéries dans la solution. Des résultats comparables ont été trouvés avec 0,85% de solution saline, mais réduit le nombre de bactéries avec de l'eau pure.
2. Transférez le poisson du tube conique à un seau de récupération. Létalité d'extraction de la peau est généralement inférieure à 10%. Soit, analyser la suspension bactérienne dans le tube immédiatement après extraction ou sédimenter les bactéries par un spin 2 min dans une centrifugeuse à température ambiante à 15.000 xg et conserver à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
   NOTE: Toute la culture et des analyses biochimiques sont immédiats; L'ADN ou l'extraction des protéines à partir d'échantillons peuvent être congelés.
3. Pour obtenir un échantillon gut microbiome, d' abord placer le poisson dans une boîte de Pétri stérile. Euthanasier le poisson en sectionnant la moelle épinière cervicale directement derrière la tête avec des ciseaux chirurgicaux, suivi par décérébration, Puis désinfectez à l'extérieur du corps avec 70% d'éthanol lingettes.
4. Après dissection, retirer l'ensemble de l'intestin en coupant après l'oesophage et avant l'anus.
5. Couper le tube digestif en petites sections 1 - 2 mm de longueur et placer toutes les sections en solution PBST mL deux dans un tube conique. Après tourbillonnement pendant 1 min, retirer le surnageant dans un autre tube propre (prendre des précautions pour ne pas établir les sections de l'intestin).
   NOTE: Le surnageant contient des bactéries intestinales extraites qui peuvent soit être utilisés pour les analyses directes ou agglomérées par la méthode précédente mentionné pour des échantillons de peau.

4. Infection Modèle Préparation et bain d'un Pathogen spécifique

1. Obtenir une souche infectieuse de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) et maintenir la culture stockée à -80 ° C. Strain 93-146 utilisée dans cette étude, isolé à partir d'un poisson-chat infecté, a été obtenu à partir de Mark Lawrence, Collège de médecine vétérinaire, Mississippi State University.
2. Streak E. Stock ictaluri sur un sélectif et différentiel des médias appelés médias E. multilocularis (EIM) agar ¹⁹ à la culture des bactéries et incuber pendant 2 jours à 27 ° C.
3. Transférer une colonie isolée pure à partir de la culture et inoculer une fiole de 150 ml contenant 40 ml de bouillon nutritif (NB; 5 g / l de peptone, 4 g / L d'extrait de boeuf). Placer ballon dans un agitateur réglé à 150 tours par minute pendant 2 jours à 27 ° C.
4. Après incubation, on dilue un échantillon de la culture dans du PBST à une lecture de spectrométrie de 0,2 DO à 650 nm pour calibrer la culture de E. ictaluri infectieux pour les volumes souhaités de doses.
5. Suivant le transfert à la fois traités (après 3 jours d'exposition aux antibiotiques) et des groupes de poissons non traités dans des gobelets en plastique individuels contenant 130 ml d'eau douce de l'étang artificiel, ou APW pour environ 10 h pour la clairance du médicament à partir de tissus de poissons.
6. Puis les deux groupes, transférer à nouveau chaque poisson dans 8 onces gobelets en plastique contenant 130 ml d'APW propre.
7. Donner à chaque poisson une dose létale contenant 2,8 x 10 ⁶ UFC / ml de E. culture ictaluri dans le APW (modèle d'infection de bain) et conserver dans un incubateur à 27 ° pendant 24 h.
8. Après le bain ictaluri E., transférer les poissons individuellement dans de nouvelles tasses avec 130 ml d'APW.
9. Après le remplacement de l'eau, la mortalité des poissons record sur la durée d'une semaine. Les poissons ne sont pas nourris au cours de cette période. Contrairement au poisson - chat, Gambusia ne montrent aucun signe extérieur de l' infection, il est donc essentiel d'utiliser la létalité comme critère d'évaluation expérimentale.

