Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Résumé

Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d'expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.

Résumé

La phosphorylation des protéines sur des sites spécifiques détermine sa conformation et son interaction avec d'autres molécules. Ainsi, la phosphorylation des protéines affecte les fonctions biologiques et les caractéristiques de la cellule. Actuellement, la méthode la plus commune pour découvrir les sites de phosphorylation est l'analyse par chromatographie en phase liquide / spectrométrie de masse (LC / MS), une méthode rapide et sensible. Cependant, des fragments de phosphate relativement labiles sont souvent libérés à partir de phosphopeptides pendant l'étape de fragmentation, ce qui donne souvent des signaux faussement négatifs. Dans de tels cas, un dosage traditionnel de kinase in vitro utilisant des mutants dirigés par site serait plus précis, mais cette méthode est laborieuse et prend beaucoup de temps. Par conséquent, une autre méthode utilisant une compétition peptidique peut être avantageuse. Le motif de reconnaissance consensus de 5 'de la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate (AMPK) a été établi ¹ et a été validé à l'aide d'un culot de bibliothèque de peptides à balayage de positionAy ² . Ainsi, les sites de phosphorylation AMPK pour un nouveau substrat pourraient être prédits et confirmés par les tests de compétition peptidique. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes détaillées et les procédures pour le test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro en illustrant la phosphorylation du facteur 2 associé au facteur 2 de l'erythroid 2 (Nrf2) à médiation par AMPK. Pour authentifier le site de phosphorylation, nous avons effectué un dosage séquentiel de kinase in vitro en utilisant un mutant spécifique au site. Dans l'ensemble, le test de compétition peptidique fournit une méthode pour cribler de multiples sites potentiels de phosphorylation et pour identifier les sites à valider par les mutants du site de phosphorylation.

Introduction

La phosphorylation des protéines à un résidu spécifique joue un rôle important dans un large éventail de processus cellulaires. Ainsi, une compréhension des réseaux de signalisation nécessite l'identification de sites spécifiques de phosphorylation. En outre, le site de phosphorylation détermine l'effet sur la fonction des protéines car les domaines individuels dans une protéine possèdent différentes structures et fonctions. L'activité du facteur 2 du facteur nucléaire 2 (Nrf2), un facteur de transcription antioxydant clé, est régulée bidirectionnellement par la phosphorylation sur différents sites. Nos études ont porté sur les kinases qui catalysent la phosphorylation de Nrf2. La réponse au stress de Nrf2 contre le défi oxydatif se produit rapidement, principalement par la phosphorylation à la serine 40 et médiée par la protéine kinase C (PKC) -δ, qui active Nrf2 ^{3 , 4} . Inversement, Fyn catalyse la phosphorylation inhibitrice de Nrf2 à la tyrosine 568 pour un contrôle strict de l'activité ⁵ .

La méthode la plus commune utilisée pour découvrir les sites de phosphorylation est l'analyse par chromatographie liquide / spectrométrie de masse (LC / MS). Des données de cartographie de sites de phosphorylation rapides et très sensibles peuvent être générées de cette façon; Cependant, il présente plusieurs limitations techniques, générant souvent des signaux faussement négatifs. Une mauvaise couverture séquentielle se manifeste fréquemment dans l'analyse LC / MS. Pour identifier les sites de phosphorylation, il est nécessaire d'obtenir des informations sur la couverture maximale d'acides aminés d'une protéine ⁶ . La protéolyse de la protéine d'intérêt avec plusieurs protéases pendant la phase de digestion peut être utile pour améliorer la couverture des séquences. Un autre obstacle à l'identification des résidus de phosphorylation est la perte facile d'acide phosphorique fréquemment observée pour les peptides phosphorylés par la serine et la thréonine ^{6 , 7} . Les fragments de phosphate labile sont souventLibéré à partir de phosphopeptides pendant le processus de fragmentation ⁷ . La deuxième option lors de la recherche de sites de phosphorylation est l'utilisation d'une méthode de microarray peptidique. Il est possible d'examiner les sites cibles de la kinase en utilisant une puce de microarray contenant des fragments peptidiques dérivés d'une protéine d'intérêt. Cependant, en raison de l'exigence d'équipement pour la production et la détection d'une puce de microarray, la méthode de microarray peptidique est considérée comme longue et coûteuse.

