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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

Usine de connexions intercellulaires, les plasmodesmes (DP), jouent un rôle central dans l’usine des interactions plante-virus et physiologie. Critique de transport Pd sont tri signaux qui dirigent les protéines à Pd. Cependant, nos connaissances sur ces séquences est encore à ses balbutiements. Nous décrivons une stratégie visant à identifier les signaux de localisation de Pd dans les protéines ciblées Pd.

Résumé

Plasmodesmes (DP) sont des connexions de cellule-cellule qui fonctionnent comme des passerelles à travers lequel les petites et grosses molécules sont transportées entre les cellules végétales. Considérant que le transport de Pd de petites molécules, telles que des ions et l’eau, est censé se produire passivement, cellule-cellule transport des macromolécules biologiques, ces protéines, se produit probablement via un mécanisme actif qui implique des signaux spécifiques de ciblage sur les molécule transportée. La rareté des signaux de localisation des plasmodesmes identifiés (DP) (PLSs) a sévèrement restreint la compréhension du tri des protéines impliquées dans les voies des plantes transport macromoléculaire de cellule-cellule et de la communication. D’une multitude de plantes protéines endogènes et virales connues pour le trafic par le biais de Pd, PLSs seulement trois ont été signalés à ce jour, tous de protéines végétales endogènes. Ainsi, il est important d’élaborer une stratégie expérimentale fiable et systématique afin d’identifier une séquence PLS fonctionnelle, c'est-à-dire à la fois nécessaire et suffisante pour cibler les Pd, directement dans la vie cellules végétales. Nous décrivons ici une telle stratégie en utilisant comme un paradigme de la protéine de la cellule-cellule mouvement (MP) du virus de la mosaïque du tabac (TMV). Ces expériences, qui a identifié et caractérisent la première plante PLS virale, peuvent être adaptés pour la découverte de séquences PLS en protéines plus ciblées Pd.

Introduction

Plasmodesmes (DP) fonctionnent comme des conduites de transport intercellulaire des régulateurs clés du développement de la plante et morphogenèse, allant de facteurs de transcription de l’ARNm et de petites molécules d’ARN. En outre, cette capacité de transport macromoléculaire de Pd est utilisée par la plupart des virus végétaux pour leur propagation intercellulaire au cours de l’infection ; pour vous déplacer dans Pd, virus de plantes ont évolué des protéines spécialisées, appelées protéines de mouvement (MPs), visant spécifiquement les Pd1,2,3,4,5,6 , 7. les voies moléculaires du transport Pd très probablement sont intimement liés avec les séquences spécifiques qui ciblent les protéines transportées dans ces voies. Ainsi, l’identification de ces signaux de localisation de Pd (PLSs) peut être diagnostique de la voie de transport Pd correspondante. C’est par analogie des Pd transport8, par exemple, à l’importation nucléaire différentes voies, qui peuvent être spécifiques pour localisation nucléaire différents signaux (NLS) séquences9,10. D’un point de vue conceptuel, sln tant PLSs représentent non-CLIVABLES subcellulaires ciblage des séquences qui sont nécessaires et suffisantes pour le ciblage. Cependant, contrairement à la sln11, les informations de séquence sur PLSs sont fortement limitées. Plus précisément, seuls quatre séquences de protéines impliquées dans le ciblage de Pd ont été signalés, avec tous les dérivés de protéines végétales endogènes. L’un est représenté par un domaine homéotique KN112 – un facteur de transcription qui déplace des couches cellulaires internes à l’épiderme de la feuille de plante13 – et ses homologues de KNOX14. L’autre est aussi d’un facteur de transcription, Dof, qui contient un PLS putatif décrit comme le trafic intercellulaire (IT) motif15. La troisième séquence est de la protéine de la membrane PDLP1 plasmodesmes résident de type 1, et elle est représentée par un domaine transmembranaire16. Enfin, le quatrième parti démocrate ciblant la séquence a été récemment signalé pour glycosylphosphatidylinositol (GPI)-protéines ancrées et il est représenté par la glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification signal17.

Fait intéressant, jusqu'à tout récemment, aucune PLSs n’ont été rapportés pour MPs virales. Études antérieures a révélé la présence de séquences PLS putatifs en usine virale MPs18,19, mais aucun vrai PLS, c'est-à-direune séquence minimale d’acides aminés fois nécessaire et suffisante pour le Pd ciblage d’une cargaison non apparentés molécule ( e.g., CFP) a été identifié dans un MP virale. Encore une de ces protéines, MP du virus de la mosaïque du tabac (TMV), était le premier pour lequel Pd localisation et transports ont été démontrées20.