5. polymicrobienne Défi avec fèces et sol

1. Traitement Feces
   1. Obtenir des excréments humains frais d'un sujet volontaire sain qui n'a pas reçu d'antibiotiques au cours des deux semaines précédentes, en utilisant des gants stériles et un ml tube stérile 50 conique.
   2. Lors de l'enlèvement, de recueillir les matières fécales dans un sac en plastique stérile, puis transférer dans un stérile 15 mL cTube onical. Créer une concentration des stocks en suspendant les matières fécales dans le PBST pour donner une solution mère de 5-800 mg / mL. Ce mélange épais est préférable de transférer en utilisant 1 ml ou plus grand embout de pipette en plastique qui a été coupé au fond avec des ciseaux stériles de sorte que l'ouverture est plus grande.
   3. Après l'exposition aux antibiotiques initiale des groupes de poissons traités et non traités contrôler, séparer en gobelets en plastique individuels contenant la suspension fécale à des concentrations finales de soit 15 mg / ml ou 10 mg / mL en APW avec un volume total de 130 mL. Tenez tasses dans un incubateur à 25 ° C.
   4. la mortalité des poissons d'enregistrement lors de l'exposition fécale par l'observation à proximité de plus de 2 d.
2. Traitement des sols
   1. Collecter 1 - 2 kg de la couche arable riche organique (doit contenir la plus forte densité et la diversité des microbes) environ 7-15 cm de profondeur en profondeur et placer dans un récipient en plastique propre. Notez que le sol doit être utilisé dans les deux jours qui suivent la collecte.
   2. Terriblecte après la période d'exposition initial, séparer les deux groupes d'antibiotiques traités et les poissons non traités dans des gobelets en plastique individuels contenant 18,2 g de sol dans 130 ml d'APW. Mélanger le sol dans le puits d'eau à la main avant d'ajouter le poisson. La plupart des particules ne suspendent pas et rester au fond de la tasse.
   3. Exposer les poissons pour une durée de 3 jours à 25 ° C et consigner toute mortalité.

6. osmotique Défi du stress

1. Après le traitement suivi d'un 10 h période de repos tel que décrit ci-dessus, individualiser les poissons dans des tasses séparées contenant NaCl à 17,5 mg / ml (300 mM) dans 150 ml d'APW. Cela représente la moitié de la salinité typique de l'eau de mer, ce qui est totalement létale (<50%) pour contrôler les poissons, mais est fortement stressant, nécessitant osmorégulation efficace.
2. Observer la mortalité des poissons sur une durée de 36 h.

7. Nitrate Toxicité Défi

1. poissons de repos pour une période de 10 h après expos antibiotiquesure, et les poissons puis séparés dans des coupes individuelles contenant une concentration en nitrate de sodium soit 10 mg / ml (118 mM) ou 17,5 mg / ml (206 mM) dans 130 ml d'APW.
2. Fiche de mortalité de plus de 4 d pour une faible dose et 1 d pour une grande dose.

8. Analyse des poissons Individualisé ou Regroupées croissance

1. l'exposition ou le contrôle antibiotique complet période en tant que groupes dans des seaux 3 d.
2. Pour l' individu, remplissez 8-oz styromousse avec 150 ml chaque APW, transférer un poisson dans la tasse et enregistrer le poids corporel total pour l' évaluation initiale.
   1. Répétez l'opération pour tous les poissons dans les deux groupes traités et non traités. Utilisez blanc verres de styromousse au lieu de tasses en plastique transparent parce que le poisson ne sera pas manger quand dans les coupes claires.
3. Nourris des poissons par jour avec le régime standard de deux pastilles par poisson. Les culots ont été utilisés plutôt que des flocons car les pellets ont une faible variance de masse individuelle (3,53 ± 0,42 mg chacun, ou 8% de variation), resulting dans les poissons recevant des quantités similaires de nourriture. Surveiller la consommation en enregistrant visuellement granulés non consommés. Les taux de consommation étaient généralement supérieurs à 80%.
4. A la fin de chaque semaine pendant 4 semaines, déterminer le poids du poisson. Préparer une nouvelle coupe avec des produits frais APW, placer sur une balance, puis enregistrer le poids. Ensuite, versez un poisson dans un filet d'immersion de la coupe originale et transférer dans la nouvelle coupe, qui est ensuite pesé à nouveau. Les poissons ne sont pas traitées pour éviter le stress.
5. Pour les groupes, placer 2 L d'APW en 19 L seau et tarer la balance. Gardez le poisson ainsi que dans les deux groupes lors du transfert dans de nouveaux godets APW puis enregistrer le poids total du groupe. Enregistrez le poids du groupe de poisson chaque semaine plus d'un mois laps de temps en transférant à un nouveau seau.

