Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Résumé

Candida albicans est le plus commun champignon pathogène de l’homme, provoquant environ 15 % des cas de septicémie nosocomiales. Un attribut de virulence majeur de c. albicans est sa capacité à forme biofilms, les communautés structurées de cellules attachées aux surfaces biotiques et abiotiques. C. albicans biofilms peuvent se former sur les tissus de l’hôte, telles que les couches muqueuses et sur les dispositifs médicaux, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et prothèses conjointes. Biofilms posent des défis cliniques importants parce qu’ils sont très résistants aux perturbations physiques et chimiques et peuvent agir comme réservoirs de graines disséminées des infections. Divers essais in vitro ont été utilisés pour étudier la formation de biofilm de c. albicans , tels que des essais de plaque de microtitration, poids sec, les analyses de viabilité de cellules et microscopie confocale à balayage de laser. Tous ces tests sont essais de point d’arrêt simple, où la formation de biofilm est évaluée à un moment précis. Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la formation de biofilm dans en temps réel en utilisant un dispositif microfluidique automatisé dans des conditions d’écoulement laminaire. Cette méthode permet l’observation de la formation de biofilm comme le biofilm se développe au fil du temps, en utilisant des conditions personnalisables qui imitent ceux de l’hôte, telles que celles rencontrées dans les cathéters vasculaires. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les défauts de biofilm de mutants génétiques ainsi que les effets inhibiteurs des agents antimicrobiens sur le développement du biofilm en temps réel.

Introduction

Candida albicans est membre commensaux de la flore humaine, mais c’est aussi un pathogène opportuniste, capable de causer des infections fongiques superficielles et sévère^1,2. Un trait majeur de virulence de c. albicans est sa capacité à forme résilient et biofilms résistantes aux médicaments, les communautés de cellules ont adhéré à une surface et enfermé dans une matrice extracellulaire matière^1,3. C. albicans biofilms sont très structurés, contenant plusieurs couches de plusieurs types de cellules (tour de bourgeonnement levure-forme des cellules, cellules pseudohyphes ovales et des cellules des hyphes tubulaires)⁴. C. albicans biofilms développement commence par l’adhérence des cellules de levure-forme ronde à une surface (semis du biofilm), suivie par la prolifération de ces cellules sur la surface, et puis la maturation du biofilm immature structurer dans un complètement formé des biofilms qui sont entouré d’un matériel de matrice extracellulaire⁴. Les biofilms à maturité est principalement composé de cellules des hyphes allongées qui forment des réseaux denses et d’interconnexion, fournissant la stabilité architecturale au biofilm⁴. Tout au long du cycle de vie de biofilm, autour de la levure de bière cellules quittent les biofilms à maturité et peuvent voyager dans d’autres régions du corps pour provoquer la diffusion des infections ou semences nouvelles biofilms autres sites^4,5. C. albicans peuvent former des biofilms sur les surfaces biotiques, telles que des surfaces muqueuses et tout au long des tissus de l’hôte et sur des surfaces abiotiques, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et les prothèses articulaires. En raison des propriétés récalcitrantes des biofilms, ils sont extrêmement difficiles à éradiquer, et dans de nombreux cas la stratégie du seul traitement efficace est la suppression du dispositif infecté⁴. Il est donc crucial d’étudier la formation de biofilm dans des conditions similaires à celles observées en milieu clinique.

Il y a plusieurs critiques en vivo modèles animaux utilisés pour l’étude de c. albicans biofilm formation^6,7,8; Toutefois, ces études peuvent être coûteux et fastidieux et sont limités par le nombre de souches et des agents antimicrobiens qui peuvent être testés à un moment donné. In vitro biofilm dosages, d’autre part, permettre l’évaluation rapide et à haut débit de composés antifongiques et souches mutantes et sont beaucoup plus rentables et éthiques que tests de biofilm transportés hors des animaux modèles^{9, 10,11,12,13,14}. Nous décrivons ici un essai in vitro avec que nous avons développé et optimisé pour observer la formation de biofilm dans le temps sous flux laminaire en utilisant un microfluidique personnalisable appareil^14,15. Le dosage permet la visualisation de chaque étape de la formation de biofilm, y compris l’étape initiale d’adhésion, la prolifération cellulaire, biofilm maturation et dispersion des cellules. L’essai est également utile pour visualiser les modifications de la morphologie cellulaire au cours du développement d’un biofilm.

