Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

Résumé

Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.

Résumé

Structure secondaire de l’acide nucléique non canonique G-quadruplexes (G4) sont impliqués dans divers processus cellulaires, telles que la réplication de l’ADN, transcription, ARN et l’allongement des télomères. Au cours de ces processus, diverses protéines se lient et résoudre les structures G4 pour remplir leur fonction. Comme la fonction G4 dépend souvent de la stabilité de sa structure repliée, il est important d’étudier comment les protéines liant le G4 régulent la stabilité du G4. Ce travail présente une méthode pour manipuler les molécules G4 uniques à l’aide de la pince à épiler magnétique, qui permet des études de la régulation des protéines liant le G4 sur une seule molécule G4 en temps réel. En général, cette méthode consiste à une étendue des applications dans les études des interactions entre protéines/ligands et des règlements sur diverses structures secondaires d’ADN ou d’ARN.

Introduction

Quatre brins ADN ou ARN G4 structures jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques importants¹. Beaucoup de protéines est impliquées dans la liaison G4 et de règlement, y compris les protéines de liaison des télomères (télomérase, POT1, TEBPs, RPA, TRF2)^1,2, facteurs de transcription (nucléoline, PARP1)³, protéines (hnRNP A1, ARN hnRNP A2)⁴et réplication de l’ADN hélicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVT, Dna2, Pif1)⁵associés protéines (Rif1, REV1, PrimPolymerase)⁶. La liaison aux protéines peut stabiliser ou déstabiliser les structures G4 ; ainsi réguler les fonctions biologiques ultérieures. La stabilité du G4 a été mesurée par thermal fusion à l’aide de rayons ultraviolets (UV) ou de méthodes de dichroïsme circulaire (DC)⁷. Toutefois, ces conditions ne sont pas physiologiques pertinentes et sont difficiles à appliquer à l’étude des effets de liaison des protéines⁷.

Le développement rapide des technologies de manipulation de la molécule unique a permis à des études de pliage et dépliage d’une biomolécule, tel qu’un ADN ou une protéine, à un niveau de molécule unique avec une résolution nanométrique en temps réel⁸. Microscopie à force atomique (AFM), pinces optiques et magnétiques pincettes sont les méthodes de manipulation de la molécule unique plus couramment utilisés. Par rapport à l’AFM et pinces optiques⁹, pincettes magnétiques permettent des mesures stables de pliage-dépliage de la dynamique d’une seule molécule au cours des jours en utilisant une technique de anti-dérive^10,11.

Ici, une plate-forme de manipulation de la molécule unique à l’aide de pincettes magnétiques pour étudier la régulation de la stabilité du G4 par des protéines de liaison est signalé^12,13. Cet ouvrage décrit les approches de base, y compris les échantillon et flux de préparation de canal, le programme d’installation de pinces magnétiques et la calibration de la force. Le contrôle de la force et les protocoles anti dérive comme décrit dans étape 3 permettent depuis longtemps des mesures de temps sous les divers contrôles de force, comme la force constante (pince de force) et constante de chargement note (force-ramp) et mesure de force-saut. Le protocole d’étalonnage de force décrit à l’étape 4 permet la calibration de la force de < 1µm sangles courtes sur une large force allant jusqu'à 100 pN, avec une erreur relative au sein de 10 %. Un exemple de règlement de la stabilité de l’ARN hélicase associée AU riche en élément (RHAU) hélicase (alias DHX36, G4R1) qui joue un rôle essentiel dans la résolution de que RNA G4 est utilisé pour démontrer les applications de cette plate-forme¹³.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. préparation de l’ADN G4 pour seule molécule Stretching

1. Prepare 5 '-thiol étiquetés et 5 '-biotine étiqueté dsDNA poignées par PCR à l’aide de polymérase DDNA sur une matrice d’ADN de phage lambda à l’aide de 5 '-thiol et 5 '-biotine amorces ¹⁴ ( Figure 1). Les deux poignées de dsDNA ont haute teneur en GC (> 60 %) pour éviter l’ADN fonte lorsque l’ADN est maintenu à des forces ou au cours de l’insuffisance de l’ADN de transition ¹⁵.
2. Les produits de PCR purifier à l’aide d’un kit de purification commerciale et digest avec BstXI des enzymes de restriction selon le fabricant ' protocole de s.
3. G4 ligate formant ADNsb et flanc ADNsb et dsDNA handles à l’aide de T4 DNA ligase selon le fabricant ' protocole s. Purifier le produit ligaturé en gel extraction à l’aide d’un kit de purification commerciale selon le fabricant ' protocole de s.