Pour combler cette lacune, nous avons développé une stratégie expérimentale pour identifier les PLS MP TMV. Cette stratégie repose sur trois concepts. (i) nous avons défini PLS comme une séquence minimale d’acides aminés qui est nécessaire et suffisant pour cibler les protéines à Pd21. (ii) parce que le TMV MP vise tout d’abord les Pd et puis translocation à travers ces canaux22, nous nous sommes efforcés à découplage ces deux activités et à identifier la bonne foi PLS, qui fonctionne uniquement pour le ciblage de Pd et non pour le transport ultérieur. (iii) nous avons analysé les PLS identifiés pour les résidus d’acides aminés importants pour sa Pd ciblant l’activité, qu’elle soit structurellement ou fonctionnellement. En utilisant cette approche, nous avons délimité une séquence de résidus acides aminés 50 à l’extrémité aminée-TMV MP qui agit comme véritable PLS. Cela a été fait en produisant une série de fragments de TMV MP saturées toute la longueur de la protéine, marquage de leurs extrémités carboxyle avec CFP et transitoirement les exprimer dans des tissus végétaux. Localisation de PD de chacun des fragments testés a été déterminée par leur co-exprimant avec une protéine de marqueur de Pd, PDCB1 (protéine obligatoire de callose Pd 1)23. Le plus petit fragment qui toujours localisée à Pd, mais ne pas Pd, était censé représenter les PLS. Enfin, le PLS a été alanine-analysés afin de déterminer les résidus d’acides aminés essentiels nécessaires à sa structure ou de fonction.

Alors qu’ici nous illustrons cette approche en décrivant l’identification de TMV MP PLS, il peut servir à découvrir PLSs dans aucune autre protéine ciblée Pd, si codé par les agents pathogènes des plantes ou par les plantes elles-mêmes ; C’est parce que notre méthode ne tire pas parti des fonctionnalités uniques de MPs virales en ce qui concerne leur capacité à cibler à Pd.

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Protocole

1. matériel végétal

  1. Choix des espèces végétales
  2. Utiliser les espèces de plantes indigènes à la protéine d’intérêt, c'est-à-dire, celui qui code cette protéine des protéines endogènes ou qui représente l’hôte naturel de l’agent pathogène pour les protéines virales. En outre, les espèces de plantes choisies doivent être favorable à la méthode choisie de transformation génétique transitoire.
    Remarque : Les études emploient couramment Nicotiana benthamiana, qui représente un bon hôte pour TMV et se transforme efficacement par la technique de la transformation par Agrobacterium génétique, c'est-à-dire, agroinfiltration (voir étape 3). Aussi, N. benthamiana plants poussent facilement et ont de grandes feuilles, qui sont facilement inoculés par Agrobacterium et facilement analysés par microscopie confocale.
  3. Croissance des plantes
    1. N. benthamiana semer dans un sol humide à haute densité. Gardez-les dans une chambre à atmosphère contrôlée à 20-25 ° c sous 16 h de lumière à ~ 75 µmol photons m-2 s-1 et 8 h d’obscurité. Lorsque le diamètre d’euphyll atteint 0,5 cm, soigneusement transférer les semis dans des pots plus grands et poursuivre la croissance dans la même chambre aux mêmes conditions.
    2. Maintenir les plantes jusqu'à ce qu’ils cultivent au stade 4-8 feuilles dans les 4 semaines, quand les feuilles plus grandes sont 4-6 cm de diamètre ; en ce moment, ils peuvent être utilisés pour agroinfiltration (voir étape 3).
      NOTE : Ce qui est important, ne jamais utiliser les plantes si ils ont commencé à fleurir car, à ce stade de développement, l’architecture des feuilles varie souvent24,25, aboutissant parfois à des résultats incohérents.