Plaques de microtitration, qui sont généralement utilisés pour in vitro l’essais de biofilm, tout en haut débit, ne permettent pas pour des conditions d’écoulement contrôlé. Systèmes de piles à flux laminaire traditionnel permettent pour l’évaluation continue de la formation de biofilm dans des conditions d’écoulement contrôlé, mais ceux-ci sont souvent beaucoup de temps pour mettre en place et tendent à avoir limité le débit et contrôle de plage dynamique. Le dispositif microfluidique utilisé ici permet de surmonter ces limitations en combinant les plaques à haut débit (contenant 48 puits) avec une chambre à flux laminaire intégré et est hautement reproductible, polyvalent et personnalisable.

Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisé disponible dans le commerce pour évaluer la formation de biofilm d’une sauvage c. albicans souche, les effets d’un agent antifongique connu sur le développement d’un biofilm et biofilm les défauts de formation dans deux souches mutantes (bcr1Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) qui étaient préalablement déclarées avoir biofilm in vitro et in vivo^16,17,18. Le protocole décrit peut être utilisé pour tester l’efficacité des agents antimicrobiens en inhibant la formation de biofilm au cours du développement d’un biofilm et d’identifier les gènes nécessaires pour le développement du biofilm normale de criblage des bibliothèques mutants.

Protocole

1. préparation de Culture de cellules fongique

NOTE : Culture cellulaire conduite travailler (c'est-à-dire ouvrir les tubes cryogéniques de stock, tubes de culture cellulaire et flacons) dans une armoire de sécurité biologique. Tourner sur l’aux ultraviolets (UV) Lampe germicide au moins 1 h fond de l’armoire avant les travaux et éteignez la lampe UV tout en travaillant activement dans l’armoire. Porter des gants, des lunettes de sécurité et des équipements de protection individuelle appropriés et décontaminer la surface du banc et pipettes avec l’éthanol à 70 % avant le début de l’expérience. Utilisation des embouts de filtration stériles et familiarité avec les techniques microbiologiques aseptiques de base sont recommandés.

1. Souches de c. albicans de strie (sauvage, bcr1 Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) sur levure extrait milieu de dextrose (DPJ) de peptone (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose, pH 6,8) boîtes de gélose. Incuber à 30 ° C pendant 48 h, suivant les pratiques microbiologiques standard¹⁹.
2. Sélectionnez une seule colonie isolée dans la plaque à ensemencer dans 4 mL de milieu liquid YPD (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose, pH 6,8) et incuber à 30 ° C sous agitation à 225 t/mn dans une norme secouant incubateur pendant 12-15 h, prac microbiologique standard suivant tices¹⁹.
3. Déterminer la densité des cellules de la culture en mesurant la densité optique (do) à 600 nm dans une cuvette (1 mL, longueur de chemin d’accès de 1 cm), suivant norme microbiologique pratiques¹⁹.
4. Diluer la culture cellulaire à une finale de l’OD₆₀₀ de 0,5, équivalent à 2 x 10⁷ cellules/mL, dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (contenant de l’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique 165 mM (MOPS), L-Glutamine et sans sodium bicarbonate, pH 7,0) ou araignée support (bouillon de 1 %, 1 % de mannitol, 0,4 % K₂HPO₄, pH 7,2).
   Remarque : Les autres milieux peut être utilisé pour soutenir la croissance spécifique des souches d’intérêt.
   Remarque : Ne pas faire des dilutions de cellule trop longtemps à l’avance. Il est recommandé de commencer les dilutions après l’étape 3.3 (décrit ci-dessous) afin d’empêcher l’ouverture de la formation des hyphes avant les cellules sont ensemencées dans le chenal de Regarde un.

