Fractionnement des membranes cérébrales: une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche pour évaluer la localisation des protéines sous-synaptiques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques.

Résumé

L'évaluation de la composition et de la fonction de la protéine synaptique constitue un défi important en neuroscience. Cependant, il n'est pas facile d'évaluer la neurotransmission qui se produit dans les synapses car elle est fortement réglementée par des interactions protéines-protéines dynamiques et des événements de phosphorylation. Par conséquent, lorsqu'une méthode est utilisée pour étudier la transmission synaptique, un objectif majeur est de préserver ces modifications physiologiques transitoires. Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques. En d'autres termes, le protocole décrit une méthodologie biochimique pour effectuer l'enrichissement en protéines à partir de compartiments présynaptiques, postsynaptiques et extrasynaptiques. Tout d'abord, les synaptosomes, ou les terminaux synaptiques, sont obtenus à partir de neurones qui contiennent tous les compartiments synaptiques au moyen d'un gradient discontinu de saccharose. Il est à noter que la qualité de cette préparation initiale de la membrane synaptique est cRitical. Par la suite, l'isolement des différents compartiments sous-synaptiques est obtenu avec une solubilisation légère à l'aide de détergents doux à des conditions de pH différentiel. Cela permet une séparation par gradient et centrifuges isopyciques. Enfin, l'enrichissement en protéines dans les différents compartiments sous - synaptiques ( c'est-à-dire les fractions membranaires pré, post et extrasynaptiques) est validé au moyen d'une analyse par immunoblot en utilisant des marqueurs de protéines synaptiques bien caractérisés (SNAP-25, PSD-95 et synaptophysine, Respectivement), ce qui permet une évaluation directe de la distribution synaptique de toute protéine neuronale particulière.

Introduction

La transmission synaptique repose sur l'intégrité physique de la synapse, concept qui a été envisagé dès 1897 par Foster et Sherrington ¹ . Ainsi, la compréhension de la distribution de composants clés de neurotransmission ( p. Ex., Canaux ioniques, récepteurs, etc. ) est essentielle pour élucider la fonction synaptique, tant dans des conditions normales que pathologiques. La microscopie électronique (EM) a énormément contribué à la notion ultrastructurale actuelle des synapses prototypiques du système nerveux central (SNC). De telle manière, EM a établi avec précision les différences entre les densités pré et postsynaptiques, qui sont séparées par une fente d'une distance assez uniforme (~ 25 nm) ² . Il est intéressant de noter que l'appareil postsynaptique présente un épaississement relativement continu et densifié par des électrons en dessous de sa membrane plasmatique, la densité dite post-synaptique ou PSD ² . À l'inverse, à l'appareil présynaptique,Le réseau de cytomatricies discontinues est disposé juste sous la membrane plasmique, ce qui est essentiel à l'alignement et à l'amarrage des vésicules synaptiques à la zone active de la membrane plasmatique ³ . Par conséquent, EM constitue l'approche expérimentale dorée pour enquêter sur la répartition des protéines dans les synapses du SNC structurellement préservées. Cependant, les informations fournies par les micrographies électroniques sont statiques. En effet, les preuves accumulées montrent que les synapses in vivo sont extrêmement dynamiques, connaissant ainsi des changements structurels spectaculaires lors de la transmission synaptique soutenue. En outre, la morphologie et la composition des synapses peuvent varier dans différentes régions du SNC et sur le développement, la maturation, le vieillissement et le développement de conditions neuropathologiques. Dans l'ensemble, un protocole axé sur l'isolement des protéines appartenant à différents compartiments synaptiques dans des conditions physiologiques représente un outil précieux pour une étude plus complète du fonctionnement synaptique.