2. expression Vector Construction

  1. Choix du système d’expression
    1. Choisissez l’expression système, c.-à-d., vecteurs et vecteur bordereaux, mieux adapté à l’expression de la protéine d’intérêt chez les espèces de plantes étudiées.
      NOTE : Parfois, ces combinaisons spécifiques de la protéine testé/plante peuvent exiger des vecteurs spécifiques et vector méthode de livraison pour une expression optimale et fonction de la protéine d’intérêt. Pour plus de dicotylédones, cependant, sélectionnez binaires plasmides vecteurs d’expression et agroinfiltration comme système de diffusion.
  2. Marquage fluorescent protein
    1. Fluorescent étiqueter chaque protéine exprimée pour l’analyse de sa distribution subcellulaire22, y compris la localisation de Pd.
      Remarque : Employer auto-fluorescente protéines, telles que la PCP et DsRed2, sous forme de balises. Tag la protéine testée avec CFP et il coexpriment avec un DsRed2 libre. Fonctions de PCP comme balise et une molécule de cargaison de virus non liés. DsRed2 fonctions de calibrer l’efficacité globale d’expression transitoire et, parce qu’elle est cellule autonome, pour identifier la cellule initialement transformée ; cette dernière fonction est importante lors de l’évaluation de cellule à cellule mouvement de protéines testées potentiellement non-cellule-autonomes. Pour coexpression avec le marqueur de Pd PDCB1, qui est également une cellule autonome, Baliser la protéine testée avec la CFP et PDCB1 avec DsRed2.
    2. Suivant une règle simple, fusionner la balise auto-fluorescente à l’extrémité carboxyle-terminale de la protéine exprimée. Toutefois, si les expositions étiqueté protéines testées pleine longueur compromis ciblant les Pd, transférer le tag à l’extrémité aminée-de la protéine.
    3. Cloner les séquences codantes des protéines à tester dans un vecteur d’expression de végétaux adaptés.
      Remarque : Il existe de nombreux vecteurs d’expression de différentes plantes qui permettent un marquage fluorescent. Nous utilisons une série de SPAT plasmides26 ou certains de leurs dérivés27,28, qui conviennent pour le clonage de la séquence d’intérêt directement au châssis avec les balises auto-fluorescente suggérés (voir étape 2.2.1) dans les deux amino- et orientations du carboxyl-terminale.
    4. Transférer chaque cassette d’expression dans un vecteur binaire d’Agrobacterium.
      Remarque : Bien qu’axée sur la SPAT constructions ne conviennent pas pour la livraison de biolistique directement dans les tissus végétaux, agroinfiltration, qui est la méthode de transformation recommandée ici (voir étape 3), exige que la cassette d’expression qui sera situé entre l’ADN-T frontières d’un binaire vecteur29.
      Remarque : Tous les vecteurs de SPAT sont conçus pour permettre ce transfert à la pPZP-RCS2 multigénique expression vecteur binaire26,30 par une seule étape de clonage utilisant des nucléases rare coupe asques, j’ai-PpoI, I-SceI, I-CeuI, IPPG-PI et PI-TliI 26. chercheurs qui préfèrent utiliser le clonage à des fins recombinatorial, par exemple, à l’aide de sites hétérologue lox 31, peuvent employer SPAT vecteur variantes26,27.
    5. Pour coexpression, transférer les deux cassettes d’expression, par exemple, protéines testée-CFP et DsRed2 ou CFP-protéines testée et PDCB1-DsRed2 (voir point 2.1), pour le même vecteur binaire pPZP-RCS2.
      Remarque : Vous pouvez également Agrobacterium cultures hébergeant des constructions individuelles binaires peuvent être mélangés pour infiltration N. benthamiana (voir étape 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Ajouter 1 µg d’un plasmide pPZP-RCS2 à base de culture 2.2.5 à 100 µL étape des cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens souche EHA105 ou GV3101 préparé comme décrit32, incuber sur glace pendant 30 min, flash-congélation dans l’azote liquide pendant 1 min, et Incuber à 28 ° C pendant 15 minutes.
    1. Ensuite, ajouter 1 mL de milieu LB (tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L et 10 g/L de NaCl) dans le mélange de cellules compétentes et incuber à 28 ° C pendant 2 h. Spin down les cellules à 3 000 × g pendant 1 min, re-suspendez-les dans 0,2 mL de LB et leur plaque d’identification sur gélose LB avec des antibiotiques appropriés (par exemple, 100 mg/L spectinomycine et rifampicine 50 mg/L pour les vecteurs de base pPZP-RSC226,30). Croître à 28 ° C pendant 48 h, jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles.
  2. Choisissez et blanc sur plaque de plusieurs colonies individuelles sur une gélose LB au frais (voir étape 3.1), poussent à 28 ° C pendant 48 h et prendre une petite quantité de bactéries pour l’analyse par PCR de colonie33 pour confirmer la présence des constructions binaires spécifiques.
  3. Grandir à chaque colonie d’Agrobacterium avec la construction d’intérêt du jour au lendemain à 28 ° C dans 5 mL de milieu LB additionné d’antibiotiques appropriés (voir étape 3.1.1). Centrifuger les cellules à 3 000 × g et remettre en suspension les OD600= 0,5 dans agroinfiltration tampon (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM acétosyringone). Incuber pendant 2 h à température ambiante.
    1. Si vous utilisez un mélange de plasmides binaires plutôt qu’un plasmide seule expression multigénique pour coexpression de protéine, mélanger les cultures de cellules correspondant au ratio de 1:1 v/v avant infiltration. Puis incuber les cellules à 28 ° C pendant 2 h.
  4. Charger l’inoculum dans une seringue en plastique de 1 mL et la presse que laisse l’embout de la seringue (sans aiguille) contre l’épiderme inférieur (abaxiale) de la pleine maturité N. benthamiana . Tenez la feuille avec un doigt ganté sur la face adaxiale34,35.
    1. Introduire l’Agrobacterium dans le milieu de l’infiltration par injection lente. Signification statistique, s’infiltrer dans plusieurs feuilles sur chaque plante.
      NOTE : Notez que les feuilles plus anciennes ne sont pas utilisés car ils ne donnent pas les niveaux d’expression cohérente.
    2. Inoculer les feuilles in situ. Maintenir la plante infiltrée jusqu'à observation tel que décrit à l’étape 1.2.