2. préparation des canaux microfluidiques de la plaque de microfluidique

Remarque : Reportez-vous au manuel de l’utilisateur du système microfluidique (voir table des matières) pour plus d’informations sur les plaques et réglage de l’instrument.

1. Avant d’exécuter l’expérience de la microfluidique, chaud 20 mL de milieu RPMI 1640 médias ou Spider dans un incubateur à 37 ° C. Volume média supplémentaire peut être nécessaire, calculée à l’étape 2.8. Médias de préchauffage empêche la formation de bulles d’air pendant l’expérience.
2. Allumez le système microfluidique qui comprend deux blocs d’alimentation, le microscope, le contrôleur, l’appareil photo et ordinateur connecté au système. Ouvrez le logiciel qui contrôle le système (voir la table des matières) dans le menu de programme sur l’ordinateur. Deux fenêtres seront affiche une fois que le programme est ouvert.
3. Repérez le numéro de code à barres de la plaque en cours d’utilisation et introduisez le numéro lorsque vous êtes invité par le logiciel. Deux écrans d’ordinateur distinct permet d’afficher le logiciel sur les deux fenêtres. Guichet unique (module de commande) contienne les contrôles pour la plaque et la deuxième fenêtre (Montage, module d’imagerie) contienne les contrôles pour le microscope et la caméra.
4. Allumez l’interrupteur de chauffage sur le contrôleur et régler la microfluidique température de système à 37 ° C, en utilisant les touches fléchées sur le contrôleur de température.
5. Nettoyer la plaque de jonction (Figure 1) à l’aide de l’eau stérile comme suit. Vaporiser la partie inférieure de la plaque avec de l’eau stérile et utiliser du papier de la lentille pour enlever la saleté/poussière. Reposer la plaque interface l’envers sur du papier lentille propre pour sécher à l’air. Nettoyer la partie supérieure de la plaque de jonction à l’aide de papier isopropanol et l’objectif de 70 %.
   Remarque : La plaque de jonction relie le système microfluidique à la plaque qui contient les cellules et les médias. Veiller à ce qu’aucun liquide ne demeure et que toutes les fibres et la saleté sont supprimés. Mauvais nettoyage peut engendrer dans des vidéos et des images de mauvaise qualité.
6. Retirer les tubes sur la plaque de jonction de condensation.
   1. Laisser le visage de la plaque vers le bas au repos sur le livre de la lentille. Dans le contrôle module fenêtre, cliquez sur le mode manuel pour la plaque. Dans la section menu de cisaillement contrôle, cliquez sur la sélection fluide pour les colonnes 1 à 4 et 5-8, puis 37 ° C dans le menu déroulant. Dans la section contrôle de cisaillement, choisissez le mode de débit constant, puis affectez-lui le cisaillement max 2 dyne/cm² (0,2 Pa) (Figure 2 a).
   2. Cliquez sur les puits d’entrée pour démarrer le flux de l’air stérile à travers les tubes de plaque d’interface pour éliminer la condensation. Après 5 min, cliquez sur le bouton stop dans la section de contrôle de plaque puits (Figure 2 a). Observer les tubes dans la plaque de jonction pour confirmer que toute condensation a été supprimée. Si les gouttelettes sont encore visibles, répétez le flux d’air stérile, comme mentionné ci-dessus, pendant 5 min.
      NOTE : Les tubes d’entrée sont attachés aux filtres 0,22 micron pour s’assurer que de l’air stérile est introduite dans le système microfluidique. Le flux peut être surveillé par le journal des événements sur l’écran dans la fenêtre de module de contrôle.
7. Placer la plaque de microfluidique dyne 0-20 48 puits sur la platine du microscope.

