Une Technique de Squash de tube séminifère pour l’analyse cytologique de la spermatogenèse en utilisant le modèle de souris

Résumé

L’objectif de cette technique de courge tubule est d’évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de mettre au point les spermatocytes de souris tout en préservant l’intégrité cellulaire. Cette méthode permet l’étude de toutes les étapes de la spermatogenèse et peut être facilement mis en œuvre aux côtés d’autres approches biologiques biochimiques et moléculaires pour l’étude de la méiose de souris.

Résumé

La progression méiotique chez les mâles est un processus qui exige l’action concertée d’un certain nombre d’événements cellulaires très réglementés. Erreurs qui se produisent au cours de la méiose peuvent mener à l’infertilité, perte de grossesse ou des anomalies génétiques. Commençant au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte, des ondes continues semi-synchrone des spermatocytes subissent la spermatogenèse et finalement forment les spermatozoïdes haploïdes. La première vague des spermatocytes de souris en cours de méiose initiation apparaissent au jour 10 après l’accouchement (10 dpp) et sont libérés dans la lumière des tubules séminifères comme les spermatozoïdes matures à 35 dpp. Par conséquent, il est avantageux d’utiliser des souris dans cette fenêtre de temps du développement afin d’obtenir des populations fortement enrichies d’intérêt. Analyse des étapes de rares cellules est plus difficile chez les souris âgées grâce à l’apport de la spermatogenèse vagues successives, qui augmentent la diversité des populations cellulaires dans les tubules. La méthode décrite ici est une technique facilement mis en œuvre pour l’évaluation cytologique des cellules trouvées dans les tubules séminifères des souris, y compris les spermatogonies, les spermatocytes et les spermatides. La technique de courge tubule maintient l’intégrité des cellules germinales des mâles isolés et permet l’examen des structures cellulaires qui ne sont pas facilement visualisés avec d’autres techniques. Pour illustrer les applications possibles de cette technique de courge tubule, l’axe a été suivie dans les spermatocytes progresse par le biais de la prophase à la métaphase qu'i de transition (transition G2/MI). En outre, duplication du centrosome, inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) et formation de bouquet de chromosomes ont été évalués comme exemples des structures cytologiques que l'on peut observer à l’aide de cette méthode de squash du tubule. Cette technique peut servir à repérer les défauts spécifiques au cours de la spermatogenèse qui résultent de la mutation ou perturbations exogènes, et contribue ainsi à notre compréhension moléculaire de la spermatogenèse.

Introduction

La méiose est un événement cellulaire complexe dans lequel un rond simple de réplication de l’ADN est suivi de deux cycles successifs de la division cellulaire. Plusieurs événements spécifiques à la méiose doivent être coordonnés au cours des stades de la méiose pour assurer la ségrégation des chromosomes précis. Ces événements comprennent l’achèvement de la recombinaison, orientation Co de sœur kinétochores au cours de la première division méiotique et la perte progressive des cohesin complexes pour résoudre les chiasmes entre homologues. Régulation précise de ces processus est nécessaire pour maintenir la fertilité et d’empêcher les événements de missegregation de chromosomes qui peuvent conduire à des troubles du développement génétiques et une fausse couche¹.

Tandis que les principaux événements de la méiose ont lieu chez les mâles et les femelles, des différences temporelles et mécanistes significatives existent entre la spermatogenèse et l’ovogenèse². Par exemple, au cours de la méiose femelle, prophase I se produit durant le développement embryonnaire et arrête au stade de la dictyate jusqu'à la puberté. En revanche, la spermatogenèse débute à la puberté et progresse dans les vagues tout au long de la vie d’adulte sans arrêt. Les différences entre mâle et femelle de la méiose met l’accent sur la nécessité de développer des méthodes qui sont spécifiquement pris en charge vers l’évaluation de ces processus dans les spermatocytes et les ovocytes. Actuellement, évaluer la progression méiotique en grande partie repose sur l’utilisation de la chromatine se propage^3,4,5. Alors que les écarts de la chromatine sont utiles pour étudier les chromosomes méiotiques, ils ne parviennent pas à préserver l’intégrité cellulaire, empêchant l’évaluation des structures cellulaires tels que les microtubules du fuseau, centrosomes, l’enveloppe nucléaire et pièces jointes télomère. Imagerie en direct et des techniques de culture à long terme ont grandement contribué à améliorer notre compréhension de la méiose femelle ; des approches similaires pour visualiser toute la cellule intacte, cependant, sont moins fréquemment mis en oeuvre pour l’étude de la spermatogenèse^6,7. Afin de visualiser les événements dynamiques tout au long de la méiose mâle, nous avons adapté des techniques de courge tubule établies pour évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de développer souris spermatocytes^8,9. La méthode décrite ici préserve l’intégrité de la cellule, permettant l’étude des multiples structures cellulaires au cours de différentes étapes de la spermatogenèse.