Ici, nous décrivons ce type d'approche expérimentale complémentaire, qui permet l'enrichissement biochimique préparatif des différents compartiments de membrane synaptique, à savoir les domaines de membrane extra, post-post-synaptique. Cette méthode de fractionnement de la membrane, décrite d'abord par Philips et al . (2001) ⁴ , est basé sur un changement de pH qui affaiblit les interactions adhésives se produisant dans l'appareil pré et post-synaptique. Tout d'abord, en utilisant des détergents doux à pH 6,0, il est possible de discerner la jonction adhérente qui détient l'appareil pré et post-synaptique et qui est maintenue à partir du domaine de la membrane extrasynaptique, qui est solubilisé et peut ainsi être extrait des contacts synaptiques. Par la suite, l'élévation du pH de 6,0 à 8,0 en présence de détergents doux affaiblit la résistance de la jonction adhérente qui maintient la zone active présynaptique étroitement liée à la densité postsynaptique. Par conséquent, le compartiment présynaptique est tellementLubilisé et peut être séparé de la densité postsynaptique, qui est principalement conservée car la concentration de détergent utilisée ne favorise pas sa solubilisation ⁴ . Fait intéressant, l'efficacité de fractionnement, éventuellement supérieure à 90%, peut être confirmée par différents marqueurs subsynaptiques: i ) protéine 25 synaptosomale associée (SNAP-25), de la zone active présynaptique; Ii ) la synaptophysine, à partir de la fraction extrasynaptique ( c'est-à-dire à l'extérieur de la zone active et incluant les microsomes); Et iii ) la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95), à partir de la densité postsynaptique. Notamment, cette méthode de fractionnement de la membrane du cerveau a été utilisée avec succès. En conséquence, il a été possible de déterminer précisément la localisation sous-synaptique de différents récepteurs, tels que les récepteurs de l'alpha-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) ⁵ , le récepteur de l'adénosine A ₁ (A ₁ R) ⁶ ,Les récepteurs de l'adénosine A _2A (A _2A R) ⁷ , les récepteurs P2 de l'adénosine triphosphate (ATP) ⁸ , les sous-unités du récepteur nicotinique de l'acétylcholine ⁹ et le récepteur GPR37 ¹⁰ associé à la maladie de Parkinson. Cependant, un certain nombre de limitations peuvent entraver l'évaluation correcte de la distribution synaptique d'une protéine neuronale particulière. Ainsi, dans cette procédure, nous décrivons non seulement entièrement l'intégralité du protocole, mais nous mettons également en évidence certains points critiques à considérer, tels que la quantité de tissu assez importante nécessaire, le faible rendement en protéines et l'obligation obligatoire de valider l'efficacité de Chaque séparation avant d'effectuer l'expérience définie.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales animales ont été approuvées par le Comité d'utilisation et de soins des animaux (CEEA) de l'Université de Barcelone, conformément aux directives décrites dans le Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire ¹¹ et à la suite de la Communauté européenne, loi 86/609 / CCE, FELASA et ARRIVE. Ainsi, les souris sont logées dans des cages standard, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, et sont maintenues dans des conditions standard contrôlées (12 h de cycle sombre / léger à partir de 7 h 30, température de 22 ° C et 66% d'humidité).

1. Obtenir des synaptosomes du cerveau de la souris à l'aide d'un gradient de saccharose discontinue

Note: Cette méthode a déjà été rapportée ¹⁰ .