3. Formation de biofilms de candida albicans dans le système microfluidique

1. Pour enregistrer la formation de biofilm, ajoutez 600 µL de préchauffé RPMI 1640 moyen ou support de l’araignée dans les puits d’entrée (voir la Figure 1 pour le schéma). Avoir deux répétitions pour chaque condition expérimentale.
   1. Pour tester la formation de biofilm de c. albicans , sauvage et les souches mutantes, ajoutez 600 µL de milieu de Spider aux puits d’entrée de la plaque d’expérimentation.
   2. Pour tester la formation de biofilm en présence de médicaments antifongiques (ou d’autres composés d’intérêt), ajouter 600 µL de milieu RPMI-1640 à deux puits (témoin négatif) et 600 µL de milieu RPMI 1640 additionné d’amphotéricine B (16 µg/mL) (ou le médicament de choix à désiré concentration) aux deux autres puits d’entrée.
      Remarque : Pour une expérience de formation de biofilm 12 h, ajouter 600 µL de médias préchauffé dans les puits d’entrée. Pour des expériences plus ajouter média supplémentaire (50 µL/h) dans les puits d’entrée. Ne pas dépasser le volume maximal du puits (1 500 µL).
2. Abaissez lentement la plaque de jonction nettoyé sur le dessus de la plaque de 48 puits microfluidiques. Glisser la plaque de jonction légèrement vers la gauche jusqu'à ce que les tubes sur la plaque de l’interphase sont positionnés sur le dessus du puits d’entrée et de sortie.

Tournez le levier sur la plaque de jonction de gauche à droite pour verrouiller la plaque de jonction en position, assurant que l’expérience est étanche à l’air.
NOTE : Les flux d’air stérile des tubes dans la plaque de jonction va pousser le liquide dans les puits d’entrée ou de sortie (selon la direction choisie en utilisant le logiciel sur l’ordinateur), afin que le liquide coule à travers le canal Regarde un entre amont et aval puits dans le sens personnalisé et la vitesse dictée par l’utilisateur.

Dans la section contrôle de cisaillement, choisissez le mode de débit constant, puis affectez-lui le cisaillement max 1 dyne/cm² (0,1 Pa). Cliquez sur les puits d’entrée avec les médias pour commencer le débit des médias de d’entrée aux puits (Figure 2 a) à amorcer le canal de la sortie. Après 5 min cliquer sur le bouton stop dans la section de contrôle de plaque bien. Retirez la plaque de jonction et d’observer les puits de plaque microfluidiques. Après amorçage les chaînes, seulement une petite goutte de médias doit être visible dans les puits de sortie. Si la chute n’est pas visible, amorcer les canaux par incréments de 2 min, jusqu'à ce que la petite goutte de médias dans les puits de sortie n’est visible.
Remarque : L’amorçage est nécessaire pour enlever l’air les canaux Regarde un et s’assurer que les canaux sont remplis de médias souhaités.

Retirer la plaque de jonction de la plaque de la microfluidique et mettre de coté sur une surface stérile. Ajouter 50 µL de culture cellulaire (décrite à l’étape 1.5) sur chaque prise.

1. Pour le test de c. albicans sauvage et les souches mutantes, ajouter 50 µL de culture cellulaire de type sauvage (SC5314) dans les milieux de l’araignée à deux puits de sortie, bcr1 Δ/Δ dans les médias de Spider à deux puits de sortie et efg1 Δ/Δ dans les médias de Spider à deux puits de sortie. Placer la plaque de jonction sur la plaque de la microfluidique et verrouillez le couvercle (voir la Figure 1 pour le schéma).
   Remarque : Comme indiqué au point 3.1.1, tous les puits d’entrée correspondants contiennent des médias Spider.
2. Pour tester la formation de biofilm de c. albicans en présence d’amphotéricine B ou d’autres composés d’intérêt, ajouter 50 µL de culture cellulaire de type sauvage (SC5314) dans un milieu RPMI-1640 à quatre puits de sortie. Placer la plaque de jonction sur la plaque de la microfluidique et verrouillez le couvercle (voir la Figure 1 pour le schéma).
   Remarque : Comme indiqué au point 3.1.2, tous les puits d’entrée correspondants contiennent RPMI 1640 médias avec et sans l’amphotéricine B ou d’autres composés d’intérêt.