2. Préparation du canal d’écoulement

1. lamelle nettoyage et fonctionnalisation de surface
   1. lieu bas lamelles couvre-objet (#1.5, 22 × 32 mm) et albums lamelles couvre-objet (#1.5, 20 x 20 mm) dans le couvercle en verre bocaux (chaque pot peut contenir 7 morceaux de lamelles, de coloration le volume est de ~ 20 mL). Rincer les lamelles dans les bocaux avec l’eau distillée, 2 - 5 fois.
   2. Ajouter ~ 20 mL de solution détergente de 5 à 40 % dans chaque pot et puis les placer dans un bain de nettoyage ultrasonique pour 30 min. Rincer à l’eau distillée pour > 10 fois pour enlever le détergent.
   3. Sécher les lamelles dans les pots au four (~ 150 ° C. Attention, chaud), ou de gaz ₂ N. Stocker les lamelles albums séchés dans un placard sec.
   4. Plasma utilisation (O ₂ gas) pour nettoyer les lamelles dans le bocal pendant 10 min. Au cours des 10 minutes, préparation 20 mL de solution à 1 % (3-Aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans le méthanol (attention, toxique/inflammables). Utiliser une hotte chimique pour dissoudre APTES dans le méthanol.
      NOTE : Éviter l’humidité lors du stockage solution APTES. Selon vieux souvent pose problème dans la fonctionnalisation de surface lamelles.
   5. Immédiatement après le plasma nettoyage, ajouter toute la solution selon de 1 % dans les bocaux et incuber pendant 1 h. verser les déchets dans la bouteille déchets spécifique pour le méthanol selon 1 %. Effectuez les opérations axées sur le méthanol dans la hotte de laboratoire pour les produits chimiques inflammables.
   6. Rincer les bocaux une fois avec du méthanol et > 10 fois avec l’eau distillée et séchez-les de four (~ 150 ° C ; Attention, chaud). Stocker les lamelles selon-enduit de fond dans un placard sec, si ce n’est en cours d’utilisation pendant deux semaines.
      Remarque : Après chaque étape secondaire de 2.1.1 à 2.1.4, le processus de nettoyage peut être interrompu avant la prochaine étape.
2. Assemble le canal d’écoulement
   1. préparer deux " entretoises ", c.-à-d. parafilm ou double-face ruban (~ 4 × 20 mm) pour chaque canal. Placez les deux morceaux d’entretoises sur une lamelle de fond le long du bord long. Placez une lamelle supérieure sur l’entretoise, formant des cellules de circulation entre les deux (~ zone de 10 × 20 mm, Figure 2 a , B).
   2. Si parafilm est utilisé comme entretoise, placer le canal d’écoulement sur un appareil de chauffage (60-120 ° C ; Attention, chaud) pour 5-10 s tout en appuyant doucement sur les côtés de la lamelle supérieure à coller les deux lamelles de parafilm. Le canal d’écoulement qui en résulte a une hauteur de ~ 100 µm, et est ainsi le volume du canal ~ 20 µL.