Pour surmonter ces défis, on peut utiliser un test de kinase concurrent d'oligopeptide in vitro pour une protéine kinase avec des motifs de reconnaissance connus. Si le motif de reconnaissance de consensus d'une kinase est établi, on peut prédire les sites de phosphorylation putatifs d'un substrat candidat et l'authenticité des sites peut être validée. La méthode la plus convaincante pour cette procédure est de montrer l'abrogation de la phosphorylation dans une protéine mutante dans laquelle le prédicteurD résidu est substitué par un acide aminé non phosphorylable ( c'est-à-dire la sérine ou la thréonine à l'alanine, la tyrosine à la phénylalanine). Cependant, la production et l'isolement des protéines mutantes prend du temps. Comme alternative au stade initial de la recherche, le dosage compétitif de la peptide kinase est simple et pratique. Ici, nous décrivons un protocole pour un test de compétition peptidique in vitro et pour la validation du site de phosphorylation.

Protocole

1. Sécurité

ATTENTION: Ce protocole utilise [γ- ³² P] -ATP pour évaluer l'activité de l'AMPK. Phosphorus-32 est un isotope radioactif, émettant en grande partie un rayonnement bêta. Comme la taille d'une particule bêta est extrêmement petite, elle peut facilement pénétrer les vêtements et la peau. L'exposition externe et interne au rayonnement bêta peut nuire à la santé humaine, y compris en causant des brûlures cutanées et des lésions tissulaires.

1. Effectuez toutes les étapes nécessitant l'utilisation de [γ- ³² P] -ATP en utilisant une protection appropriée, comme le blindage acrylique.
2. Assurez-vous que tout le personnel est équipé de dosimètres personnels électroniques (EPD) pour surveiller l'étendue de l'exposition aux rayonnements nuisibles pendant toutes les procédures.
3. Gérer les rayonnements à source ouverte uniquement après une formation appropriée et une approbation réglementaire.
   REMARQUE: Ici, toutes les expériences ont été menées après l'achèvement de la formation sur l'utilisation de rayons à source ouverte au Seoul National UnivEt l'approbation du gouvernement coréen (nssc.go.kr/nssc/fr).
4. Éliminer les déchets radioactifs selon les réglementations locales.
   NOTE: Ici, les directives de l'Institut de protection de l'environnement et de sécurité de l'Université nationale de Séoul ont été suivies. Voici une liste des organismes de réglementation des États-Unis et des pays européens: les États-Unis d'Amérique, la Commission de réglementation nucléaire des États-Unis (http://www.nrc.gov/); Royaume-Uni, Health and Safety Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); France, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Et l'Allemagne, Ministère fédéral de l'environnement, de la conservation de la nature, du bâtiment et de la sûreté nucléaire (BMU) (http://www.bmu.de).

2. Essai in vitro de la kinase compétitive

1. Construction de peptides compétitifs
   1. Déterminer le motif de consensus phosphorylé par AMPK.
      REMARQUE: AMPK reconnaît le motif du consensus, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Dans la séquence consensus, Φ représente les acides aminés hydrophobes ( c'est-à-dire la valine [V], la leucine [L], la méthionine [M] et l'isoleucine [I]) et β représente les acides aminés basiques ( c'est-à-dire la lysine [K], l'arginine [ R], et histidine [H]) ¹ .
   2. Sélectionnez les résidus de serine ou de thréonine à partir de séquences cibles selon le motif de consensus ci-dessus. Utiliser trois sites putatifs de Nrf2 humain (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558) ⁸ .
   3. Synthèse commerciale de peptides à 10 résidus qui imitent les sites putatifs. Obtenir le produit synthétisé sous la forme d'une poudre lyophilisée avec une pureté supérieure à 98% pour chaque peptide.
   4. Dissoudre les peptides en utilisant un tampon kinase pour obtenir une concentration de 71,667 g / L. Si un peptide n'est pas soluble dans un tampon kinase, dissolvez-le dans 20% de DMSO. Si elle reste insoluble, un peptide imitant la mise en placeLe site actif peut être étendu pour augmenter la solubilité.