Dans la section contrôle de cisaillement, choisissez le mode de débit constant, puis affectez-lui le cisaillement max 2 dyne/cm² (0,2 Pa). Cliquer sur le puits de sortie avec des cellules pour commencer le débit des médias de d’entrée aux puits de sortie (Figure 2 a) à commencer les semis de c. albicans. Après 3 clic s la touche stop dans le contrôle de plaque puits section pour empêcher les cellules dans les puits d’entrée.
Remarque : Les cellules sont transférées depuis les puits de sortie vers les puits d’entrée ; Il est essentiel que la circulation est arrêtée avant les cellules atteignent les puits d’entrée. Cela garantit que les puits d’entrée ne pas être contaminés par culture cellulaire et que les médias dans les puits d’entrée restent stérile pendant la durée de l’expérience. La force de cisaillement et le temps nécessaire dépend de la viscosité du milieu utilisé et la taille des cellules.

Laissez les cellules à rester stationnaire avec aucun des flux (0 dyne/cm²) 10-20 min dans le chenal de Regarde un l’adhérence cellule initiale. Au cours de cette étape de l’adhésion de 10-20 min, configurer l’ordinateur pour capturer les positions de scène caméra et commencer à acquérir des images pré RAS (décrites en détail dans les Sections 4-6).

4. mise en place des Positions de la scène pour l’expérience de la microfluidique

Remarque : Les positions de stade et la calibration de la plaque doivent être réglées juste avant de commencer l’expérience. Cette configuration permet à l’ordinateur stocker les positions de chaque canal Regarde un pour capturer les images pendant l’expérience. La plaque de microfluidic ne doit pas être perturbée après avoir configuré les positions de la scène. Si la plaque est déplacée, les positions de la scène devra être remis à zéro avant le début de l’expérience.

1. Utilisez le logiciel d’analyse de visualisation (voir le tableau des matériaux) pour préparer le terrain des postes ; chaque canal Regarde un est une étape (1-24) (Figure 1) et chaque étape a trois sous-étapes (1-3) pour la capture de l’image à différentes positions le long du canal de Regarde un (Figure 1). Dans la fenêtre de module d’imagerie, ouvrez le module Multi-dimensional « Acquisition » (MDA) en cliquant sur l’onglet MDA (Figure 2 b).
2. Dans le MDA module cliquez sur l’onglet « Stage » dans le menu sur le côté gauche (Figure 2 b). Dans la section étape, charger la liste de maîtres de stage pour la plaque de microfluidique dyne 20 bien 0 - 48. Chaque canal Regarde un devrait avoir trois étapes d’acquisition d’images.
3. Ouvrez le « Échantillon Reload ajustement » (SRA) et le « Move Stage à Position absolue » modules (carte) en cliquant sur les onglets SRA et la carte (Figure 2 b). Dans le module SRA, appuyez sur le bouton de « Live » pour voir un aperçu de l’image avec la ligne de mire.
4. À l’aide de la manette de jeu, positionner la plaque bien tel que la pointe de la flèche (collée sur la plaque) adjacent à la visualisation de channel 4 s’aligne sur la ligne de mire sur le logiciel. Dans le menu de la carte, appuyez sur le bouton « Définir l’origine » (Figure 2 b). La position actuelle devrait maintenant lire 0 à X, Y et Z.
5. Dans le module SRA, cliquez sur la section « Points de référence initiale » dans le menu de gauche (Figure 2 b). Cliquez sur « charger » et charger le fichier pour la plaque de microfluidique dyne 20 bien 0 - 48.
6. Sur la section étape du module MDA, double-cliquez sur ' Position allure 22,2'. Cette position indique au milieu (sous stade 2) de l’affichage numéro 22 de canal. Ceci amènera le microscope Regarde un stade et le focus de la caméra dans une proximité immédiate avec le marqueur de flèche en regardant canal 22. À l’aide de la manette de jeu, positionner la plaque bien tel que la pointe de la flèche (collée sur la plaque) adjacent à la visualisation de canal 22 s’aligne sur la ligne de mire.
7. Copiez la coordonnée Y du module MDA dans la position Y du Point 2 dans l’onglet « Points de référence de mise à jour » du Module SRA (Figure 2 b).
8. Dans l’onglet « Mise à jour étape Positions » de la SRA, cliquez sur « Appliquer à MDA étape liste » (Figure 2 b).
   Remarque : Cela mettra à jour tout affichage de postes de la scène dans la plaque (1-24) à étalonner à la position de la plaque de microfluidique spécifique sur la platine du microscope.