4. confocal Microscopy

  1. Utilisez une lame pour couper chaque feuille en fragments entre les veines 24-48 h après l’infiltration, (en fonction de l’efficacité d’expression transitoire de la protéine spécifique testée) ; la taille de chaque tranche de tissu doit être telles que la tranche est entièrement recouvert par le couvercle en verre (22 mm x 40 mm) utilisé pour la microscopie.
  2. Place les tranches de feuille sur l’objet, faites glisser avec la face abaxiale vers le haut, placez une goutte d’eau sur la tranche de la feuille et couvrir avec le couvercle en verre. Immobiliser le couvercle en verre avec de petits morceaux de ruban de chaque côté.
  3. Observez les tissus agroinfiltrated sous un microscope confocal à balayage de laser et les images qui en résultent.
    1. Tout d’abord, utilisez un objectif de 10 X pour identifier les cellules avec le signal et ensuite utiliser 63 x objectif pour des observations plus détaillées.
    2. Longueur d’onde d’utilisation la 458 nm d’un laser à argon ion pour exciter la CFP et 543 nm pour exciter DsRed2. Conserver tous les paramètres d’acquisition d’images, c'est-à-dire, intensité du laser et des paramètres de tube (PMT) de photomultiplicateur, entre expériences. En moyenne, examiner pour chaque condition expérimentale, les cellules de 100-120.

5. identification des PLS

  1. Diagnostiquer la localisation de la protéine testée à l’aide de microscope confocal (section 4). Vérifier si la protéine testée a la caractéristique motif ponctuée périphérique25,36,37,38,39,40,41 et putative avec le marqueur Pd PDCB123. Cela indique que la protéine testée contienne probablement des séquences PLS.
  2. Après confirmation de l’activité PLS de protéines testées, subdivisez progressivement son cadre de lecture ouvert (ORF) (numéro d’accession genbank BAF93925.1) en petits fragments, autofluorescently, (p. ex., PCP) marquer chacun d'entre eux et d’analyser leur localisation sous-cellulaire tel que décrit à l’étape 4. Initialement, la taille de 100 résidus d’acides aminés pour chaque fragment de Loti est recommandée.
  3. Subdiviser davantage les fragments tronqués qui ont l’activité PLS et vérifier leur localisation subcellulaire tel que décrit à l’étape 4 jusqu'à ce que le plus petit fragment qui toujours se localise à Pd, c'est-à-dire est suffisant pour transporter la cargaison de balise auto-fluorescente à Pd, est identifié. Ce fragment est censé représenter la séquence PLS.
  4. Supprimer le PLS putatif de la protéine pleine longueur testée, c'est-à-dire fusionner la partie restante de la protéine test sans PLS putatif à tag auto-fluorescente et déterminer la localisation intracellulaire de la protéine mutante qui en résulte, comme décrit à l’étape 4. Si cette protéine mutante qui n’a pas le PLS putatif ne parvient pas à localiser à Pd, cela indique que l’identifiés PLS n’est pas seulement suffisante (voir étape 5.3), mais aussi nécessaire pour le transport de Pd de la protéine testé.
  5. Agroinfiltrate les feuilles avec un mélange de cultures d’Agrobacterium hébergeant l’expression construisent pour le CFP-tag PLS et DsRed2 libre (voir étape 3.3). Observer les tissus infiltrés à l’aide de microscope confocal avec porte-objectif 10 x en utilisant les mêmes paramètres que dans l’étape 4.3.
  6. Marquer des cellules qui contiennent des signaux CFP tant DsRed2 comme cellules initialement infiltrés et marquer les cellules adjacentes contenant seulement le signal de la PCP comme ceux ce mouvement de la pièce.
    Remarque : Cette étape porte sur le PLS identifiée pour sa capacité de mouvement de cellule à cellule potentiels ; C’est parce que beaucoup de protéines qui ciblent les Pd (y compris la plupart des plantes virales MPs) parcourir aussi Pd et les cellules voisines. La concentration d’Agrobacterium, utilisé pour l’infiltration dépend l’efficacité de l’expression des différentes structures, respectivement. Pour agroinfiltration, assurez-vous d’utiliser la dilution de la culture de cellule qui veille à la transformation (i) des cellules simples, laissant les cellules adjacentes non transformés, (ii) permet d’obtenir une efficacité similaire d’expression. Par exemple, nos expériences utilisent OD600 de 0,01 à 0,005 pour l’expression de PCP-tag PLS et libre DsRed2, respectivement.