2. Essai compétitif AMPK Kinase In Vitro
   1. Préparer 5 x kinase tampon comme suit: HEPES 100 mM, pH 7,4; 25 mM de MgCl ₂ ; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; 125 mM β-glycérophosphate (serine / thréonine phosphatase inhibiteur); Na ₃ VO ₄ 5 mM (inhibiteur de tyrosine phosphatase); 0,5% (v / v) de l'ensemble de cocktails inhibiteur de protéase III, 1 mM d'ATP froid; Et 500 μM AMP.
      REMARQUE: AMP est un composant essentiel du tampon kinase pour tester l'activité AMPK. Le tampon peut être utilisé pour mesurer l'activité de la serine / thréonine kinases et des tyrosine kinases.
   2. Décongeler les protéines recombinantes et les peptides synthétiques suivants sur la glace: AMPK; Nrf2; Et les oligopeptides n ° 1, n ° 2 et n ° 3.
   3. Préparer un tampon de réaction sur glace: 0,15 μg d'AMPK, 0,4 μg de Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg d'oligopeptide (~ 300 nmol) et 6 μL de tampon kinase 5 x. UNEAjustez le volume final à 30 μL avec de l'eau distillée stérile (DW).
      NOTE: L'ajout de [γ- ³² P] -ATP après la préparation du tampon de réaction peut réduire le signal radioactif dû à l'autophosphorylation de la kinase.
3. Exécution des réactifs
   REMARQUE: Tous les procédés ci-dessous doivent être effectués sous protection avec un écran acrylique, un rack ou un bloc, ainsi qu'un équipement de protection individuelle approprié.
   1. Réglez les blocs de chauffage à 30 ° C avant de commencer l'expérience.
   2. Ajouter 1 μl de [γ- ³² P] -ATP (1 μCi) aux tubes de réaction sur de la glace. Mélangez le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
      NOTE: La radioactivité de ³² P a une demi-vie courte d'environ 14 jours ⁹ . Réglez le volume en considérant la demi-vie ( par exemple, après un mois à partir de la production de [γ- ³² P] -ATP, ajoutez 4 μL de [γ- ³² P]-ATP pour faire 1 μCi).
   3. Incuber l'échantillon dans le bloc de chauffage à 30 ° C pendant 15 à 30 minutes. Au cours de cette étape, préparer des gels à 7,5% de gomme de dodécyl sulfate-polyacrylamide en gel de sodium (SDS-PAGE). Ajuster le pourcentage du gel en fonction de la taille de la protéine cible.
   4. Arrêter la réaction de la kinase en ajoutant 3 μL de tampon d'échantillon de 10 x SDS (10% (v / v) de glycerol, 20% (p / v) de SDS, 15,42% (p / v) de dithiothréitol, 90% (v / v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) et 0,02% (p / v) de bleu de bromophénol). Mélangez le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
   5. Exécuter les échantillons dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min et en continu à 140 V pendant 1 h.
      NOTE: La ligne bleue de bromophénol à la fin du gel contient des signaux radioactifs extrêmement élevés. Il est recommandé d'enlever le gel sous la ligne bleue avant de passer à l'étape suivante pour réduire les signaux d'arrière-plan.
   6. Après SDS-PAGE, retirez doucement le gel du routeur. Placez le gel dans un verre tPour la prochaine étape.
   7. Fixer le gel avec un tampon de fixation pendant 20 min (50% de methanol et 10% d'acide acétique glacial).
   8. Déplacez doucement le gel sur du papier filtre et recouvrez-le avec une enveloppe transparente. Notez que le gel peut être facilement déchiré à cette étape. Sécher le gel avec un séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h.
4. Visualisation
   1. Exposez le gel à un écran phosphore ou à un film de rayons X pendant la nuit (habituellement environ 16 h).
      REMARQUE: Un écran phosphore peut être réutilisé après exposition à la lumière extra-lumineuse. Lorsqu'un film à rayons X est utilisé, exposez le gel sur deux jours. Les films à rayons X ont des sensibilité plus faible que les écrans phosphores.
   2. Scannez l'écran phosphore avec un imageur de phosphore. Exportez l'image en tant que fichier TIFF ou bitmap haute résolution.
   3. Après la visualisation, déplacez le gel dans un récipient en verre ou en plastique pour la coloration Blue Coomassie (CBB).
   4. Laver le gel avec DW. Jeter le DW et tacher leE gel avec le réactif de coloration pendant 1 h.
   5. Jeter le réactif et dégager le gel avec du DW pendant 1 h ou pendant la nuit. Placez le gel entre des films plastiques transparents (ou l'équivalent) pour numériser avec un scanner de bureau.