La plaque est maintenant prête pour l’acquisition d’images et utilisera les positions scène calibré pour déplacer tout en capturant des images à partir de trois positions dans tous les 24 Regarde un canaux.

5. mise en place des Acquisitions d’Image Capture pendant l’expérience de microfluidique

1. Dans la fenêtre de module d’imagerie, utiliser le module MDA et cliquez sur l’onglet « Enregistrer » dans le menu de gauche (Figure 2 b). Sélectionnez le nom de fichier pour l’expérience et le dossier pour stocker les images acquises sur l’ordinateur.
2. Dans le module MDA, cliquez sur l’onglet « Timelapse » dans le menu de gauche et réglez-le pour acquérir des images totales 145 ; Définissez le timelapse entre les images à 5 min. Cela se traduira par 1 image toutes les 5 min pour une expérience de développement de biofilm de 12 h.
   NOTE : L’intervalle de temps entre les images et le nombre total d’images peut être réglé selon les conditions expérimentales. Si l’imagerie pendant plus de 12 h, ajouter média supplémentaire dans les puits d’entrée à l’étape 3.1 afin de s’assurer que les puits n’exécutent pas secs. Pour des expériences plus ajouter un média supplémentaire, selon les besoins (50 µL/h) dans les puits d’entrée.
3. Dans le module MDA, cliquez sur l’onglet « longueurs d’onde » dans le menu de gauche (Figure 2 b) et définissez le nombre de longueur d’onde pour l’expérience 1. Sélectionner la longueur d’onde pour saisir à 50 % fond clair et 50 % appareil photo avec un temps de pose de 12-20 ms, gain de 0,6 et numériseur de 20 MHz.
   Remarque : Autres longueurs d’onde peuvent être utilisés, y compris les longueurs d’onde pour l’imagerie de fluorescence (par exemple, nous avons visualisé avec succès mCherry et souches GFP Taggé c. albicans à l’aide de ce dispositif microfluidique). Les paramètres d’acquisition aussi peuvent être modifiées selon les conditions expérimentales. Par exemple, mise en place d’une seconde longueur d’onde et en sélectionnant « Autofocus à chaque validant » et une longueur d’onde en troisième et en sélectionnant « Exposition automatique à chaque validant » est recommandé pour les débutants afin de maximiser les occasions d’acquisition image qui sont en discussion.
4. Dans le module MDA, sélectionnez les onglets scène de la liste dans le menu de gauche. Stades 1,1 – 24,3 s’affichera. Un par un, cliquez sur chaque étape et utilisez les paramètres de mise au point fine pour la mise au point manuelle sur les cellules dans le chenal de Regarde un pour chaque étape. Une fois le champ de vision focalisée, cliquez sur la flèche noire à côté de la liste de l’étape à jour et enregistrer les paramètres pour chaque étape. L’ordinateur utilisera ces paramètres situation définie manuellement et focale pour acquérir des images à chaque instant. Supprimer des étapes non utilisés dans la liste à l’aide de la flèche « Supprimer ».
   Remarque : Le module MDA et le programme se référer à l’affichage des canaux pour des stages de façon interchangeable, et la même terminologie est utilisée par le logiciel.