9. Gut Temps de transit

1. Utilisez fluorescéine 70 kDa dextran anionique. Dextran est pas significativement digéré, et est trop grand pour être absorbé à travers la couche de l'intestin, ce passage permettra de mesurer le temps de transit dans l'intestin.dextran marqué a été incorporé dans les aliments pour poissons.
2. Dans un 1,7 ml tube stérile, ajouter 360 pi d'eau déminéralisée stérile et 52 mg de gélatine (solution 13%), et placer le tube sur un C bloc 60 ° de chaleur jusqu'à ce que le fond de gélatine et est entièrement dissous.
   1. Grind flocons alimentaires des poissons rouges à une poudre fine en utilisant un mortier et un pilon, et ajouter 40 mg de cette poudre dans le tube, avec 20 pi d'huile de poisson. Après le mélange, ajouter 1,6 mg de FITC-dextran.
3. Répartir le mélange liquide chaud dans 20 pi tombe sur Parafilm sur le banc de laboratoire, et laissez-les refroidir rapidement et se solidifier. Des gouttes peuvent être stockés jusqu'à 4 d avant qu'ils ne deviennent trop dur pour les poissons à manger. Magasin tombe dans le réfrigérateur en plaçant le Parafilm sur la moitié d'une boîte de Pétri, qui est ensuite flottait sur l'eau stérile dans un récipient en plastique scellé, ce qui maintient les gouttes humidifiés.
4. Juste avant l'alimentation, le trimestre tombe dans les sections en utilisant une lame de rasoir. Acclimate le poisson à l'Styromousse tasses individuellement pendant 2 jours sans alimentation (Note: Seuls les poissons témoins non exposés ont été utilisés). Placez quatre quarts de la nourriture dans la tasse avec le poisson, et observer les poissons pendant 30 minutes pour combien de morceaux de la nourriture qu'ils mangent chaque.
5. Pour commencer la période de surveillance, transférer les poissons individuellement dans des tasses avec 80 ml d'APW en utilisant une épuisette. Chaque 2 h, agiter doucement l'APW à la main, puis prélever un échantillon et stocker 1 mL dans un marqué 1,7 ml Tube à 4 ° C. Prélever des échantillons pendant 36 h.
6. la fluorescence d'enregistrement, avec un spectrophotomètre de fluorescence de tous les échantillons en même temps après l'achèvement de l'essai. Placez l'ensemble de 1 ml d'échantillon dans une cuvette, et enregistrer la fluorescence mesurée en utilisant une excitation à 495 nm et émission à 520 nm.

Résultats

Un schéma global du système expérimental utilisé pour étudier les effets de l' hôte du poisson d' une exposition à l' antibiotique ¹³ est représentée sur la figure 1A et comprend la technique d'extraction de la peau (figure 1B) et de l' intestin (figure 1C) microbiomes du poisson. Trois jours a été choisi comme la période d'exposition aux antibiotiques, car les données précéd...

Discussion

Certains défis exigent une période de repos dans APW propre après le traitement antibiotique pour que le médicament soit épuisé dans les tissus de poissons. Si la période de repos est ignorée alors la présence d'antibiotiques peut confondre les résultats, en particulier lorsque le dosage implique une exposition à des bactéries. Afin d'examiner les effets à partir d'une composition de microbiome modifiée sans grands changements dans le nombre total de microbes sur l'hôte, des expériences p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make PBS