3. Essai in Vitro Kinase en utilisant un mutant spécifique au site

1. Mutagenèse dirigée par site de pGEX-Nrf2
   1. Mutagenic Primer Design
      NOTE: La conception d'amorces mutagènes appropriées est essentielle pour l'issue réussie de la mutagenèse. Voici quelques considérations pour la conception d'amorces mutagènes. Créez une amorce composée de 25 à 45 bases, avec la mutation souhaitée au milieu de l'amorce. L'amorce doit avoir un contenu de 40 à 60% de GC et se terminer avec une ou plusieurs bases G ou C. Assurez-vous que le T _m de l'amorce est égal à 78 ° C ou plus selon la formule [T _m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / longueur des bases) -% désagrégé].
      REMARQUE: Purifiez leCar sa pureté est importante pour l'efficacité de la mutation. Il existe plusieurs sites Web pour la conception d'amorces mutagènes.
      1. Ouvrez le programme de conception d'amorces pour "concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. Collez la séquence d'ADN Nrf2 humaine (Numéro d'accès NM_006164.4) et sélectionnez le bouton "Télécharger la traduction".
      3. Sélectionnez le résidu de serine 558 à partir de la séquence d'acides aminés traduite à changer en alanine. En utilisant l'amorce mutagène, remplacer le codon pour la serine d'agc en gcc, pour l'alanine.
      4. Considérons la longueur d'amorce, T _m et le contenu GC.
         NOTE: L'amorce mutagène est finalement conçue sous la forme de 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
   2. Réaction pour la synthèse du brin mutant utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR)
      1. Préparer le mélange réactionnel de PCR sur de la glace: 10 x tampon de réaction, 50 ng dePGEX-GST-Nrf2, 125 ng d'amorce directe, 125 ng d'amorce inverse, 1 μL de mélange de dNTP (10 mM chacun), 2,5 U d'ADN polymerase de Pfu et DW stérile à 50 μL.
      2. Exécuter la PCR pour la synthèse du brin mutant pGEX-GST-Nrf2 avec le programme de cyclage suivant: 1 cycle à 95 ° C pendant 30 s; 18 cycles à 95 ° C pendant 30 s, à 55 ° C pendant 1 min et à 68 ° C pendant 90 s; Et 1 cycle à 68 ° C pendant 5 min.
         REMARQUE: Selon la longueur du plasmide, les paramètres de cyclage peuvent être modifiés.
      3. Placez-le sur de la glace pendant 2 minutes pour refroidir les réactifs pour l'étape suivante. Sinon, rangez-les à 4 ° C pendant la nuit.
   3. Dpn I Digestion et la sélection d'un plasmide mutant
      1. Ajouter 1 μL d' enzyme de restriction Dpn I (10 U / μL) à chacun des réactifs après refroidissement. Mélanger minutieusement et doucement en pipettant et centrifuger pendant 1 min.
      2. Incuber à 37 ° C pendant 2 h pour digérer parental pGEX-GST-Nrf2 double-ADN échoué.
      3. Décongeler doucement les cellules supercompétentes DH5 α sur la glace.
      4. Ajouter 50 μL du réactif à 150 μL de cellules supercompétentes DH5 α pré-refroidies et incuber sur de la glace pendant au moins 30 minutes.
      5. Transférer les tubes dans un bloc chauffant préchauffé à 42 ° C et les laisser pendant 90 s. Placez-les sur de la glace pendant 2 min.
      6. Ajouter un bouillon de lysogénie pré-réchauffé (LB) aux cellules DH5 α transformées et incuber à 37 ° C pendant 1 h avec agitation à 180 tr / min.
      7. Étaler les cellules transformées sur des plaques de gélose LB-ampicilline et incuber pendant une nuit à 37 ° C.
         NOTE: L'ampicilline est utilisée pour la sélection puisque le plasmide GEX-GST-Nrf2 possède le marqueur de résistance à l'ampicilline. Utiliser des antibiotiques appropriés, en fonction du marqueur de résistance du plasmide mutagénisé.
      8. Choisissez une seule colonie de la plaque, transférez-la à 5 mL de LB-ampicilline et incupez toute la nuit à 37 ° C sous agitation à 180 tr / min.Pour la vérification de la séquence mutagène, évaluer au moins trois colonies.
      9. Extraire l'ADN en utilisant un kit miniprep d'ADN pour l'analyse de séquence d'ADN; Suivre le protocole du fabricant.
      10. Vérifier les séquences d'ADN mutagène en utilisant un analyseur automatique de séquence d'ADN selon le protocole du fabricant. Utiliser au moins 200 ng de la construction d'ADN pour la vérification des séquences mutantes.
2. Purification de la protéine GST-Nrf2 recombinante
   1. Expression de la protéine de fusion GST-Nrf2 mutagène chez Escherichia coli
      1. Transformer le plasmide pGEX-GST-Nrf2 mutagène en cellules BL21 . Inoculer une colonie unique dans 25 ml de bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 μg / mL) et incuber à 37 ° C sur un rotateur pendant une nuit.