   3. Joint le côté long de la chaîne avec la colle silicone pour éviter les fuites. Utiliser de la colle de silicone pour faire une petite structure d’évier-comme à chaque bord ouvert du chenal de flux, qui sert comme une entrée et une sortie de la solution.
      NOTE : L’entrée et la sortie peuvent également par d’autres manières, par exemple, par l’adhérent aux petits anneaux en plastique à l’aide de cire.
   4. Stocker des chaînes dans un placard sec jusqu'à 4 semaines.
3. ADN d’attache sur la surface du fond du chenal d’écoulement
   1. diluer les billes de polystyrène amino-enduit (diamètre : 3 µm) par 200 X en distillée 1 X tampon phosphate saline tampon (PBS). Vortex la solution de perle et puis écoulement dans les canaux. Incuber la solution perle dans les canaux pour ~ 30 min. retirer tout perles décollées en lavant avec 200 µL de solution tampon PBS de X 1.
   2. Ajuster (hausse ou baisse) le temps d’incubation pour atteindre une densité de surface de 1-5 perles par surface de 50 x 50 mm. Stocker les chaînes avec les perles de référence a été déposés pendant 3 jours.
   Sulfosuccinimidyl
   3. diluer 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-CCAP) en poudre dans 1 solution de PBS de X (~ 0,5 mg/mL). Vortex la solution et puis couler dans le canal.
      NOTE : Préparer une solution Sulfo-CCAP fraîche avant de l’utiliser et ajouter immédiatement à la chaîne pour éviter l’hydrolyse du CCAP.
   4. Incuber la solution CCAP dans le canal pendant 30 min. enlever la solution de CCAP en lavant avec une grande quantité (1 mL, ~ 50 X le volume du canal) de 1 solution de PBS de X.
      Remarque : Le laver soigneusement le CCAP excès. Cette étape est essentielle pour la liaison de l’ADN sur la lamelle couvre-objet.
   5. ADN attacher
      1. diluer la thiol-biotine appelée ADN dans 1 X PBS, avec une concentration d’ADN résultante de ~ 0,3 nM. Pipetez doucement pour mélanger la solution, la solution d’ADN se jettent dans le canal de CCAP-enduit et incuber 30 min à température ambiante (~ 23 ° C).
   6. Laver doucement les ADN gratuit avec 200 µL de solution qui contient 1 X PBS avec 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,01 % de 2-mercaptoéthanol de blocage.
   7. Bloquer la surface du canal en incubant le canal en bloquant la solution (10 mg/mL de BSA, 0,01 % de 2-mercaptoéthanol) pour > 2 h ; après cette étape, le canal est prêt pour des expériences. Le canal préparé peut être conservé à 4 ° C pendant ~ 1 jour.
      NOTE : La blocage étape est importante pour réduire les liaisons non spécifiques de l’ADN et des billes magnétiques pour les lamelles couvre-objet.