Cette technique de courge tubule est une approche de cellules entières, ce qui permet pour l’évaluation des structures cellulaires par l’intermédiaire de la microscopie par immunofluorescence. Les approches histologiques communes de visualiser la progression méiotique chez les souris mâles comme hématoxyline et éosine coloration des testicules de paraffine incorporé, en les étiquetant par immunofluorescence des cryosections permettent une vue d’ensemble de la progression de la méiose. Toutefois, ces techniques ne parviennent pas à résoudre les cellules individuelles dans la mesure nécessaire pour une analyse détaillée des événements qui se produisent tout au long de la méiose^10,11. Des techniques alternatives de visualiser les processus méiotiques dépendent de perturbation significative chimiosmotique le spermatocyte pour isoler et fixer les matières nucléaires^3,4,5. Ces traitements chimiques empêchent l’observation des types de cellules autres que les spermatocytes primaires. Une méthode décrite récemment par Namekawa a permis à la communauté des chercheurs afin de préserver l’architecture nucléaire des spermatocytes isolés, mais nécessite l’utilisation d’un cytospin et accessoires qui ne sont peut-être pas facilement disponibles pour certains laboratoires⁴. En revanche, la technique de courge tubule requiert seulement l’équipement qui est généralement standard dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire.

La méthode de courge tubule décrite ici permet de visualiser les types de cellules diverses trouvées dans le tube séminifère, y compris les cellules de sertoli, spermatogonies, spermatocytes primaires et secondaires et les spermatides. En couplant cette technique avec la première vague près-synchrone de la spermatogenèse chez les jeunes souris, il est possible d’obtenir des populations enrichies de cellules spermatogéniques mesure qu’ils progressent à travers la méiose¹². Ce processus permet l’analyse détaillée des processus tout au long de la spermatogenèse, tels que les événements précoces de la prophase, le G2/MI et métaphase aux transitions de l’anaphase et la spermiogenèse. En outre, les préparations tubule peuvent être utilisées pour visualiser les caractéristiques cytologiques des chromosomes (par exemple les domaines proposition (DCI) et les kinétochores) et les centrosomes (centrioles et péricentriolaire matériel/matrices). La méthode de courge peut être facilement effectuée en parallèle avec d’autres approches expérimentales, telles que la chromatine se propage et extraction de protéine. En outre, cette technique a été correctement modifiée pour déposer les cellules spermatogéniques vivantes sur les diapositives pour visualisation directe¹³.

La méthode décrite ici implique une technique de squash de tube séminifère germes entiers afin d’analyser la transition G2/MI chez les souris C57BL/6J de type sauvage. Les caractéristiques cytologiques de spermatocytes primaires entrant dans la première division méiotique ont été visualisés à l’aide de la microscopie par immunofluorescence pour observer le fuseau méiotique. Cette technique polyvalente peut être facilement modifiée pour visualiser les autres stades de la méiose et les différents types de cellules. La technique est également susceptible de stratégies alternatives de visualisation, comme les approches d’ADN et ARN poisson.

Protocole

L’utilisation de la souris a été approuvée par le Comité utiliser de Johns Hopkins University et d’institutionnels animalier. Expériences ont été effectuées sur le jeune (20-26 jours après l’accouchement, dpp) souris C57BL/6J, profitant de la première vague semi-synchrone de la spermatogenèse. Cependant, cette technique peut également être réalisée utilisant des souris adultes.

1. la dissection et l’isolement des tubules séminifères souris

1. Préparer le fix/solution et anticorps dilution tampon de lyse (ADB) décrit dans le tableau 1 et tableau 2.
2. Préparer un plat de Pétri de 35 mm avec 3 mL de 1 x tampon phosphate salin (1 x PBS, pH 7,4) et un autre plat de 35 mm avec 2 mL de solution de correctif/lyse par souris.
3. Sacrifier la souris via la dislocation cervicale ou CO₂ asphyxie et pulvériser l’abdomen ventral avec l’éthanol à 70 %. Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faire une ouverture en forme de V. Puis retirer les testicules en tirant sur les coussinets adipeux épididymaires avec une pincette et ne pas perturber l' albuginée. Placer les testicules dans un 35 mm boîte de Pétri contenant 1 x PBS.
   Remarque : Utiliser la première vague de la spermatogenèse afin d’observer une population de cellules enrichies d’intérêt¹⁴. Des étapes spécifiques de la spermatogenèse sont enrichies à des âges différents de la souris (tableau 3).
4. Retirer testicule albuginée perforera le tissu avec une pince bout pointu et récupérer les tubules séminifères lâches. Transférer les tubules vers un nouveau 35 mm boîte de Pétri contenant 2 mL de solution fix/lyse.
5. Incuber les tubes dans la solution fix/lyse pendant 5 min à température ambiante.