      2. Inoculer les cellules cultivées dans 100 ml de bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 μg / mL) à un rapport de dilution 1: 100.
      3. Incuber à 37 ° C sur une rotationOu jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteigne environ 0,4-0,8 (environ 4 h).
      4. Ajouter 100 μL d'IPTG 1 M à 100 ml de cellules cultivées pour préparer une concentration finale d'IPTG 1 mM.
      5. Incuber les cellules à 30 ° C sur un rotateur pendant 6 h ou pendant la nuit pour l'expression de la protéine.
      6. Centrifuger les cellules à 5 000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les pastilles cellulaires avec 1 ml de tampon de lyse bactérien (25 mM d'HEPES, 5 mM d'EDTA, 2 mM de DTT, 0,1% de CHAPS, 1 ug / mL de pepstatine, 0,5 μg / mL de leupeptine, Et PMSF 1 mM) sur de la glace.
      7. Lyse les pastilles cellulaires en utilisant un homogénéisateur à ultrasons avec des intervalles de 2 s pendant 2 min à 50% de la puissance maximale.
      8. Centrifuger les cellules à 12 000 × g pendant 15 min à 4 ° C et collecter le surnageant.
   2. Purification de la protéine GST-Nrf2 recombinante
      1. Préparer 200 μl de billes de glutathion-agarose à 50% (v / v) et laver avec 1 ml de PBS (pH 7,3, NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 10 mM HPO ₄ et 1,8 mM KH ₂ PO ₄ ). Recueillir les perles par centrifugation à 500 × g pendant 1 min. Répétez trois fois l'étape de lavage.
      2. Ajouter le lysat cellulaire sur les 200 μL préparés de perles de glutathione-agarose à 50% (v / v) et incuber à 4 ° C sur un rotator de bout en bout pendant 2 h.
      3. Recueillir les perles de glutathion-agarose combinées avec la protéine GST-Nrf2 par centrifugation à 500 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 31 G.
      4. Laver les perles avec 1 ml de PBS (pH 7,3), comme à l'étape 1.
      5. Ajouter 500 μL de tampon d'élution (Tris-HCl 50 mM et glutathion réduit 10 mM, pH 8,0) sur les billes de glutathion-agarose combinées avec du GST-Nrf2. Incuber à 4 ° C sur un rotator de bout en bout pendant 30 min.
      6. Centrifuger à 500 xg pendant 1 min et collecter le surnageant.
      7. Encore ajouter 300 μL de tampon d'élution aux perles et répéter deux fois les étapes 3.2.2.5-3.2.2.6.
   3. Confirmation de la protéine GST-Nrf2 purifiée
      1. Préparez 5 μL de l'échantillon pour la visualisation de la quantité de protéines avec 0,5 μg de protéine BSA standard.
      2. Exécuter les échantillons dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min, puis à 140 V pendant 60 minutes.
      3. Tachez le gel avec 0,1% de solution de coloration au CBB (0,1 g de CBB R250, 40 ml de 99% de methanol, 10 ml d'acide acétique glacial et 50 ml d'H2O distillé) pendant 2 h et déstain (30 ml de methanol, 10 ml d'acide acétique glacial et 60 ml d'H ₂ O distillé jusqu'à ce que les bandes soient clairement représentées.
      4. Placez le gel décoloré sur du papier filtre et recouvrez-le avec une enveloppe transparente. Sécher le gel avec un séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h.
      5. Déterminer la quantité de protéine mutante GST-Nrf2 avec densitométrie pour le dosage de la kinase AMPK in vitro .
3. Essai d'activité AMPK in vitro avec un mutant spécifique au site
   NE PASE: Le test de la kinase AMPK in vitro est réalisé selon les étapes 2.2-2.4, en utilisant 0,4 μg de GST-Nrf2 de type sauvage purifié ou le mutant GST-Nrf2-S558A sans inhibiteur de peptides. Suivez toutes les directives de sécurité radiologique décrites à l'étape 1.
   1. Préparer un tampon de réaction sur de la glace avec 0,15 μg d'AMPK, 0,4 μg de GST-Nrf2 mutant ou sauvage et 6 μL de tampon 5 kinase. Remplissez jusqu'à 30 μL avec du DW stérile.
   2. Ajouter 1 μL de [γ- ³² P] -ATP (1 μCi / μL) aux tubes de réaction sur de la glace. Mélanger le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois et centrifuger.
   3. Incuber les échantillons dans un bloc chauffant à 30 ° C pendant 30 min.
   4. Arrêtez la réaction de la kinase en ajoutant 3 μL de tampon échantillon 10 x SDS.
   5. Exécuter dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min, puis à 140 V pendant 1 h.
   6. Fixez le gel avec le tampon de fixation pendant 20 minutes, déplacez-le sur le papier filtre et recouvrez le gel avec un transparentEnt wrapper.
   7. Séchez le gel avec le séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h, puis exposez-le pendant une nuit à un écran phosphore ou à un film à rayons X.
   8. Numérisez l'écran phosphore avec un imageur de phosphore et déplacez le gel dans un tube de verre pour la coloration CBB après la visualisation selon l'étape 2.4.