6. exécution de l’expérience de microfluidique

1. Dans la fenêtre de module d’imagerie, en utilisant le module MDA, sélectionnez « Acquérir » pour commencer à capturer des images pré RAS de cellules adhérentes pour toutes les sous-étapes (Figure 2 b).
   Remarque : La fenêtre de module d’imagerie et les contrôles de caméra montrera en maintenant les images sont capturées et le module de carte, SRA et MDA ne seront plus visible. Les images capturées affiche également un timer sur le côté, pour indiquer le nombre d’image étant capturé et du temps écoulé avant que le prochain cycle de capture d’image commence. Attendre pour un tour d’images à capturer avant de procéder à l’étape suivante.
   Remarque : Ne pas utiliser les boutons « Pause » ou « Mark Event » sur l’écran de fenêtre de module d’imagerie. Partir de ce moment pendant l’expérience, maintenez la souris sur la fenêtre de module de contrôle sur le deuxième écran de l’ordinateur (Figure 2 a). Ceci est important pour ne pas perturber la fenêtre de module d’imagerie.
2. Dans le module de contrôle fenêtre le séjour sur le mode manuel pour la plaque. Dans la section contrôle de cisaillement, choisissez le mode de débit constant, puis affectez-lui le cisaillement max 1 dyne/cm² (0,1 Pa). Cliquer sur le puits de sortie O1, O7, O13 et O19 pour commencer le débit des médias de d’entrée aux puits de sortie (Figure 2 a) pour éliminer les cellules non-respecté. Après 5 min cliquer sur le bouton stop dans la section de contrôle de plaque bien. Prévoir une deuxième série d’images à acquérir. Des images peuvent être visualisées et le laps de temps peut être surveillé sur le deuxième écran dans la fenêtre de module d’imagerie.
3. Dans la section contrôle de cisaillement, ajuster le flux de cisaillement maximum à 0,5 dyne/cm² (0,5 Pa) en cliquant sur le numéro dans le max de cisaillement colonne et en utilisant le clavier pour entrer les 0,5. Appuyez sur la touche entrée du clavier et de confirmer le changement de débit dans le journal des événements dans la fenêtre de module de contrôle (Figure 2 a). L’expérience de la laisser reposer dans l’obscurité pendant 12 h.
   NOTE : Exposition à la lumière et le mouvement/vibrations peuvent réduire gravement la qualité des images acquises tout au long de l’expérience. À la fin de l’expérience de la microfluidique, la fenêtre de module d’imagerie n’affichera pas toutes les images et revient à montrer les modules SRA, carte et MDA. Le logiciel d’imagerie de module peut servir à afficher les images, assembler les vidéos et quantifier les biofilms formé (décrits ci-dessous).

7. analyse des résultats

1. Dans la fenêtre de module d’imagerie, sélectionnez l’onglet « Outils d’analyse » et cliquez sur « Données Multi-dimensional Review » (MDM) dans le menu déroulant dans le menu déroulant. Dans le module de MDM, cliquez sur « Sélectionner le fichier de Base ». Cela ouvrira la fenêtre « Multi-dimensional Data Set Utilities ».
2. Cliquez sur le bouton « Sélectionner le répertoire » et choisissez le dossier qui a été utilisé pour enregistrer l’expérience à l’étape 5.1. Dans la liste des « Ensembles de données », sélectionnez le journal de fichier experiment (extension séchageUV). Une fois que le journal est chargé, cliquez sur le bouton « view ».
3. Sélectionner la longueur d’onde en cliquant sur options dans le menu de gauche « Longueurs d’onde » et choisissez la position scène pour afficher dans un menu déroulant. Choisissez l’image à charger des nombres en haut du module en cliquant droit sur le nombre d’image. Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton « load image » pour charger les images. Vous pouvez afficher une seule image ou toutes les images à la fois.
4. Sélectionnez toutes les images pour faire un laps de temps vidéo. Les images sélectionnées seront ouvre comme une vidéo dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur l’onglet « fichier » dans la fenêtre de module d’imagerie et choisissez « Enregistrer sous » dans le menu déroulant. Enregistrer la vidéo par défaut le fichier (TIFF/MetaSeries).
5. Ouvrir et charger le fichier vidéo enregistré à l’aide de logiciels ImageJ. Dans ImageJ, cliquez sur l’onglet « fichier » et cliquez sur « Enregistrer sous ». Choisissez « .avi » dans le menu déroulant et convertir le fichier dans un fichier .avi à l’aide de la conversion de JPEG réglé à 10 images/s.
   Remarque : La vitesse de la vidéo peut être réglée en modifiant les images/s.
6. Afin de quantifier les biofilms, répétez les étapes 7.2, 7.3 et 7.4.