1. Préparer un tampon d'isolement frais (IB), pH 7,4; 2 M de saccharose; 1 M de saccharose / CaCl ₂ 0,1 mM; Et CaCl ₂ 0,1 mM (voir tableau 1 ). Refroidir les solutions sur la glace.
2. SaCrifice cinq souris par dislocation cervicale. Décapiter et éliminer rapidement le cerveau de chaque animal. Dissectez la région du cerveau d'intérêt (c.-à-d., L'hippocampe, 0,25 à 0,35 g de tissu frais) et placez-le dans un tube de verre Potter-Elvehjem de 5 ml sur de la glace avec 1 mL de IB.
3. Homogénéiser le tissu à l'aide d'un agitateur d'homogénéisation (10 coups à 700 à 900 rotations par minute), préférentiellement dans un bain de glace pour empêcher le réchauffement de l'échantillon.
4. Placez le tissu homogénéisé (1 ml) dans un tube de 15 ml contenant 6 ml de saccharose 2 M et 2,5 ml de CaCl2 0,1 mM à 4 ° C. Mélanger lentement en inversant le tube.
   Note: L'addition de calcium est essentielle au maintien des interactions adhésives entre les organites et donc à la préservation de la structure des différentes "densités".
5. Mettre la solution dans un tube de centrifugation de 12 ml et ajouter lentement 2,5 ml de saccharose 1 M / CaCl ₂ 0,1 mM sur le dessus de chaque tube pour former le gradient de saccharose.
   Note: étiquetez la position oF l'interface dégradée sur le tube centrifuge à l'aide d'un marqueur permanent.
6. Peser et équilibrer les tubes centrifuges avec une solution IB dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
7. Centrifuger les tubes pendant 3 h à 100 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants. Remplissez complètement le rotor avec tous les supports d'acier (même vides, si nécessaire).
8. Jeter la couche supérieure contenant de la myéline. Avec une pipette Pasteur, collectez la bague blanche entre l'interphase de saccharose 1.25-M et 1-M correspondant à la fraction de synaptosome.
9. Diluer les synaptosomes avec 9 fois leur volume en utilisant un tube à centrifuger.
10. Peser et équilibrer les tubes centrifuges avec une solution IB dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
11. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 15 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants.
12. Jeter le surnageant et ré-endiguerE granule avec 1,1 ml de solution d'IB. Recueillir 100 μL de cette solution synaptosomale et centrifuger pendant 5 min à 11 000 x g et 4 ºC.
13. Remettre en suspension la pastille synaptosomale dans du dodécylsulfate de sodium à 5% (SDS) et stocker cet échantillon à -20 ° C.
    Note: Cet échantillon correspond à la fraction totale de synaptosome pour une analyse ultérieure de Western-blot. La fraction synaptosomale restante (~ 1 mL) peut être congelée à -20 ºC jusqu'à l'utilisation ou traitée pour le fractionnement subsynaptique subséquent. Les synaptosomes ou les synapses purifiées représentent entre 1 et 2% du volume total de l'hippocampe ¹² .

2. Isolation avant, post et extrasynaptique

1. Préparer 2 fois de tampon de solubilisation fraîche, pH 6,0; 1x tampon de solubilisation, pH 6,0; Tampon de solubilisation, pH 8,0; Et CaCl ₂ 0,1 mM (voir tableau 1 ). Refroidir les solutions sur la glace.
   Note: Le pH de ces solutions devrait être préciséEt ajusté pour obtenir un bon fractionnement sous-synaptique.
2. Diminuer lentement la fraction synaptosomale restructurée de 1 ml (voir étape 1.12) avec 5 mL de CaCl2 0,1 mM.
3. Ajouter le même volume (5 ml) de tampon de solubilisation 2x glacé, pH 6,0, et incuber pendant 50 minutes sur de la glace sous forte agitation dans un bécher sur glace.
   Note: Alors que 1% de Triton X-100 à pH 6,0 solubilise toutes les protéines de la membrane plasmique, elle conserve les protéines dans les contacts synaptiques ou les jonctions ( c'est-à-dire les structures pré et post-synaptiques) ⁴ .
4. Placez la solution dans un tube centrifuge. Pesez et équilibrez les tubes avec des volumes équivalents de 0,1 mM de solution de tampon de solubilisation CaCl ₂ et 2x, pH 6,0, dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
5. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 40 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants. Le surnageant résultant représente la fraction extrasynaptique,Et la pastille correspond aux jonctions synaptiques ( c.-à-d., Fractions pré et post-synaptiques).
6. Concentrer le surnageant contenant la fraction extrasynaptique à un volume final de 200 μl en utilisant un tube de filtration de 15 mL 10K centrifugé à 4.000 xg et 4 ºC.
7. Précipiter la fraction extrasynaptique concentrée résultante (200 μL) avec 5 volumes (1 ml) d'acétone pré-refroidie (-20 ° C) pendant une nuit à -20 ° C.
8. Le lendemain, centrifuger la fraction extrasynaptique pendant 30 min à 18 000 x g et -15 ° C. Après centrifugation, jeter le surnageant d'acétone et sécher la pastille pour éliminer toute trace d'acétone.
9. Enfin, remettez en suspension la pastille contenant les protéines extrasynaptiques avec 200 μL de SDS à 5%. Sonicate la pastille, si nécessaire.
10. Sans le perturber, laver soigneusement le culot contenant les fractions pré et post-synaptique avec 2 ml de 1x tampon de solubilisation, pH 6,0. Jeter le tampon.
11. ResuspendreLa pastille avec 10 ml de 1x tampon de solubilisation, pH 8,0, en utilisant une pipette Pasteur de verre.
    Note: Alors que 1% de Triton X-100 à pH 8,0 solubilise la spécialisation présynaptique, il conserve la densité postsynaptique insoluble ⁴ .
12. Incuber la suspension pendant 50 minutes sur de la glace sous forte agitation dans un bécher sur glace.
13. Placez la solution dans un tube centrifuge. Peser et équilibrer les tubes avec une solution tampon de solubilisation 1x, pH 8,0, dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
14. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 40 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants; Le surnageant résultant correspond à la fraction présynaptique et à la pastille à la fraction postsynaptique.
15. Traiter le surnageant contenant la fraction présynaptique, comme décrit aux étapes 2.6-2.9.
16. Remettre en suspension la fraction postsynaptique contenant des pastilles avec 200 μL de SDS à 5%. Sonicate the pellet, iF requis.