Résultats

La figure 1 et la figure 2 démontrent les résultats des expériences répétées dans le document précédemment rapporté ⁸ . Trois oligopeptides de 10 résidus différents imitant les sites cibles de l'AMPK putatifs (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558) ont été synthétisés et utilisés comme concurrents dans le Test de kinase vit...

Discussion

Comme un moyen simple et pratique d'évaluer l'authenticité des sites de phosphorylation prédits médiés par AMPK, on ​​décrit ici un test de kinase in vitro qui peut être utilisé pour découvrir un site de phosphorylation spécifique en utilisant des peptides compétitifs et pour le vérifier en utilisant un mutant spécifique au site . Les données représentatives obtenues à partir du test d'activité AMPK compétitif in vitro correspondent aux résultats d'un essai en uti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	208337
EGTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E3889
DTT	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D9779
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	450243
Protease inhibitor cocktail	Calbiochem, Nottingham, UK	539134
ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2383
AMP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY	14-840
Nrf2 (WT)	Abnova, Taipei City, Taiwan	H00004780-P01
[γ-32P]-ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA	NEG502A
EZblue staining reagent	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1041
Pfu turbo DNA polymerase	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	600250
dNTP mix	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	200415-51	Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI	New England Biolabs, Ipswich, MA	R0176S
LB broth	Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands	L1704
Ampicillin	Affymetrix, Santa Clara, CA	11259
Agarose LE	iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan	QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	161-0400
Bovine Serum Albumin	Bovogen Biologicals, Victoria, Australia	BSA100
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare, Marlborough, MA	17-0756-01
Acetic Acid glacial	Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol	Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea	5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare, Marlborough, MA	28-9558-09
SDS-PAGE kit	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	1658001FC
Vacuum pump	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-178
Gel dryer	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-1746
Dancing shaker	FINEPCR, Seoul, Korea	CR300	The machine is needed for washing step
PCR machine	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	T100
Incubator/shakers	N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea	NB-205L
Microcentrifuges	LABOGENE, Seoul, Korea	1730R
Chromatography columns	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	732-1010