2. préparation des tubules séminifères

1. Préparer une lame de verre revêtu de poly-L-lysine en décrivant les bords de la lame avec un stylo liquide bloqueur.
2. Déposer 100 µL de solution fix/lyse au centre de la lame de verre.
3. À l’aide de la pince stérile et ciseaux distinguer doucement les tubules séminifères. Découpage de tubule individuel des segments environ 20 mm de longueur.
   Remarque : Pour visualiser les structures qui sont sensibles à une exposition prolongée fixateur, tels que les centrosomes, séparer les tubules d’abord dans du PBS 1 x, puis émincer directement les tubules sur la surface de la glisse poly-lysine enduite dans 100 µL de solution fix-lyse.
4. Transfert en cinq segments de tube séminifère long de 20 mm à la diapositive de verre poly-L-lysine préparés contenant la solution fix/lyse.
5. À l’aide de ciseaux stériles viande hachée tubules séminifères en segments de 1,5 à 3,0 mm.
6. À l’aide de pince stérile arrange les segments tubulaires sur la lame de verre de sorte qu’aucun tissu ne chevauche, et les tubules sont distribués uniformément.
   Remarque : Le nombre optimal de segments tubulaires sur une lame de verre est entre 20 et 40.

3. l’écrasement des tubes séminifères

1. Transférer la lame de verre contenant des segments de tube séminifère dispersés sur une paillasse. Retirer le liquide en excès à l’aide d’une lingette de laboratoire pour éviter de perdre des tissus au cours de l’étape de la courge.
2. Appliquez un lamelle couvre-objet (22 x 60-1, 5 mm) sur le dessus de la lame de verre et appliquer une pression avec le talon de la paume pendant 10 à 20 secondes. Il est important d’appliquer suffisamment de force pour disperser les spermatocytes de tubules séminifères.
   Remarque : Observer les tubules à l’aide d’un microscope à dissection afin d’optimiser l’étape squashing afin que tous les segments tubulaires sont perturbées.
3. À l’aide de pinces de diapositive, immédiatement flash freeze la lame de verre dans un petit dewar de la liquide N₂ pendant 15 secondes, ou jusqu'à ce que le liquide cesse à bouillonner. Si immunomarquage immédiatement, retirer la lamelle avec un grattoir à lame droite, fine pince de pointe ou aiguille de calibre 21.
   Remarque : Pour des résultats optimaux, marquer les diapositives immédiatement (voir étape 4). Toutefois, à ce stade diapositives peuvent être conservés à-80 ° C pendant deux semaines. Pour maximiser la durée de vie des protéines et des structures cellulaires, immédiatement stocker la glisse sur neige carbonique ou transfert à un congélateur à-80 ° C et garder la lamelle couvre-objet sur la diapositive. Immunomarquage conservé diapositives, retirer le couvre-objet en immergeant les diapositives de liquide N₂ pendant 15 secondes, comme indiqué au point 3.3.

4. l’immunomarquage des tubules séminifères montés

1. Plonger la lame dans 1 x PBS et laver trois fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
   Remarque : Ne jamais laisser les lames à sécher pendant l’immunomarquage.
2. Appliquer 1 mL de tampon de dilution des anticorps sur la lame de verre pour bloquer pendant 1-2 h dans une chambre humidifiée.
3. Retirer le tampon de dilution des anticorps et déposer 100 µL de l’anticorps primaire dilué dans du tampon de dilution des anticorps dans une chambre humidifiée.
   Remarque : Pour de meilleurs résultats, incuber les anticorps primaires durant la nuit à 4 ° C. Utiliser les petites quantités d’anticorps (par ex. 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm. Valider et optimiser les anticorps primaires¹⁵.
4. Rincer les lames trois fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
   Remarque : Pour améliorer les lavages, agiter Coplin jars en utilisant une barre de petite agitation magnétique et placer sur une plaque d’agitation magnétique à faible vitesse ou placer la coloration sur une table de mixage table à basse vitesse.
5. Déposer 100 µL de l’anticorps secondaire dilué dans du tampon de dilution des anticorps pour 1 à 1,5 h dans une chambre humide à température ambiante. Incuber les lames dans une boîte sombre pour éviter photo blanchiment du fluorophore conjugué anticorps.
   Remarque : Utiliser les petites quantités d’anticorps (par ex. 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm.
6. Rincer les lames deux fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
7. Monter les lames dans le milieu de montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) et d’appliquer des lamelles couvre-objet (22 x 60-1, 5 mm).
8. Sceller les lamelles couvre-objet pour les lames avec des vernis à ongles transparent pour préserver les diapositives et empêcher que les lamelles couvre-objet.