Choisir la dernière image (numéro 144) et cliquez sur le bouton « load image » pour charger l’image. L’image s’ouvrira dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur le bouton « image de seuil » et sélectionnez « Inclusive » seuil. Déplacez le curseur jusqu'à ce que les biofilms de cellules sont de couleur rouge, et les régions où aucune cellule ne sont pas colorées.

Cliquez sur le bouton « Open Log » pour enregistrer les mesures (le bouton affichera « Open Log » seulement au départ, une fois qu’un journal est actif le bouton sera renommé "F9 : Log Data"). Dans la fenêtre « Open Data Log » sélectionnez « Échange dynamique de données » et cliquez sur « OK ».

Dans la fenêtre de module d’imagerie, sélectionnez l’onglet « Outils d’analyse » et cliquez sur « Afficher les statistiques de région ». Ceci ouvrira une nouvelle fenêtre affichant des mensurations de l’image. Sélectionnez « Image entière » dans les options de « Mesure » disponibles, puis cliquez sur "F9 : données du journal. » Un fichier excel avec toutes les mesures s’affichera. Localiser les valeurs de « Espace » et « Zone seuillée » et diviser ce dernier par l’ancien afin d’obtenir une valeur numérique pour la zone occupée par le biofilm.
Remarque : Le « espace » pour chaque image obtenue au cours de l’expérience est identique et donc la mesure de la « Zone seuillée » peut être utilisée pour évaluer les différences dans la formation de biofilm entre les souches sauvages et les souches mutantes ou évaluer l’efficacité de la médicaments testés sur la formation de biofilm.

Résultats

Nous avons effectué le test de biofilm microfluidique décrit ici en utilisant un type sauvage souche de c. albicans dans des conditions de deux milieux (RPMI-1640 et Spider média), la souche sauvage en présence de la drogue connue antifongique amphotéricine B (16 µg/mL) en milieu RPMI, et deux souches mutantes déjà signalé avoir un vice dans la formation de biofilm (bcr1Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) dans les milieux de l’araignée.

Discussion

Le dosage de biofilm microfluidique personnalisable décrit ici permet la visualisation de la formation de biofilm dans en temps réel à un niveau de cellule unique lorsqu’il est exposé à un taux fixe à flux laminaire et une température constante. Il constitue un moyen puissant pour étudier le développement des biofilms dans sauvage et les souches mutantes, et les effets des traitements d’agent antimicrobien sur les biofilms dans des conditions qui simulent les conditions physiologiques observés en milieu cli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioFlux 1000z	Fluxion		Automated microfluidic device for live cell analysis
48-well plate 0-20 dyne	Fluxion	910-0047	Microfluidic plate
Montage Software	Fluxion	Version 7.8.4.0	Visualization analysis software
ImageJ Software	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Yeast Extract	Criterion	C7341
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific	D163
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P285-500
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Nutrient Broth	Criterion	C6471
Difco D-Mannitol	BD Biosciences	217020
Agar	Criterion	C5001
Amphotericin B	Corning	30-003-CF
Sterile Inoculating Loops	VWR	30002-094
Petri Dishes with Clear Lid	Fisher Scientific	FB0875712
Disposable Cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Lens Paper	VWR	52846-001
Microplate and Cuvette Spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC
Shaking Incubator	Eppendorf	M12820004