3. DsDNA pincettes Setup et Identification of Single magnétique d’attache

1. installation de pincettes magnétiques
   1. début le magnétique pincettes contrôlent le programme. Ici, les pinces magnétiques étaient contrôlées par un programme LabVIEW écrit in-house.
   2. Aligner les centres de l’aimant devant la chaîne de montage. Utiliser un objectif 4 X pour régler les axes x et y des aimants dans l’axe optique du microscope.
   3. Utiliser un manipulateur motorisé commandé par ordinateur pour déplacer les aimants le long de l’axe z ( Figure 2 a) et régler la distance d = 0 (d : distance entre les aimants et la lamelle couvre-objet) lorsque les aimants joins à une lamelle sur le microscope.
   4. Programmer le mouvement des aimants par celui qui les manipule pour obtenir un contrôle de la force, y compris la force constante (c.-à-d., la constante d) et variables dans le temps la force F (t) (c.-à-d., variables dans le temps d(t )).
   5. Utiliser lumineux une source lumineuse à diodes électroluminescentes (LED) pour l’éclairage arrière-dispersés de la perle à travers l’objectif. Recueillir les images de perle à une fréquence d’échantillonnage de 100 Hz par un dispositif à couplage de charge (CCD) caméra. < / lJ’ai >
2. échantillon d’installation et d’identifier d’ADN double brin unique attache
   1. formation d’attache
      1. doucement les flux en 200 X dilué M-280, paramagnétiques perles dans une solution de test (100 mM KCl, 2 mM MgCl ₂, 10 mM Tris-pH 7,4 ) dans un canal. Incuber pendant 10 min permettre les perles lier aux molécules d’ADN biotine-étiquetés immobilisés sur la surface enduite CCAP jusqu'à la fin de thiol-étiqueté. Laver doucement les perles non attachés à l’aide de 200 µL de solution de réaction standard.
         Remarque : Les perles de M-280 montrent inférieur non-spécifiques à la surface par rapport aux autres billes magnétiques commerciaux tels que M-270.
   2. Monter la chaîne sur la platine du microscope. Recherche de la perle sur la surface inférieure en utilisant 100 X objectif à immersion d’huile.
   3. Choisir une perle de référence sur la surface et une perle captif mobile. Construire les bibliothèques de l’image initiale de la perle de référence et talon captif à défocalisation différents avions.
   4. Calibration d’image de perles
      1. avant les expériences, utiliser un actionneur piézo-électrique objective d’obtenir des images de référence et perles attachés aux plans différents défocalisation espacées de 20 à 50 nm, qui sont stockés sous forme de deux images distinctes perle bibliothèques et sont respectivement indexé avec la distance de défocalisation ( Figure 2D).
   5. x, y, détermination de position z
      1. au cours d’expériences, déterminer la position du talon dans le plan x-y par le centre de gravité de perle. Déterminer la variation de la hauteur du talon captif en comparant l’image actuelle de la perle avec ceux stockés dans la bibliothèque. Utiliser l’analyse de fonction d’autocorrélation du spectre de puissance de la transformée de Fourier de la perle images ¹⁶.
   6. Anti-dérive feedback avec filet référence
      1. au cours d’expériences, utiliser le piezo à " serrure " la distance entre l’objectif et une image de perle de référence spécifique stocké dans la bibliothèque grâce à une faible fréquence contrôler vos commentaires, afin que l’image de la perle coincé a la meilleure corrélation avec une image spécifique, stockée dans la bibliothèque ( Figure 2D).
   7. Déterminer si la sangle est une molécule d’ADN double brin unique en appliquant ~ 65 AP force déterminer une molécule d’ADN double brin unique si la sangle subit l’ADN caractéristique surexploiter transition ^{17 , 18 , 19}. Répétez le processus jusqu'à ce qu’une sangle unique dsDNA est trouvée. (Veuillez vous reporter à la section suivante pour la calibration de la force et l’ADN surexploiter la transition).

4. Étalonnage de forcer pincettes magnétiques

1. déterminer directement la force (jusqu'à 100 pN) de longues molécules de (ADN λ bp 48 502) d’ADN à l’aide de la fluctuation de la perle à travers :
   
   , où k _B est la constante de Boltzmann, T est la température à l’échelle de Kelvin, δ ² _y est la variance de la fluctuation de perle dans la direction perpendiculaire au champ magnétique et la force direction. Dans ce sens, le mouvement du talon peut être décrite comme une fluctuation de la pendule d’une longueur de l + r ₀, où l est la distance de bout en bout le long de la direction de la force (extension) de l’ADN, et r ₀ est le rayon de la perle ¹⁰ ( Figure 3 a).
2. Déterminer la courbe d’étalonnage pour la force F en fonction des aimants à distance talon d et F (d) pour différentes perles en utilisant l’ADN long de λ. Habituellement, la distance entre l’aimant et la lamelle est utilisée comme l’ADN de la longueur d’attache peut être ignoré. Monter le F-d courbe de la fonction exponentielle double décomposition :
   
   , où le raccord paramètres α1, α2, γ1, γ2 sont déterminées par le pince magnétique et le paramètre C est déterminée par la propriété hétérogène des billes magnétiques. En déplaçant le C, le F-d courbe obtenue à partir des perles différentes peut être superposées ¹⁰ ( Figure 3 b).
3. Calibration du paramètre C pour des billes magnétiques pour l’ADN courte expériences.
   1. La détermination de la force en se basant sur la fluctuation nécessite la position de perle à une fréquence plus élevée que la fréquence d’enregistrement :
      