5. analyse et préparations d’imagerie tubule

1. Utiliser un microscope à épifluorescence avec scène automatisé qui permet le mouvement d’axe z précis et une caméra à haute résolution pour la capture de l’image. Vous pouvez également utiliser un microscope confocal laser.
   Remarque : Utiliser n’importe quel matériel disponible et des logiciels pour cette étape. Par exemple, les images affichées dans la Figure 1 et Figure 2 ont été capturés à l’aide d’une cellule Zeiss observateur Z1 relié à une caméra CMOS 4.0 ORCA-Flash et analysées avec le logiciel d’image edition Zeiss ZEN 2012 bleu.
2. Évaluer les diapositives à l’aide d’un objectif 20 X pour déterminer la qualité de la préparation de la courge. Diapositives de bonne qualité ont une monocouche de noyaux qui sont réparties uniformément.
   Remarque : Certaines sections de la diapositive peuvent être mieux que d’autres, il est utile de noter les coordonnées d’où se trouvent les meilleures régions de la diapositive pour une analyse ultérieure en utilisant un grossissement supérieur.
3. À l’aide d’objectif grossissement plus élevé (p. ex. 63 X ou 100 X), les régions de capture de la diapositive qui ont une monocouche cohérente des noyaux. Une fois qu’une zone est sélectionnée, la valeur de la partie supérieure et abaissez Z-piles pour s’assurer que toute la lumière mise au point est capturée.
   Remarque : Le nombre optimal de Z-piles capturé entre les limites supérieure et inférieure est généralement désigné par le logiciel d’acquisition image et est différent pour chaque objectif.
4. Utilisez le logiciel de traitement d’image pour compiler une image de focus profondeur étendue. Le logiciel combine la mise au point lumière de chaque pile-Z et est essentiel pour l’imagerie optimale des préparations du tubule.

Résultats

Ici, nous avons utilisé la méthode de squash de tubule de visualiser des populations de cellules transitoires en cours de la prophase à la métaphase I (G2/MI) transition, qui ont été enrichies par la récolte des testicules de souris de type sauvage juvéniles en cours de la première vague de la spermatogenèse (24 DPP). La figure 1 illustre les images représentatives des différentes étapes de la cellule qui peuvent être visualisés en utilisant la...

Discussion

Souris ont prouvé d’être un organisme modèle utile pour étudier les événements cellulaires qui régissent la méiose progression au cours de la spermatogenèse. En outre, il est nécessaire de développer des outils pris en charge à l’étude de la spermatogenèse parce que beaucoup d’événements, tels que sortir de la prophase méiotique, j’ai, sont sexuellement dimorphe. Ce protocole décrit une méthode de courge tube séminifère pour la visualisation et l’étude des différentes étapes de la sperma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous	Electron Microscopy Sciences (EMS)	15710
10x PBS	Quality Biological	119-069-161
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Sigma	A1470
Horse Serum	Sigma	H-1270
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated	CellTreat	P886-229638
Poly-L-lysine coated glass slides	Sigma	P0425-72EA
Liquid Blocker Pen	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71310
Humid Box	Evergreen	240-9020-Z10
Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides	Fisher	08-813E
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Microscope Cover Slides (22mmx60mm)	Fisher	12-544-G
Clear Nail Polish	Amazon	N/A
Microsopes
Name	Company	Catalog Number	Comments
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss	4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition image software	Zeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS camera	Hamamatsu
Primary Antibodies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse anti-SYCP3	Santa Cruz	sc-74569	1 in 50
Rabbit anti-SYCP3	Fisher (Novus)	NB300-231	1 in 1000
Goat anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	1 in 50
Human anti-Centromere Protein	Antibodies Incorporated	15-235	1 in 100
Mouse anti-alpha tubulin	Sigma	T9026	1 in 1000
Mouse anti-AIM1	BD Biosciences	611082	1 in 200
Mouse anti-γH2AX	Thermo Fisher	MA1-2022	1 in 500
Mouse anti-CENT3	Abnova	H00001070-M01	1 in 200
Rabbit anti-pericentrin	Abcam	ab4448	1 in 200
Rabbit anti-REC8	Courtesy of  Dr. Karen Schindler	N/A	1 in 1000