6. identification des clés PLS les résidus à l’aide de balayage d’Alanine42

  1. Utiliser les protocoles PCR standard pour amplifier la PLS codage séquence employant une paire d’amorces destinés à contenir de la mutation souhaitée, c'est-à-dire, substitution du résidu d’acide aminé de cible avec alanine, autour de la région centrale de chaque amorce comme décrit 21. procéder à la conception d’amorce et utiliser le kit de mutagénèse dirigée pour la mutagénèse dirigée selon les instructions du fabricant.
  2. Purifier les produits PCR résultantes à l’aide de n’importe quel kit de purification de l’ADN standard et digérer à 37 ° C avec DpnI pour éliminer le parental méthylés (c'est-à-direnon muté) et ADN hemimethylated. Cela refroidir pendant 5 min à température ambiante (pas sur la glace). Puis transformer le mélange directement dans e. coli cellules compétentes43et identifier les colonies avec les constructions de mutant désirées comme décrit à l’étape 3.2.
  3. Introduire les constructions mutantes dans le vecteur binaire comme indiqué au point 2.2.4, effectuez agroinfiltration tel que décrit à l’étape 3 et évaluer les Pd ciblage comme décrit aux étapes 4 et 5.1.

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Résultats

Les données représentatives, qui fidèlement illustrent les résultats attendus des protocoles décrits et identifient le TMV MP PLS, constituent des adaptations de Yuan et al. 21. figure 1 a tout d’abord résume les principales constructions exprimant la pleine longueur TMV MP (1-268), MP de TMV PLS (comprenant les 50 premiers résidus d’acides aminés de la protéine, 1-50), et ses alanine numérisation V4A dérivés fusionnée à ...

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Discussion

Ce protocole a quatre constituants de base : le concept d’identifier une séquence qui est nécessaire et suffisant pour le ciblage de Pd, division systématique de la protéine d’intérêt en fragments qui diminuent progressivement de longueur, fusionnant la testé fragments d’une protéine auto-fluorescente qui sert comme balise et comme cargaison macromoléculaire et test fonctionnel pour Pd ciblant la vie des plantes tissus après une expression transitoire des protéines de fusion testé. Notez que l’expres...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Remerciements

Le manque d’espace, nous avons cité pour la plupart des articles de synthèse, et nous nous excusons à nos collègues dont le œuvre originale n’a pas cité. Le travail en laboratoire V.C. est pris en charge par des subventions du NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD et BSF à V.C., et le laboratoire S.G.L. est pris en charge par les NIH et des fonds des départements de pathologie végétale et biologie de la plante-Microbe S.G.L.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal laser scanning microscope (CLSM)ZeissLSM5Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imagingZeiss2009 versionThe software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit Agilent200523
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Syringes without needlesBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin Sigma-AldrichS4014
RifampicinSigma-AldrichR3501
Ampicillin Sigma-AldrichA0166

Références

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