      , où γ est la traînée coefficient de la perle. Pour courts d’ADN à grande force, il faut enregistrement fréquence plus vite que le 100 Hz, par conséquent, la force ne peut pas être mesurée directement basée sur la fluctuation avec l’appareil photo. Toutefois, le paramètre C peut être déterminé en mesurant la force à une faible force gamme (< 15 pN) à l’aide de fluctuation et ajustement des données avec un calibré F-courbe d obtenir le paramètre C ²⁰.
   2. Alternativement, pour des expériences avec l’ADN double brin, déterminer le paramètre C en utilisant l’ADN surexploiter la transition à une force de ~ 65 AP ( Figure 3) ^{21 , 22 , 23} en enregistrant la position d à quel saut en extension a montré dsDNA (0,6 X augmentation de longueur de longueur contour). Après avoir déterminé le paramètre C, calculer la force pour les perles captifs.
4. Contrôler le taux de charge en programmant le mouvement des aimants par le biais de la fonction inverse de F (d). L’aimant doit approcher l’échantillon double exponentielle.
   Remarque : L’erreur relative de la force déterminée par une méthode d’extrapolation est ~ 10 % et est principalement due à la perle d’hétérogénéité rayon ²⁰.

5. Manipulation de la molécule unique de G4 en présence et en Absence de protéines de fixation

1. Force-rampe expériences
   1. après avoir identifié la sangle de l’ADN double brin, effectuer une analyse de la force-augmentation à un taux de charge de 0,2 pN/s suivie d’une analyse de la force-décès à -0,2 pN/s. Après chaque cycle étirement, tenez la molécule d’ADN à 1 pN pendant 30 s pour permettre à l’ADN simple brin à replier à G4.
2. Force-saut expériences
   1. passer la force d’un pN 54 pendant 30 s en vertu de laquelle un G4 plié peut être déplié et 1 AP pour 60 ans, en vertu duquel un plié G4-15 t pouvait replier.
3. Solution protéique Flowing
   1. couler la solution protéique quand à ~ 20 AP force pour éviter l’attachement des perles à la lamelle. L’hélicase RHAU DEAH-box, qui a montré la grande spécificité de la structure du G4, a été utilisé ²⁴. Le recombinant helicase RHAU (DmRHAU) de Drosophila melanogaster est exprimé chez Escherichia coli et purifié comme décrit plus haut ²⁵. Le G4 activité déroulement de DmRHAU a été testée sur un tétramoléculaire G4 ADN substrat ¹³.
4. Analyser la force qui se déroule à l’aide d’un interne écrit Matlab programme ¹⁴.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Le montage pour étirer une seule molécule G4 est illustré à la Figure 4. Une séquence de formation G4 monocaténaire durée entre deux poignées de dsDNA était attachée entre un lamelle couvre-objet et un talon paramagnétique. Pour trouver une perle captif dsDNA unique, un dosage overstretching a été réalisé en augmentant la force à des taux de charge constante. Trois types de mesures ont été souvent utilisés pour étudier le pliage et le dép...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Comme décrit ci-dessus, une plate-forme pour l’étude de la stabilité mécanique de l’ADN du G4 et les interactions de protéine à l’utilisation de G4 seule molécule pincettes magnétiques est signalée. Accompagnant la plate-forme, des protocoles très efficaces de trouver l’attache d’ADN G4 et mesure de la dynamique de pliage-dépliage et la stabilité de la structure de G4 avec résolution spéciale nanomètres sont développés. Le blocage du plan focal permet un contrôle anti-dérive très stable, ce ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA PCR primers	IDT		DNA preparations
DNA PCR chemicals	NEB		DNA preparations
restriction enzyme BstXI	NEB	R0113S	DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)	BMH.BIOMEDIA	72204	flow channel preparation
Decon90	Decon Laboratories Limited		flow channel preparation
APTES	Sigma	440140-500ML	flow channel preparation
Sulfo-SMCC	ThermoFisher Scientific	22322	flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin	ThermoFisher Scientific	11205D	flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm	Polysciences, Inc	17145-5	flow channel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250-250ML	flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71	Olympus	IX71	Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721	Physik Instrumente	P-721	Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X	Olympus	MPLAPON-Oil 100X	Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera	AVT	Pike F-032B	Magnetic tweezers setup
Translation linear stage	Physik Instrumente	MoCo DC	Magnetic tweezers setup
LED	Thorlabs	MCWHL	Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets	Supermagnete		Magnetic tweezers setup
Labview	National Instruments		Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab	OriginLab/MathWorks		Data analysis