3. Analyser les échantillons par immunotransfert pour valider le fractionnement de la membrane

1. Déterminer la quantité de protéines dans chaque fraction ( c.-à-d., Les fractions totale, extra, pré et post-synaptique) en utilisant le dosage des protéines d'acide bicinchoninique.
2. Prendre 20 μg de protéines de chaque fraction et la diluer jusqu'à un volume final de 50 μL dans un tampon d'échantillon de SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Faire bouillir pendant 5 min à 100 ° C.
3. Séparez les protéines par électrophorèse SDS-PAGE 10%, avec un gel concentrant à 4% dans des conditions réductrices. Electrophorèse à tension constante de 80 V jusqu'à ce que le colorant entre dans le gel inférieur puis augmente la tension à 120 V.
4. Transférer les protéines dans une membrane PVDF et bloquer avec une solution bloquant IB pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation continue.
5. Incuber la membrane pendant une nuit à 4 ºC avec l'anticorps primaire indiqué ( c.-à-d. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptophysine ou anti-GPR37) dilué dans une solution de blocage d'IB sous agitation continue.
6. Laver la membrane trois fois (10 minutes chacune) avec une solution de lavage IB pour éliminer l'anticorps primaire non lié.
7. Incuber avec l'anticorps secondaire indiqué pendant 90 minutes dans des conditions sombres à température ambiante sous agitation continue.
8. Laver la membrane trois fois (10 min chacune) avec une solution de lavage IB pour éliminer les anticorps secondaires non liés.
9. Incuber la membrane avec un substrat chimioluminescent (préparer le mélange dans des conditions sombres et suivre la proportion 1: 1 de la solution A et B fournie par le fabricant).
10. Analyser la membrane dans un dispositif de détection chimioluminescente.

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Résultats

La méthodologie décrite a été largement utilisée pour l'analyse sous-synaptique des protéines neuronales en général et pour l'isolement et la caractérisation biochimique des récepteurs synaptiques ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} en particulier. Fait intéressant, le résultat représentatif affiché ici montre l'utilit...

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Discussion

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,211,211
CaCl2	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	2,112,211,210
MgCl2·6H2O	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,313,961,210
Protease inhibitor cocktail Set III	Millipore, Darmstadt, Germany	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, USA	T1503
Tris-HCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,236,541,209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, USA	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, USA	L3771
Glycerol	Sigma, St. Louis, MO, USA	G5516
Bromophenol Blue	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,311,651,604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, USA	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, USA	P2287
Non fat dry milk
NaCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,216,591,211
KCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,314,941,210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,781,211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer	VWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-Clear Tubes (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona	344059	Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	UFC901008
Centrifuge 5430R	Eppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm	VWR, Radnor, PA, USA	612-1702
Compact Balance EK-610	A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 Precision Balance	A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37	Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.		Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin	Abcam, Cambridge, United Kingdom		Primary antibodies diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:30,000